Verwendung des Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Modells zur Untersuchung gynäkologischer und urologischer Krebsarten

Mäuse haben als klassischer Modellorganismus für die Erforschung menschlicher Krankheiten, einschließlich Malignität, gedient. Als Säugetiere haben sie viele Gemeinsamkeiten mit menschenverachten. Ihr hoher Grad an genetischer Ähnlichkeit hat die transgene Manipulation des Mausgenoms ermöglicht, um einen enormen Einblick in die genetische Kontrolle menschlicher Krankheiten zu geben¹. Umfangreiche Erfahrungen im Umgang mit und Experimentieren mit Mäusen haben dazu geführt, dass sie das Modell der Wahl für die biomedizinische Forschung sind. Jedoch, zusätzlich zu den ethischen und wissenschaftlichen Bedenken in Bezug auf murine Modelle, können sie auch ziemlich teuer und zeitaufwändig^{sein 2,3}. Die Entwicklung von Tumoren kann Wochen oder sogar Monate dauern. Das Gehäuse in einer typischen Institution allein kann in den Hunderten bis Tausenden von Dollar laufen, während Tumore entwickeln. Eierstockkrebs ist ein Beispiel für diesen Nachteil, da sein Wachstum in murinen Modellen leicht Monate dauern kann. Verzögerungen im Forschungsfortschritt wirken sich potenziell auf die anhaltend niedrige 5-Jahres-Überlebensrate von nur 47 % bei Eierstockkrebspatienten aus (d. h. eine Überlebenssteigerung von nur 10 % über 30 Jahre)⁴. In ähnlicher Weise machen urologische Krebserkrankungen (Nieren-, Prostata- und Blasenkrebs) 19 % aller Krebsfälle in den Vereinigten Staaten und 11 % der krebsbedingten Todesfälle^{aus 4}. So könnte ein neuartiger In-vivo-Ansatz zur Untersuchung gynäkologischer und urologischer Krebserkrankungen einem Labor viel Zeit, Arbeit und Geld ersparen, auch wenn dieses Modell nur auf erste Screening-Experimente angewendet wird. Darüber hinaus könnte die daraus resultierende Beschleunigung der Forschungsergebnisse die 177.000 Personen, bei denen diese Krebserkrankungen diagnostiziert werden, signifikant beeinflussen.

Das Huhn CAM-Modell bietet viele Vorteile, die die oben genannten Probleme adressieren. Ein beliebtes Modell zur Untersuchung der Angiogenese^5,6, Tumorzellinvasion^7,8, und Metastasierung^7,9, das Küken Embryo CAM-Modell wurde bereits verwendet, um viele Formen von Krebs zu studieren, einschließlich Gliom^10,11,12, Kopf und Hals Plattenepithelkarzinom^13,14, Leukämie^15,16, Bauchspeicheldrüsenkrebs¹⁷, und Darmkrebs¹⁸. Zusätzlich wurden CAM-Modelle für Neuroblastom¹⁹, Burkitt-Lymphom²⁰, Melanom²¹und Katzenfibrosarkom²²" generiert. Frühere Studien haben auch Die Transplantation von Blasenkrebs²³ und Prostatakrebs-Zelllinien²⁴, aber mit begrenzten Protokolldetails vorgestellt. Eier sind nicht nur viel billiger als Mäuse, sondern produzieren auch hochreproduzierbare Ergebnisse^25,26. Sie zeigen eine schnelle Vaskulaturentwicklung, und Tumorengraftment kann in so schnell wie ein paar Tagen auftreten und längs durch das offene Fenster visualisiert werden. Mit dem 21-Tage-Zeitrahmen zwischen Eibefruchtung und Schlüpfen können Experimente innerhalb weniger Wochen abgeschlossen werden. Darüber hinaus ermöglichen der niedrige Kostenbedarf, der begrenzte Wohnungsbedarf und die geringe Größe problemlos groß angelegte Experimente, die für Mausstudien unerschwinglich wären.

Daher wollten wir das CAM-Modell für die Transplantation gynäkologischer und urologischer Krebserkrankungen optimieren. Aufgrund des immungeschwächten Status des frühen Hühnerembryons²⁷können sowohl Maus- als auch menschliche Zellen problemlos implantiert werden. Als solche haben wir erfolgreich Eierstock-, Nieren-, Prostata- und Blasenkrebs transplantiert. Für jeden dieser Tumortypen akzeptiert das CAM leicht etablierte murine und/oder menschliche Tumorzelllinien. Wichtig ist, dass frisch geerntete primäre menschliche Tumorgewebe auch aus verdauten Zellen oder Stücken festen Gewebes mit hohen Erfolgsraten einwandern können. Jede dieser Krebsarten und Zellquellen erfordert eine Optimierung, die wir hier teilen.

Alle hier vorgestellten Experimente wurden von den zuständigen Ethikkommissionen der University of California, Los Angeles (UCLA) überprüft und genehmigt. Die Verwendung von deidentifizierten, primären menschlichen Tumoren wurde vom UCLA Institutional Review Board genehmigt (Protokollnummern 17-000037, 17-001169 und 11-001363). An der UCLA ist für Versuche mit Hühnerembryonen keine Überprüfung durch den Tierforschungsausschuss erforderlich; Eine Protokollgenehmigung ist nur erforderlich, wenn die Eier geschlüpft sind. Bewährte Verfahren wie die AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren wurden jedoch verwendet, um Hühnerembryonen ethisch zu behandeln und Schmerzen so weit wie möglich zu vermeiden. Die Forscher werden dringend gebeten, die Aufsichtsanforderungen an ihrer Institution zu überprüfen, bevor sie Studien mit CAM-Modellen in itadienieren.

1. Vorbereitung der Eier

1. Vor dem Empfang der Eier den Eierbrutkasten auf 37,8 °C (100 °F) mit 60-70% Luftfeuchtigkeit nach den Anweisungen des Herstellers montieren und ausdemieren.
   HINWEIS: Um Kontaminationsrisiken zu minimieren, kann autoklaviertes Wasser verwendet werden, um die Feuchtigkeit zu kontrollieren.
2. Nach Erhalt der Befruchtung, Rhode Island Rote Hühnereier von einem zertifizierten Labor-Qualität Ei Lieferant, trocken wischen Sie die Oberfläche der Schalen mit Papiertüchern. Ein leicht gedämpftes Papiertuch kann verwendet werden, um aufhaftendes Material zu entfernen. Sofort trocknen.
   HINWEIS: Das Benetzen der Schale mit Flüssigkeit unter 43,3 °C kann Bakterien in das Ei einbringen. Wenn man sich entscheidet, die Eier zu waschen oder zu desinfizieren, muss die Temperatur der Flüssigkeit zwischen 43,3-48,9 °C liegen. Höhere Temperaturen können die Eier kochen. Die Wahl des Desinfektionsmittels sollte auf der Grundlage der besorgniserregenden Mikroorganismen getroffen werden.
3. Verwenden Sie einen Bleistift oder Marker, um das Datum auf dem Ei zu beschriften. Dies gilt als Entwicklungstag 0.
4. Legen Sie die Eier in den Eierbrutkasten und brüten Sie mindestens 7 Tage mit Rotation, um die CAM-Entwicklung zu ermöglichen. Es kann ein automatischer Rotator verwendet werden, oder die Eier können um 180° 2-3x pro Tag gedreht werden.

2. Öffnen der Eier

HINWEIS: Das Öffnen der Eier sollte erfolgen, wenn das CAM vollständig entwickelt ist. Dies ist in der Regel am Entwicklungstag 7 oder 8.

1. Desinfizieren Sie einen Biosicherheitsschrank mit 70% Ethanol. Ebenso desinfizieren und in den Biosicherheitsschrank ein Eierregal, Eierkübel, Marker, Akku-Drehwerkzeug mit Siliziumkarbid-Schleifstein und rundgeschnittenem Schneidrad, 18 G Nadel, Pipettenregler mit Viertel-Zoll-Vakuumschlauch, Verpackungsband, Büro Schere, gebogene Schere, Semken (oder ähnliche) Zangen, Baumwollkugeln und 6 x 7 cm transparenter Filmverband. Verwenden Sie nach Möglichkeit sterile, Einweg- oder Autoklavierwerkzeuge.
2. Schalten Sie den Eirotator aus. Ca. 1-3 Eier in den Biosicherheitsschrank auf dem Eierregal legen. Legen Sie im Dunkeln den Eierkantoler gegen die Eierschale, um die Luftzelle zu identifizieren. Markieren Sie die Position der Luftzelle.
   HINWEIS: Die Intensität der Beleuchtung aus dem Ei candler ist entscheidend für die Visualisierung des Inneren des Eis. Wenn die Luftzelle oder Vaskulatur durchweg schwer zu erkennen ist, versuchen Sie, die Eizellen zu ersetzen.
3. Bewegen Sie das Ei candler über die Schale, um ein großes Blutgefäßnetz zu finden. Drehen Sie das Ei, wenn nötig. Eine ideale Vaskulatur wird in der Nähe der Mitte des Eis verzweigen. Verwenden Sie einen Marker, um über die Vaskulatur zu zeichnen, die für die Implantation verwendet werden soll.
4. Schalten Sie das Licht in der Motorhaube ein. Mit einem schnurlosen Drehwerkzeug, das mit einem Siliziumkarbid-Schleifstein ausgestattet ist, bohren Sie ein kleines Loch in der Schale direkt über die Mitte der Luftzelle. Bohren, bis der größte Teil der Schale entfernt wurde, aber die weiße, innere Membran ist intakt.
   HINWEIS: Das Bohren über die Luftzelle vor dem Ziel der Vaskulatur ermöglicht die Bestimmung der Dicke dieser bestimmten Eierschale über der Luftzelle und nicht über das CAM und die Gefäße. Wenn das CAM oder die Vaskulatur gestört ist, ist das Ei nicht für die Implantation verwendbar.
5. Bohren und öffnen Sie ein weiteres kleines Loch, in dem das Gefäßfenster geöffnet wird, wie es für die Luftzelle getan wurde (Schritt 2.4).
6. Mit einer 18 G Nadel durchbohren Sie sanft die weiße, innere Membran über die Luftzelle und die Gefäße. Wenn nicht in der Lage, die Schale zu durchdringen, dann sorgfältig ein wenig mehr bohren. Stellen Sie sicher, dass die weiße, innere Membran (aber nicht das CAM) während des gesamten Gebohrbereichs gestört ist. Eine Entfernung des Membranstücks ist nicht erforderlich.
   HINWEIS: Wenn die CAM oder Vaskulatur während dieses Schritts gestört ist, entsorgen Sie das Ei. Schäden sind offensichtlich, wenn Blut oder Albumin aus einem bohrenden Loch austritt.
7. Schalten Sie das Kapuzenlicht aus. Überprüfen Sie mit dem Eierkantoler, ob die Luftzelle vom Ende des Eis in den Bereich über die Gefäße übertragen wurde. Legen Sie bei Bedarf den Vakuumschlauch, der in einen Pipettenregler um das Loch um die ursprüngliche Luftzelle eingelegt wird, und wenden Sie die Saugung in kurzen Berstungen sanft an, um die Luftzelle zu bewegen.
8. Verwenden Sie einen Marker, um die neue Position der Luftzelle etwa 0,5 cm innerhalb der Luft-CAM-Grenze zu skizzieren. Befestigen Sie ein Stück Packband direkt über der neuen Luftzelle. Verwenden Sie bei Bedarf eine Standard-Büroschere, um das Band auf eine entsprechende Größe zu trimmen.
   HINWEIS: Das Band kann den Luftstrom durch die Schale stören und sollte nicht größer als nötig sein, um die Luftzelle vollständig zu bedecken.
9. Bringen Sie die Eier zum Brutkasten zurück, um sich ohne Rotation mit der neuen Luftzelle nach oben zu erwärmen. Wiederholen Sie die Schritte 2.2-2.9, damit die restlichen Eier geöffnet werden.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Wenn sie sich der Qualität der CAM-Entwicklung nicht sicher ist, sollte eine kleine Anzahl von Eiern Schritt 2.16 durchlaufen, bevor die verbleibenden Eier geöffnet werden.
10. Ca. 1-3 Eier mit verlegten Luftzellen auf das Eierregal im Biosicherheitsschrank legen.
    HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass keine Kontamination in das geöffnete Ei eingeführt wird. Öffnen Sie daher immer Eier in einem Biosicherheitsschrank und verwenden Sie nach Möglichkeit sterile Werkzeuge und Geräte.
11. Schneiden Sie mit einem schnurlosen Drehwerkzeug, das mit einem kreisförmigen Schneidrad ausgestattet ist, eine kleine Linie über die in Schritt 2.8 gezogene Luftzellengrenze. Stellen Sie sicher, dass dies ca. 0,5 cm innerhalb der tatsächlichen Luft-CAM-Grenze liegt, um eine Störung des CAM oder der Gefäße zu vermeiden. Schneiden Sie vollständig durch die Schale, aber achten Sie darauf, nicht tief genug zu durchdringen, um die CAM oder Vaskulatur zu stören.
12. Schneiden Sie mit einer gekrümmten Schere die verbleibende Luftzelle um, um ein Fenster in der Schale zu erstellen.
    HINWEIS: Wenn Blut oder Membran auf der entfernten Schale vorhanden ist, ist das Ei nicht für die Implantation geeignet. Wenn ein hoher Teil der Eier nicht sauber geöffnet wird, sollten Sie mindestens 1 zusätzlichen Tag warten, um die verbleibenden Eier zu öffnen, um eine bessere CAM-Bildung zu ermöglichen. Wenn die Schalen der verbleibenden Eier nicht durchbohrt wurden, sollte die Rotation der Eier innerhalb des Brutkastens wieder aufgenommen werden.
13. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit des Embryos. Lebensfähige Embryonen zeigen eine umfangreiche Vaskulatur, klares Albumin, Embryobewegung oder einen sichtbaren Herzschlag.
14. Mit Semken-Zangen, ziehen Sie kleine Stücke Baumwolle aus einer sterilen Baumwollkugel. Bimmern Sie die CAM-Oberfläche vorsichtig, um den Staub und die Trümmer der Schale zu entfernen.
    HINWEIS: Die Beseitigung der Trümmer muss am selben Tag erfolgen, an dem die Eier geöffnet werden.
15. Bedecken Sie die Schalenöffnung mit einem Viertelstück von 6 x 7 cm transparentem Filmdressing.
16. Die Eier in den Brutkasten zurückbringen. Stellen Sie sicher, dass das Ei sicher sitzt, wobei das geöffnete Fenster nach oben zeigt und das CAM das transparente Foliendressing nicht berührt. Verwenden Sie ein Stück Eierregal, den Rand des Eierrotators oder ein anderes geeignetes Element, um alle Eier zu stützen, die weiterrollen.
17. Wiederholen Sie die Schritte 2.10-2.16, damit alle verbleibenden Eier geöffnet werden.
    HINWEIS: Das Öffnen der Eier muss nicht am selben Tag wie die Implantation abgeschlossen werden. Das Warten von mindestens 1 Tag kann helfen, Eier zu beseitigen, deren Lebensfähigkeit durch das Öffnen der Schale beeinträchtigt wurde.

3. Vorbereitung der Krebszellsuspension für die Transplantation (Option 1)

HINWEIS: Dies ist kurz vor der Implantation abzuschließen, die idealerweise zwischen den Tagen 7 und 10 stattfinden sollte. Weitere Informationen zum Implantationsdatum finden Sie zu Beginn von Schritt 5 oder 6. Dieser Ansatz wurde für alle Zelllinien und kultivierten Nierenkrebs Tumor Digests verwendet.

1. Die extrazelluläre Matrixlösung auf Eis auftauen.
2. Mit mechanischer und/oder enzymatischer Verdauung erhalten Sie eine Einzelzellsuspension nach einer Methode, die für den implantierten Zelltyp geeignet ist.
3. Setzen Sie die Gesamtzahl der Zellen aus, die in ein geeignetes Medium für die Implantation implantiert werden sollen. Implantate von 1-2 x 10⁶ Zellen pro Ei sind typisch.
   HINWEIS: Das Medium, das für die Implantation der Zelllinien verwendet wird, ist in der Regel das vollständige Medium, das für die Kultivierung der Zellen verwendet wird und FBS oder Serumersatz enthält. Die Implantation von Tumor-Digests verwendet in der Regel das komplette Medium für die Kultivierung von Zelllinien des gleichen Krebstyps verwendet. Bei Bedarf können jedoch bei Bedarf Experimentell Anpassungen vorgenommen werden. Die Auswirkungen auf Tumorentwicklung und -wachstum müssten empirisch bestimmt werden.
4. Pellet die Zellen mit einer Zentrifugengeschwindigkeit und Zeit, die für die verwendeten Zellen geeignet ist. Typische Geschwindigkeiten sind 250-300 x g,und die Zeiten sind 5-10 min.
5. Entfernen Sie den Überstand aus den pelletierten Zellen durch Pipettieren. Mechanisch die Zellen im Restmedium durch Flicken oder Pipetieren wieder aussetzen. Auf Eis zum Abkühlen geben. Messen Sie das Volumen von Zellen und Medium mit einer entsprechend großen Pipette.
6. Berechnen Sie implantationsvolumen so, dass 1-2 x 10⁶ Zellen in einem Volumen von 20-100 l pro Ei mit einer endgültigen extrazellulären Matrixkonzentration von 2,7-4 mg/ml Protein implantiert werden. Fügen Sie Medium, alle gewünschten Wachstumsfaktoren oder Additive und extrazelluläre Matrixlösung nach dieser Berechnung hinzu. Auf Eis halten, bis sie zum Implantaten bereit sind.
   HINWEIS: Für die Berechnungen in den Schritten 3.3 und 3.6 sollte ein zusätzliches Volumen von mindestens einer Hälfte des Eiimplantes aufgenommen werden, um ein ausreichendes Volumen für alle Eier in der Gruppe zu gewährleisten. Für die Implantation der Eierstockkrebszelllinien (d.h. SKOV3 und ID8) wurden 10⁶ Zellen pro Ei implantiert. Für die Implantation der Nierenzellkarzinomlinie RENCA, kultivierte Zellen aus verdautem primären menschlichen Nierenzellkarzinom, Prostatakrebszelllinien (d. h. CWR, C4-2 und MyC-CaP) und Blasenkrebszelllinien (d. h. HT-1376 und T24), wurden 2 x 10⁶ Zellen implantiert.

4. Vorbereitung von Tumorstücken für die Implantation (Option 2)

HINWEIS: Dies ist kurz vor der Implantation abzuschließen, die idealerweise zwischen den Tagen 7 und 10 stattfinden sollte. Weitere Informationen zum Implantationsdatum finden Sie zu Beginn von Schritt 5 oder 6. Primäre Eierstock- und Blasenkrebswurden als Tumorstücke implantiert.

1. Extrazelluläre Matrixlösung auf Eis auftauen. Auf eine endgültige Proteinkonzentration von 2,7-4 mg/ml in einem geeigneten Medium mit allen gewünschten Wachstumsfaktoren oder Zusatzstoffen verdünnt. Auf Eis bleiben.
   HINWEIS: Bei der Implantation von Tumorstücken wird in der Regel das gesamte Medium verwendet, das für die Kultivierung von Zelllinien desselben Krebstyps verwendet wird. Bei Bedarf kann jedoch bei Bedarf experimentell an der Mediumformulierung angepasst werden. Die Auswirkungen auf Tumorengraftment und Wachstum müssten empirisch bestimmt werden.
2. Mit einem Skalpell oder einer Schere, VerbrauchStücke aus dem frischen Tumor. Ideale Größen reichen von 2-5 mm auf jeder Seite. Gewebe im Medium eingetaucht halten, bis es implantiert ist.

5. Implantation mit einem Antihaftring (Option 1)

HINWEIS: Zellen können ab dem Entwicklungstag 7 implantiert werden, wenn das CAM vollständig entwickelt ist. Implantation kann jederzeit vor dem Schlüpfen auftreten, die genügend Zeit für die Tumorentwicklung und das gewünschte Experiment zulässt, aber beachten Sie, dass die Immunzellen des Embryos beginnen, um Tag 10 Nachbefruchtung²⁷vorhanden zu sein. Die Tumorwachstumsrate variiert erheblich je nach Zelltyp und muss empirisch für die Zellart bestimmt werden. Der Eierstockkrebs und die Prostatakrebszellen wurden mit der Antihaftring-Methode implantiert. Beachten Sie, dass, wenn ein Antihaftring nicht verfügbar ist, eine Pipettenspitze auf eine ähnliche Größe geschnitten und verwendet werden kann.

1. Verwenden Sie 70% Ethanol, um einen Biosicherheitsschrank und alle erforderlichen Werkzeuge zu desinfizieren: ein Eiergestell, gekrümmte Iriszange, Antihaftringe (1/4 Zoll Innendurchmesser), Glasrührstab, entsprechende Volumenpipetten und Spitzen, 6 x 7 cm transparenter Folienverband, Büroschere und Marker oder Bleistift. Wann immer möglich, sollten sterile, Einweg- oder Autoklavierwerkzeuge verwendet werden.
2. Legen Sie Eier, die auf ein Eiregal implantiert werden, in einen Biosicherheitsschrank. Wählen Sie eine überschaubare Anzahl von Eiern aus. Bis zu sechs sind typisch. Vermeiden Sie es, die Eier während der Arbeit mit ihnen wesentlich abkühlen zu lassen.
3. Entfernen Sie den transparenten Folienverband von der Schale, indem Sie die Kanten in Richtung des geöffneten Fensters rollen, um zu vermeiden, dass Schalenstücke weggezogen werden. Überprüfen Sie, ob die Eier lebensfähig und gesund sind. Ideale Eier haben ein großes Gefäß in der Mitte des geöffneten Bereichs mit kleineren Gefäßen, die von ihm verzweigen.
4. Mit gebogenen Iriszangen legen Sie einen sterilen, antihaften Ring über dem Gefäß auf das CAM, idealerweise über einen Astpunkt. Verwenden Sie eine sterile Glasrührstange, um das CAM sanft abzutragen.
5. Pipetdieren Sie die Zellsuspension von Schritt 3.6 in die Mitte des Antihaftrings. Alternativ können Sie ein Tumorstück aus Schritt 4.2 in die Mitte des Antihaftrings legen und mit 20-50 l der in Schritt 4.1 erzeugten extrazellulären Matrixlösung abdecken.
6. Versiegeln Sie die Öffnung mit einem Viertelstück von 6 x 7 cm transparentem Filmdressing. Kennzeichnen Sie die Eier mit einer geeigneten Implantatbezeichnung.
   HINWEIS: Die Nummerierung der Eier innerhalb einer Gruppe erleichtert Längsbeobachtungen.
7. Das Ei in den Brutkasten zurückbringen. Stellen Sie sicher, dass das Öffnen der Schale aufrecht sitzt und das Ei sicher ist.
   HINWEIS: Eier können ohne Rotation an einen Eierbrutkasten zurückgegeben werden. Alternativ kann eine hohe Postimplantationslebensfähigkeit mit einem 37-38 °C Zellinkubator mit deaktiviertem_CO2 und einem Hygrometer zur Überwachung der Luftfeuchtigkeit erreicht werden, die 50%-80% betragen sollte.

6. Implantation ohne Antihaftring (Option 2)

HINWEIS: Zellen können ab dem Entwicklungstag 7 implantiert werden, wenn das CAM vollständig entwickelt ist. Implantation kann jederzeit vor dem Schlüpfen auftreten, die genügend Zeit für die Tumorentwicklung und das gewünschte Experiment zulässt, aber beachten Sie, dass die Immunzellen des Embryos beginnen, um Tag 10 Nachbefruchtung²⁷vorhanden zu sein. Diese Methode wurde zur Implantation der Nierenzellkarzinomzellen und der Blasenkrebszellen verwendet.

1. Verwenden Sie 70% Ethanol, um einen Biosicherheitsschrank und alle erforderlichen Werkzeuge zu desinfizieren: geeignete Volumenpipetten und -spitzen, sterile 10-cm-Gewebekulturgeschirr, Eierregal, 6 x 7 cm transparentes Foliendressing, Büroschere und Marker.
2. Aspirieren Sie ein Impfvolumen der in Schritt 3.6 erzeugten Zellsuspension in eine entsprechend dimensionierte Pipettenspitze (200 l ist typisch). Während Sie den oberen Teil der Spitze halten, die Pipettenspitze vorsichtig auswerfen und horizontal in eine sterile, 10 cm große Gewebekulturschale legen.
3. Wiederholen Sie Schritt 6.2 für alle Proben innerhalb einer Gruppe mit einer Schale für jede Gruppe.
4. Legen Sie die Spitzen für 15-30 min in einen 37 °C-Inkubator, damit die extrazelluläre Matrix teilweise polymerisiert werden kann.
5. Nach 15 min Inkubation, beginnen Sie mit der Überprüfung auf Polymerisation. Eine kleine Menge Flüssigkeit tritt in der Regel aus der Spitze, wenn sie auf die Schale gelegt. Die Polymerisation dieser Flüssigkeit kann verwendet werden, um das Ausmaß der Polymerisation der Flüssigkeit innerhalb der Spitze abzuschätzen.
6. Legen Sie die Eier, die auf ein Eiregal implantiert werden sollen, in einen Biosicherheitsschrank. Wählen Sie eine überschaubare Anzahl von Eiern aus. Bis zu sechs sind typisch. Vermeiden Sie es, die Eier während der Arbeit mit ihnen wesentlich abkühlen zu lassen.
7. Entfernen Sie den transparenten Folienverband von der Schale, indem Sie die Kanten in Richtung des geöffneten Fensters rollen. Dadurch wird vermieden, Schalenstücke wegzuziehen.
8. Überprüfen Sie, ob die Eier lebensfähig und gesund sind. Ideale Eier haben ein großes Gefäß in der Mitte des geöffneten Bereichs mit kleineren Gefäßen, die von ihm verzweigen.
9. Legen Sie eine Pipettenspitze auf eine entsprechend große Pipette. Drücken Sie den Kolben, um die teilweise polymerisierte Zellsuspension über ein großes, gut entwickeltes Gefäß, idealerweise über einen Astpunkt, auf das CAM zu drücken.
10. Versiegeln Sie die Öffnung mit einem Viertelstück von 6 x 7 cm transparentem Filmdressing.
11. Etikettieren Sie das Ei mit einer entsprechenden Implantatbezeichnung.
    HINWEIS: Die Nummerierung der Eier innerhalb einer Gruppe erleichtert Längsbeobachtungen.
12. Das Ei in den Brutkasten zurückbringen. Stellen Sie sicher, dass das Öffnen der Schale aufrecht sitzt und das Ei sicher ist.
    HINWEIS: Eier können ohne Rotation an einen speziellen Eierbrutkasten zurückgegeben werden. Alternativ kann eine hohe Postimplantationslebensfähigkeit mit einem 37-38 °C Zellinkubator mit deaktiviertem_CO2 und einem Hygrometer zur Überwachung der Luftfeuchtigkeit erreicht werden, die 50%-80% betragen sollte.

7. Biolumineszenz-Bildgebung von Glühwürmchen markierten Tumoren

HINWEIS: Wenn die implantierten Zellen stabil mit dem Gen transduzierten Glühwürmchen Luziferase oder andere bildgebende Faktoren, dann können die resultierenden Tumoren mit Biolumineszenz-Bildgebung visualisiert werden. Fluoreszenz-Bildgebung wird bei intakten Eiern aufgrund des hohen Hintergrunds aus der Eierschale nicht empfohlen. Dies ist eine Endpunktanalyse, da die Öffnung der Schale das Überleben drastisch reduziert. Tumore können jederzeit abgebildet werden, die für experimentelle Bedürfnisse und die Geschwindigkeit des Tumorwachstums geeignet ist. Im Durchschnitt schlüpfen die Eier jedoch 21 Tage nach der Befruchtung. Daher ist Entwicklungstag 18 ein geeigneter Endpunkt, um unerwünschtes Schlüpfen zu vermeiden.

1. Transportieren Sie bei Bedarf Eier zur Bildgebungsanlage. Klebeeier auf 10 cm Gewebekulturgerichte. Geben Sie sie auf einen 37,8 °C (100 °F) Ei-Inkubator zurück, wobei der Rotationsmechanismus entfernt oder deaktiviert ist. Feuchtigkeit ist für Transport und Bildgebung nicht entscheidend.
2. Mit gekrümmten Iriszangen schieben Sie das CAM vorsichtig von der Schale weg, bis das CAM bündig mit dem Albumin und dem Embryo ist. Brechen Sie mit breitspitzenden Probenzangen Teile der Schale weg, um die Schalenöffnung für die Tumorvisualisierung ausreichend zu erweitern.
3. Injizieren Sie mindestens 50 l l 30 mg/ml D-Luciferin in das Eialbumin. Ein ähnliches Volumen von D-Luciferin kann auch in den Antihaftring oder auf die Oberfläche des CAM im Bereich, der die implantierten Zellen enthält, pipettiert werden. Dies gewährleistet eine optimale Biolumineszenz ohne optimale Gefäßversorgung. Inkubieren Sie für 8 min.
4. Injizieren Sie 20-50 l Isofluran in das Albumin des Eis, um das Ei zu anästhesieren. Inkubieren Sie für weitere 2 min. Alternativ kann das Ei in eine Induktionskammer mit 2-2,5% verdampftem Isofluran gelegt werden. Eine angemessene Anästhesietiefe wird erreicht, wenn die embryonale Bewegung aufhört.
   HINWEIS: Größere Mengen von Isofluran (100 l) können verwendet werden, um das Ei einzuschläfern.
5. Legen Sie Eier in ein Biolumineszenz-Bildgebungsgerät und Bild unter Verwendung der entsprechenden Einstellungen, wie durch die Anweisungen des Herstellers bestimmt. Für diese Studie wurde eine Expositionszeit von 1 min verwendet.
6. Um die verbleibendeN CAM und Embryo abgebildet, öffnen Sie das Ei in eine 10-cm-Gewebekulturschale.
   1. Greifen Sie das Ei mit den Fingern beider Hände auf der Unterseite des Eis in der Nähe der Mitte des Eis und die Daumen auf beiden Seiten der Schalenöffnung.
   2. Ziehen Sie die beiden Hälften des Eis vorsichtig mit den Daumen auseinander, während Sie mit den Fingern sanft in das Ei drücken.
   3. Wenn die Schale etwa halb vom CAM und embryo niert ist, drehen Sie das Ei auf den Kopf über eine 10-cm-Gewebekulturschale.
   4. Fahren Sie fort, die Schalenhälften zu trennen. Wenn das CAM an der Innenseite der Schale klebt, verwenden Sie vorsichtig die Finger, um das CAM von der Schale wegzudrücken.
   5. Der Embryo kann auf Wunsch in eine andere Schale gekippt werden.
   6. Gegebenenfalls kann zusätzliches Isofluran gemäß Schritt 7.4 verabreicht werden.

8. Tumorernte

HINWEIS: Tumoren können jederzeit geerntet werden, die für die experimentellen Bedürfnisse und die Geschwindigkeit des Tumorwachstums geeignet ist. Im Durchschnitt schlüpfen die Eier jedoch 21 Tage nach der Befruchtung. Daher ist Entwicklungstag 18 ein geeigneter Endpunkt, um unerwünschtes Schlüpfen zu vermeiden.

1. Greifen Sie Tumor mit Zange. Mit schere (Feder-Iris-Schere gut funktionieren) oder ein Skalpell, vorsichtig Verbrauch Tumor aus CAM.
2. Wenn der Tumor mit dem Galleifegen transduziert wurde, kann eine Reimaging durchgeführt werden, um die erfolgreiche Entfernung von schwer zu visualisierenden Tumoren zu überprüfen.
   HINWEIS: Ausgeschnittene Tumoren können mit jeder Methode analysiert werden, die für ein bestimmtes Experiment geeignet ist. Tumoren können auch in CAM oder Mäuse reimplantiert werden. Um die Tumoridentität zu bestätigen, können Tumore fixiert, Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin und Eosin oder immunhistochemischer Färbung untersucht werden.

Bisher haben wir festgestellt, dass diese Methode der Implantation bei Eierstock-, Nieren-, Prostata- und Blasenkrebs erfolgreich ist. Jeder wurde optimiert, um spezifische Bedingungen für die Implantation zu identifizieren, obwohl es Flexibilität geben kann. Von den getesteten Tumortypen war das Wachstum von Eierstockkrebs viel weniger ausgeprägt und in der Regel ohne die Hilfe von Biolumineszenz-Bildgebung nicht sichtbar (Abbildung 1). Eine Versteifung des CAM war jedoch mit Zangen im Implantationsbereich zu spüren. Dies kann helfen, mögliches Tumorwachstum in Abwesenheit von Biolumineszenz-Bildgebung zu identifizieren, obwohl eine weitere Validierung über Histologie oder eine andere geeignete Methode erforderlich wäre. Wir erreichten eine erfolgreiche Engraftmentierung sowohl menschlicher als auch muriner Zelllinien, die Morphologien aufweisen, die mit denen in anderen In-vivo-Modellen übereinstimmen (Abbildung 1A und 1B). Darüber hinaus war die Implantation von Tumorstücken möglich(Abbildung 1C, blauer Pfeil zeigt Tumor). Der implantierte Tumor stammte in diesem Fall von einem Patienten mit einem hochgradigen, metastasierenden, serenseren Serenkarzinom. Die resultierenden Tumoren ähnelten morphologisch ihren Ursprungstumoren und exprimierten humanspezifische Proteine wie Cytokeratin 8/18, die ihre Differenzierung von CAM und embryonalen Geweben von Hühnern leicht zulassen.

Bei der Optimierung der Tumortransplantation und Wachstum, geeignete Wachstumsfaktoren oder Hormone können zum Zeitpunkt der Implantation hinzugefügt werden. Zum Beispiel wurde in ID8-Zellen eine subtile, nicht signifikante Zunahme der Tumorgröße (gemessen am Gesamtstrahlungsfluss) beobachtet, wenn sie mit drei Einheiten (U) des menschlichen Follikel-stimulierenden Hormons (FSH) zum Zeitpunkt der Implantation ergänzt wurde (Abbildung 1D). Die Auswahl von FSH für das Wachstum von Eierstockkrebs resultierte aus der Expression des FSH-Rezeptors in ID8-Zellen und den hohen FSH-Werten, die typischerweise bei postmenopausalen Frauen zu finden sind, die die Mehrheit der Eierstockkrebsfälle ausmachen. Ähnliche Ansätze können für andere schwer zu züchtende Krebsarten gewählt werden, um den Nutzen des CAM-Modells zu verbessern. Darüber hinaus wurde FSH erst bei der Zellimplantation zugegeben. Die Auffüllung des Wachstumsfaktors oder Hormons könnte erreicht werden, indem eine angemessene Menge des Zusatzstoffs im Medium in geeigneten Intervallen in den Antihaftring geleitet wird, was die Wirkung verstärken könnte.

Bei Nierenkrebs führte die Implantation von 2 x 106 klarzelligen Nierenzellkarzinomzellen aus etablierten Zelllinien wie RENCA zu einer schnellen, robusten Tumorbildung, obwohl auch niedrigere Zelldosen verwendet werden können(Abbildung 2A, 10 Tage Postimplantation). Die resultierenden Tumoren ähnelten morphologisch denen, die durch Standard-Maus-in-vivo-Modelle28gewonnen wurden. Die Implantation von RENCA-Zellen, die mit Glühwürmchen-Luziferase markiert sind, ermöglichte eine Biolumineszenz-Bildgebung. Primäre menschliche Tumoren können auch implantiert werden. Die Tumorstücke blieben an und rekrutierten Vaskulatur, ohne signifikantes Wachstum zu zeigen. Die Implantation von verdauten Zellen, die aus einem primären, klaren Nierenzellkarzinom stammten, das in vitro erweitert wurde, wuchs jedoch ähnlich wie die etablierten Zelllinien (Abbildung 2B). Nierenzellkarzinomzellen können entweder mit der Antihaftring-Methode oder der Methode ohne Den-Antihaft-Ring gesät werden.

Mehrere menschliche und murinische Prostatakrebs-Zelllinien wurden auf CAM-Engraftment getestet (Abbildung 3). Jede wuchs gut, als 2 x 106 Zellen mit dem Antihaftring implantiert wurden. Die histologische Bewertung der resultierenden Tumoren entsprach den Erwartungen für jede Zelllinie. Zusätzlich ermöglichte die Implantation von Zellen, die stabil mit Glühwürmchen-Luziferase markiert waren, die Tumoridentifikation mit Biolumineszenz-Bildgebung (Abbildung 3A).

Blasenkrebs wurde im CAM-Modell aus etablierten Zelllinien und Teilen primären menschlichen Gewebes nachgewiesen (Abbildung 4). Zelllinien wuchsen gut, wenn mit 2 x 106 Zellen ohne den Antihaftring implantiert(Abbildung 4A und 4B), obwohl die Implantation mit dem Ring erfolgreich war. Primärer menschlicher Tumor kann aus Gewebestücken implantiert werden (Abbildung 4C). Der vorgestellte Fall stammt von einem Patienten mit hohem, nicht-muskelinvasivem, urothelialem Karzinom. Die Implantation von verdauten Zellen wurde aufgrund der laufenden Tumorverdauungsoptimierung noch nicht versucht. Krebszellen der resultierenden CAM-Tumoren behielten die Morphologie des ursprünglichen Tumors bei, jedoch mit einer veränderten stromalen Komponente. Das Tumorwachstum war geringer als bei Nierenzellkarzinom und Prostatakrebs, wenn auch immer noch leicht sichtbar.

Um eine hohe Anzahl lebensfähiger, testbarer Eier am Endpunkt zu gewährleisten, ist beim Inkubieren und Öffnen der Eier Vorsicht geboten. Wenn die Bedingungen des Inkubators vor oder nach der Implantation suboptimal sind, kann die Lebensfähigkeit des Embryos beeinträchtigt werden. Wenn ein signifikanter embryonaler Tod auftritt, beheben Sie die Inkubatorbedingungen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Unserer Erfahrung nach scheinen Temperatur- und Feuchtigkeitsstabilität wichtiger zu sein als ihre genauen Werte. Daher fanden wir heraus, dass die Inkubation der geimpften Eier in einem modifizierten, Zellkultur, CO 2-Inkubator eine überlegene Lebensfähigkeit als die Haltung der Eier in kleinen, dedizierten Eierbrutkästen, die eine häufigere Öffnung erfordern, um das Wasser, das die Feuchtigkeit steuert, wieder auffüllen. Die Minimierung der Häufigkeit, mit der die geimpften Eier zur Tumoruntersuchung entfernt werden, kann auch die Lebensfähigkeit des Embryos verbessern.

Ein weiteres Anliegen der CAM-Implantation ist die Integrität des CAM bei der Impfung. Wenn das CAM nach dem Öffnen der Schale nicht intakt ist, versinken der Antihaftring und die implantierten Zellen im Albumin des Embryos (siehe Anmerkung nach Schritt 2.12). Dies führt zu einer Zerstreuung der Krebszellen. Einige Tumoren können immer noch bilden, aber Krebsarten, die signifikante Wachstums- und Überlebenssignale von benachbarten Krebszellen erhalten, wie Eierstockkrebs, werden unter solchen Bedingungen nicht zuverlässig Tumore bilden. Wenn Antihaftringe für die Implantation verwendet werden, kann das Versagen des CAM durch das Einsinken des Rings in das Albumin identifiziert werden. Dies ist von Fällen zu unterscheiden, in denen der Ring und die implantierten Zellen durch embryonale Bewegung auf den Boden des Eis verschoben wurden. In diesen Fällen befindet sich der Ring zwischen dem CAM und der Unterseite der Schale. Embryonale Bewegung kann nicht kontrolliert werden. Die Ringplatzierung kann es dem Embryo jedoch erschweren, die implantierten Zellen zu stören. Ringe, die an den Rändern der Lufttasche platziert werden, die in Schritt 2.7 erzeugt werden, werden eher vom Embryo bewegt als die, die in der Mitte des Feldes platziert werden.

Abbildung 1: Repräsentative Tumorentwicklung bei Eierstockkrebs. Ovarialkarzinomzellen erfolgreich implantiert gehören: (A) die menschliche SKOV3-Zelllinie, (B) die murine ID8-Zelllinie und (C) Primärtumoren. Repräsentative Hämatoxylin- und Eosinfärbung wird je nach Bedarf zusammen mit biolumineszenz-Bildgebung präsentiert. Für den CAM-Tumor, der aus der Implantation eines primären Tumorstücks (C) resultiert, sind Hämatoxylin und Eosinfärbung sowohl des CAM-Tumors als auch des Primärtumors enthalten, zusammen mit Cytokeratin 8/18 (CK 8/18) Färbung des resultierenden CAM-Tumors. Der blaue Pfeil im ersten Bereich zeigt den Tumor an. (D) Tumorgröße von ID8-Implantaten mit und ohne 3U FSH, berechnet als Gesamtfluss durch Biolumineszenz-Bildgebung (n = 3 für unbehandelt und n = 4 für FSH-ergänzt). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Tumorentwicklung durch klares Zellnierenzellkarzinom. Tumoren, die ausder Implantation der murinen Nierenzellkarzinom-Zelllinie, RENCA oder (B) kultivierten Zellen resultieren, die aus einem verdauten menschlichen Primärtumor abgeleitet wurden. Die Messskala neben dem ausgeschnittenen Tumor in (B) zeigt 1 mm Markierungen. Die korrespondierende Histologie in (A) und (B) zeigt Hämatoxylin- und Eosinfärbung. In (A) wird auch die repräsentative Biolumineszenzbildgebung von RENCA-Zellen mit Firefly-Luziferase-markiertgezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Tumorentwicklung aus Prostatakrebszelllinien. Repräsentative Tumoren und Hämatoxylin- und Eosinfärbungen, die aus der Implantation der menschlichen Prostatakrebszelllinien (A) CWR und (B) C4-2 zusammen mit der murinen Zelllinie (C) MyC-CaP resultieren. Die Biolumineszenz-Bildgebung der resultierenden Tumoren aus Glühwürmchen-Luziferase markierten CWR-Zellen ist in (A )dargestellt. Die Messskala neben den ausgeschnittenen Tumoren zeigt 1 mm Markierungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Repräsentative Tumorentwicklung durch Blasenkrebs. Repräsentative Tumoren, die aus der Implantation der etablierten menschlichen Blasenkrebszelllinien resultieren (A) HT-1376, (B) T24 und (C) primärer menschlicher Blasentumor. In (C), werden Hämatoxylin- und Eosinfärbungen des resultierenden CAM-Tumors und des Primärtumors angezeigt. Die Messskala neben den ausgeschnittenen Tumoren zeigt 1 mm Markierungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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