Verwendung des Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Modells zur Untersuchung gynäkologischer und urologischer Krebsarten

Zusammenfassung

Wir präsentieren das Hähnchenchorioallanto-Membranmodell als alternatives, transplantierbares In-vivo-Modell zur Transplantation gynäkologischer und urologischer Krebszelllinien und von Patienten abgeleiteter Tumoren.

Zusammenfassung

Mausmodelle sind die Benchmark-Tests für In-vivo-Krebsstudien. Kosten, Zeit und ethische Erwägungen haben jedoch zu Forderungen nach alternativen In-vivo-Krebsmodellen geführt. Das Chicken Chorioallantoic Membrane (CAM) Modell bietet eine kostengünstige, schnelle Alternative, die eine direkte Visualisierung der Tumorentwicklung ermöglicht und für die In-vivo-Bildgebung geeignet ist. Als solches haben wir versucht, ein optimiertes Protokoll zur Eindierung gynäkologischer und urologischer Tumoren in dieses Modell zu entwickeln, das wir hier vorstellen. Etwa 7 Tage nach der Befruchtung wird die Luftzelle auf die vaskularisierte Seite des Eis verschoben, wo eine Öffnung in der Schale entsteht. Tumore aus murinen und menschlichen Zelllinien und Primärgeweben können dann transplantiert werden. Diese werden in der Regel in einer Mischung aus extrazellulärer Matrix und Medium gesät, um zelluläre Dispersion zu vermeiden und Nährstoffunterstützung zu bieten, bis die Zellen eine Vaskulärversorgung rekrutieren. Tumore können dann bis zu weiteren 14 Tage vor dem Schlüpfen der Eier wachsen. Durch die Implantation von Zellen, die stabil mit Glühwürmchenluziferase transduziert sind, kann die Biolumineszenz-Bildgebung für den empfindlichen Nachweis des Tumorwachstums auf der Membran und der Krebszelle verwendet werden, die sich im gesamten Embryo ausbreitet. Dieses Modell kann potenziell verwendet werden, um Tumorigenität, Invasion, Metastasierung, und therapeutische Wirksamkeit zu studieren. Das Chicken CAM-Modell benötigt deutlich weniger Zeit und finanzielle Ressourcen im Vergleich zu herkömmlichen murinen Modellen. Da die Eier immungeschwächt und immuntolerant sind, können Gewebe aus jedem Organismus potenziell ohne kostspielige transgene Tiere (z. B. Mäuse) implantiert werden, die für die Implantation von menschlichem Gewebe erforderlich sind. Viele der Vorteile dieses Modells könnten jedoch möglicherweise auch Einschränkungen sein, einschließlich der kurzen Tumorerzeugungszeit und des immungeschwächten/immuntoleranten Status. Darüber hinaus, obwohl alle Tumortypen hier vorgestellt engraft in der Huhn chorioallantoischen Membran-Modell, sie tun dies mit unterschiedlichen Grad des Tumorwachstums.

Einleitung

Mäuse haben als klassischer Modellorganismus für die Erforschung menschlicher Krankheiten, einschließlich Malignität, gedient. Als Säugetiere haben sie viele Gemeinsamkeiten mit menschenverachten. Ihr hoher Grad an genetischer Ähnlichkeit hat die transgene Manipulation des Mausgenoms ermöglicht, um einen enormen Einblick in die genetische Kontrolle menschlicher Krankheiten zu geben¹. Umfangreiche Erfahrungen im Umgang mit und Experimentieren mit Mäusen haben dazu geführt, dass sie das Modell der Wahl für die biomedizinische Forschung sind. Jedoch, zusätzlich zu den ethischen und wissenschaftlichen Bedenken in Bezug auf murine Modelle, können si....

Protokoll

Alle hier vorgestellten Experimente wurden von den zuständigen Ethikkommissionen der University of California, Los Angeles (UCLA) überprüft und genehmigt. Die Verwendung von deidentifizierten, primären menschlichen Tumoren wurde vom UCLA Institutional Review Board genehmigt (Protokollnummern 17-000037, 17-001169 und 11-001363). An der UCLA ist für Versuche mit Hühnerembryonen keine Überprüfung durch den Tierforschungsausschuss erforderlich; Eine Protokollgenehmigung ist nur erforderlich, wenn die Eier geschlüpft sind. Bewährte Verfahren wie die AVMA-Richtlinien für die Euthanasie von Tieren wurden jedoch verwendet, um Hühnerembryonen ethisch zu behandeln und Schmerzen....

Ergebnisse

Bisher haben wir festgestellt, dass diese Methode der Implantation bei Eierstock-, Nieren-, Prostata- und Blasenkrebs erfolgreich ist. Jeder wurde optimiert, um spezifische Bedingungen für die Implantation zu identifizieren, obwohl es Flexibilität geben kann. Von den getesteten Tumortypen war das Wachstum von Eierstockkrebs viel weniger ausgeprägt und in der Regel ohne die Hilfe von Biolumineszenz-Bildgebung nicht sichtbar (Abbildung 1). Eine Versteifung des .......

Diskussion

Die Tumorexpansion und -transplantation mit dem CAM-Modell ermöglicht ein schnelleres und direkt beobachtbares Tumorwachstum als bestehende in vivo-Tiermodelle. Darüber hinaus sind die Kosten nach Abschluss des Erstkaufs der Ausrüstung deutlich niedriger, insbesondere im Vergleich zu den Kosten von immungeschwächten Mäusen. Der anfängliche, immungeschwächte Zustand von Hühnerembryonen ermöglicht leicht die Verpfropfte von menschlichem und murinem Gewebe. Auch mit diesen Stärken hat das CAM-Modell Grenzen. Die kurze Zeit,.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
-010 Teflon (PTFE) Weiß 55 Duro Shore D O-Ringe	Der O-Ring Store	TEF010	Antihaftring für die Zellaussaat. 1/4" ID X 3/8" OD X 1/16" CS Polytetrafluorethylen (PTFE).
C4-2	ATCC	CRL-3314	Humane Prostatakrebs-Zelllinie.
CWR22Rv1			CWR-Zellen waren ein freundliches Geschenk von Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antikörper (C-51)	Novus Biologicals	NBP2-44929-0,02 mg	Wird in einer Verdünnung von 1:100 für die immunhistochemische Analyse von menschlichen ovaskulären CAM-Tumoren verwendet.
D-Luciferin Firefly, Kaliumsalz	Goldbio	LUCK-1G
Feinempfindliche Operationsschere; Gekrümmt; Scharf-Scharf; 30 mm Klingenlänge; 4-3/4 Zoll Gesamtlänge	Roboz Surgical	RS6703	Dies wird als Beispiel angegeben. Jede ähnliche gebogene Schere würde auch funktionieren.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Werkzeugsatz	Dremel	8050-N/18	Dieser Satz enthält alle notwendigen Werkzeuge.
Befruchtete Hühnereier (Rhode Island Rot - Braun, Laborqualität)	AA Lab Eggs Inc.	N/A	Es müsste ein lokaler Eierlieferant identifiziert werden, da dieser Lieferant nur regional liefert.
HT-1376	ATCC	CRL-1472	Humane Blasenkrebszelllinie.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Eierbrutkasten Combo Kit	Inkubator Lager	HB1588D-NONE-1102-1588-1357	Es können auch andere Eierbrutschränke verwendet werden, deren Zuverlässigkeit jedoch überprüft werden muss. Nach der Implantation kann auch ein Zellinkubator mit deaktiviertem CO2 verwendet werden.
ID8			Nicht im Handel erhältlich, siehe PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler	Inkubator Warehouse	1102	Es können auch andere Candler verwendet werden, jedoch bevorzugt unter denen, die wir getestet haben. Dieser Candler ist im oben genannten Inkubator-Kit enthalten.
Irispinzette, 10cm, gebogen, gezahnt, 0,8mm Spitzen	World Precision Instrument	15915	Dies ist als Beispiel angegeben. Jede ähnlich gebogene Pinzette würde auch funktionieren. Für diese Methode wurden mehrere Marken verwendet.
Isofluran-Clipper	, der	0010250
IVIS Lumina II In-vivo-Bildgebungssystem	Perkin Elmer
Matrigel-Membranmatrix HC verteilt; LDEV-freie	Corning	- 354248	extrazelluläre Matrixlösung
MyC-CaP	ATCC	CRL-3255	Maus-Prostatakrebs-Zelllinie.
Tragbare Pipettierhilfe XP Pipettensteuerung	Drummond Scientific	4-000-101	Jede ähnliche Pipettierhilfe wäre geeignet.
PrecisionGlide Injektionsnadeln	BD	305196	Dies wird als Beispiel angegeben. Jede 18G-Nadel würde ähnlich funktionieren.
RENCA	ATCC	CRL-2947
Semken Pinzette	Fine Science Tools	11008-13	Dies wird als Beispiel angegeben. Jede ähnliche Pinzette oder ein anderer Stil, der den Vorlieben des Forschers entspricht, wäre angemessen.
SKOV3	ATCC	HTB-77	Zelllinie des menschlichen Eierstockkrebses.
Probenzange	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	72914	Dies ist ein Beispiel. Die Pinzette, mit der die Schale für die Biolumineszenz-Bildgebung abgezogen wird, ist ca. 12,8 cm lang und hat 3 mm breite Spitzen.
Sterile Wattebällchen	Fisherbrand	22-456-885	Dies wird als Beispiel angegeben. Sterile Wattebäusche würden ausreichen.
Rührstäbe mit Gummi Policeman; 5 mm Durchmesser, 6 Zoll Länge	United Scientific Supplies	GRPL06	Dies wird als Beispiel angegeben. Alle ähnlichen Rührstäbchen aus Glas würden auch funktionieren.
T24	ATCC	HTB-4	Zelllinie für menschlichen Blasenkrebs.
Tegaderm Transparenter Verband Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4"	Moore Medical	21272
Gewebekulturschalen, 10 cm Durchmesser	Corning	353803	Dies wird als Beispiel angegeben. Jede ähnliche, sterile 10-cm-Schale kann verwendet werden. Eine Behandlung mit Gewebekulturen ist nicht erforderlich.
Tygon Durchsichtiger Laborschlauch - 1/4 x 3/8 x 1/16 Wand (50 Fuß)	Tygon	AACUN017	Dies wird als Beispiel angegeben. Jeder Schlauch ähnlicher Größe würde auch funktionieren.