Verwendung des Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Modells zur Untersuchung gynäkologischer und urologischer Krebsarten

Die Transplantation von Tumoren auf die Hähnchtodmembran oder CAM kann für Studien zur Tumorenutizität, Behandlungswirksamkeit oder zellulären Crosstalk verwendet werden. Diese Methode ermöglicht ein kostengünstiges schnelles Tumorwachstum in einer immuntoleranten In-vivo-Einstellung. Mit dem CAM-Modell können neuartige therapietherapeutische Ansätze schnell mit Zelllinien oder sogar Patiententumorproben getestet werden.

Die wichtigsten Aspekte dieses Protokolls sind die Gewährleistung einer ordnungsgemäßen CAM-Bildung und die Nichtstörung der CAM oder Vaskulatur beim Öffnen der Eier. Am entwicklungstag sieben oder acht, wenn das CAM voll entwickelt ist, den Eirotator ausschalten und etwa ein bis drei Eier in den Eierständer im Biosicherheitsschrank legen. Wenn die Lichter ausgeschaltet sind, legen Sie einen Eierkaneinen gegen die Eierschale, um die Position der Luftzelle eines Eis zu identifizieren und zu markieren, und bewegen Sie dann den Eierkanordler über die Schale, um ein großes Blutgefäßnetz zu finden, wobei das Ei bei Bedarf rotiert wird.

Eine ideale Vaskulatur wird in der Nähe der Mitte des Eis verzweigen. Verwenden Sie einen Marker, um die Vaskulatur zu verfolgen, die für die Implantation verwendet werden soll. Nachdem Sie das Licht in der Haube wieder eingeschaltet haben, verwenden Sie ein schnurloses Drehwerkzeug, das mit einem Siliziumkarbid-Schleifstein ausgestattet ist, um ein kleines Loch in der Schale direkt über die Mitte der Luftzelle zu bohren.

Wenn der größte Teil der Schale entfernt wurde, aber mit weißer Innenmembran intakt ist, bohren Sie ein weiteres kleines Loch, in dem das Gefäßfenster geöffnet wird, wie gerade gezeigt. Wenn das zweite Loch fertig ist, verwenden Sie eine 18-Spur-Nadel, um die weiße Innere Membran sanft über die Luftzelle und Dievaskulatur zu durchbohren, wobei darauf geachtet wird, dass die weiße Innere Membran, aber nicht das CAM, während des gesamten Bohrbereichs gestört wird. Wenn das Kapuzenlicht wieder ausgeschaltet ist, verwenden Sie den Eierkaneinen, um zu überprüfen, ob die Luftzelle vom Ende des Eis in den Bereich über die Gefäße übertragen wurde.

Legen Sie bei Bedarf Vakuumschläuche in einen Pipettenregler um das Loch über die ursprüngliche Luftzelle und wenden Sie vorsichtig Absaugung in kurzen Ausbrüchen an, um die Luftzelle zu bewegen. Markieren Sie den Umriss der neuen Position der Luftzelle etwa 0,5 Zentimeter innerhalb der Luft-CAM-Grenze und fixieren Sie ein Stück Packband, das gerade groß genug ist, um das Loch über der neuen Luftzelle zu bedecken. Nach der Zubereitung der beiden anderen Eier, wie gerade gezeigt, die Eier zum Brutkasten zurückgeben und alle zusätzlichen Eier für das Experiment in Gruppen von eins bis drei öffnen, wie gezeigt.

Wenn alle Eier geöffnet sind, übertragen Sie ein bis drei Eier mit verlegten Luftzellen in einem Biosicherheitsschrank in das Eiregal und verwenden Sie ein schnurloses Drehwerkzeug, das mit einem kreisförmigen Schneidrad ausgestattet ist, um eine kleine Linie über die Luftzellgrenze vollständig durch die Zelle zu schneiden, ohne das CAM oder die Vaskulatur zu stören. Schneiden Sie mit einer gekrümmten Schere die verbleibende Luftzelle um, um ein Fenster in der Schale zu erstellen und die Lebensfähigkeit des Embryos zu überprüfen. Lebensfähige Embryonen zeigen eine umfangreiche Vaskulatur, klares Albumin, Embryobewegung und/oder einen sichtbaren Herzschlag.

Bei nicht lebensfähigen Embryonen kann das CAM bei wenigen, wenn überhaupt, vorhandenen Gefäßen undurchsichtig erscheinen, und die Embryonen können klein oder abwesend sein, ohne Bewegung oder Herzschlag. Mit Semkin-Zangen ziehen Sie kleine Baumwollstücke aus einer sterilen Baumwollkugel und bappen Sie sanft die CAM-Oberfläche der lebensfähigen Embryonen, um Muschelstaub und -schmutz zu entfernen, und bedecken Sie dann die Schalenöffnung mit einem viertel teils sechs mal sieben Zentimeter transparenten Filmdressing, ohne das CAM zu berühren, und geben Sie die Eier mit dem geöffneten Fenster nach oben in den Brutkasten zurück. Verwenden Sie ein Stück Eierregal, den Rand des Eierrotators oder ein anderes geeignetes Element, um alle Eier zu stützen, die weiterrollen.

Um die Krebszellsuspension für die Transplantation vorzubereiten, ernten Sie die Zellen aus der Krebszellkultur von Interesse und sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen im Restmedium mechanisch wieder auf. Legen Sie die Zellsuspension auf Eis und verwenden Sie eine Pipette, um das Volumen der Zellen in Medium zu messen.

Dann setzen Sie die Zellen in einer Konzentration von ein bis zwei Millionen Zellen in 20 bis 100 Mikroliter Medium ergänzt mit 2,7 bis 4 Milligramm pro Milliliter extrazelluläre Matrix und alle Wachstumsfaktoren oder andere Zusatzstoffe von Interesse. Für die Krebszellimplantation mit einem Antihaftring bis zu sechs Eier auf das Eierregal implantieren und die Ränder des transparenten Filmverbandes in Richtung des offenen Fensters rollen, um den Film aus den Schalen zu entfernen. Prüfen Sie, ob die Eier lebensfähig und gesund sind.

Ideale Eier haben ein großes Gefäß mit kleineren verzweigten Gefäßen in der Mitte des geöffneten Bereichs. Mit gebogenen Iriszangen einen sterilen Antihaftring über dem Gefäß ideal über einen Astpunkt auf das CAM legen. Verwenden Sie eine sterile Glasrührstange, um das CAM sanft abzuschleifen und die Krebszellsuspension in die Mitte des Rings zu pipette.

Wenn alle Zellen geliefert sind, versiegeln Sie die Öffnung mit einem Viertelstück von sechs mal sieben Zentimetern transparentem Folienverband und beschriften Sie das Ei mit einer entsprechenden Implantatbezeichnung. Dann legen Sie die Eier sicher in den Inkubator mit dem Öffnen der Schale aufrecht. Um Krebszellen ohne Verwendung eines Antihaftrings zu implantieren, saugen Sie die Zellsuspension in eine entsprechend dimensionierte Pipettenspitze und halten Sie den oberen Teil der Spitze vorsichtig die Pipettenspitze aus und legen Sie die Spitze horizontal in eine sterile 10-Zentimeter-Gewebekulturschale.

Nachdem die Spitzen geladen sind, legen Sie die Schale für 15 bis 30 Minuten in einen 37 Grad Celsius Inkubator und prüfen Sie nach 15 Minuten auf Polymerisation. Eine kleine Menge Flüssigkeit tritt in der Regel aus, wenn jede Spitze in die Schüssel gelegt wird. Verwenden Sie diese Flüssigkeit, um das Ausmaß der Polymerisation innerhalb der Spitze abzuschätzen.

Wenn die Matrix fertig ist, legen Sie eine Spitze auf eine entsprechend dimensionierte Pipette und drücken Sie den Kolben, um die teilweise polymerisierte Zellsuspension idealerweise über den verzweigten Punkt eines großen, gut entwickelten Gefäßes auf das CAM zu drücken. Mit diesen Methoden führten sowohl menschliche als auch murine Eierstockkrebszelllinien und primäre Tumorstücke zur erfolgreichen Engraftierung von Tumoren mit Morphologien, die mit denen in anderen in vivo-Modellen übereinstimmen. Von den getesteten Tumortypen war das Wachstum von Eierstockkrebs viel weniger ausgeprägt und in der Regel ohne die Hilfe der Biolumineszenz-Bildgebung nicht sichtbar.

Die Auswirkungen der Zugabe von Wachstumsfaktoren oder Hormone zum Zeitpunkt der Implantation kann auch mit diesen Methoden getestet werden. Bei Nierenkrebs führt die Implantation von Klarzell-Nierenzellkarzinomzellen aus etablierten Zelllinien oder -stücken aus primären menschlichen Nierentumoren zu einer schnellen, robusten Tumorbildung. Darüber hinaus wurden mehrere menschliche und murinische Prostatakrebs-Zelllinien und menschliche Blasenkrebszelllinien und primäre Tumorstücke verwendet, um Tumore mit diesem Modell zu etablieren.

Es ist wichtig, das CAM und die Vaskulatur nicht zu stören und sicherzustellen, dass das CAM beim Öffnen des Fensters nicht an der Schale haftet. Nach erfolgreicher Transplantation kann das CAM-Modell verwendet werden, um die therapeutische Wirksamkeit von Behandlungen von Interesse oder Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Tumors zu bewerten.