Die Herstellung von SNS-Zangenkobalt(II)-Modellkomplexen der Leberalkoholdehydrogenase wird hier vorgestellt. Die Komplexe können durch Reaktion des Ligandenvorläufers mit CoCl26H2O hergestellt und dann rekristallisiert werden, indem der Diethylether langsam in eine Acetonitrillösung diffundieren kann, die den Kobaltkomplex enthält.
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Methodenartikel
Herstellung von SNS Cobalt(II) Pincer Model Complexes of Liver Alcohol Dehydrogenase
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Chemische Modellkomplexe sind bereit, die aktive Stelle eines Enzyms darzustellen. In diesem Protokoll wird eine Familie von Dreizackzangen-Ligand-Vorläufern (die jeweils zwei Schwefel- und ein Stickstoffspender-Atomfunktionalitäten (SNS) besitzen und auf Bis-Imidazol- oder Bis-Triazol-Verbindungen basieren) mit CoCl2-6H2 O metallisiert, um sich Tridentat-SNS-Pincer-Kobalt(II)-Komplexe zu leisten.2 Die Herstellung der Kobalt(II)-Modellkomplexe für die Leberalkoholdehydrogenase ist einfach. Basierend auf einem schnellen Farbwechsel2beim Hinzufügen der CoCl 2-6H2 O-Lösung, die den Ligandenvorläufer enthält, bildet sich der Komplex schnell.2 Die Bildung des Metallkomplexes ist abgeschlossen, nachdem die Lösung über Nacht refluxen kann. Diese Kobalt(II)-Komplexe dienen als Modelle für die zinkaktive Stelle in Leberalkoholdehydrogenase (LADH). Die Komplexe werden durch Einkristall-Röntgenbeugung, Elektrospray-Massenspektrometrie, ultraviolette sichtbare Spektroskopie und Elementaranalyse charakterisiert. Um die Struktur des Komplexes genau zu bestimmen, muss seine einzelne Kristallstruktur bestimmt werden. Einzelne Kristalle der Komplexe, die für die Röntgenbeugung geeignet sind, werden dann durch langsame Dampfdiffusion von Diethylether zu einer Acetonitrillösung, die den Kobalt(II)-Komplex enthält, angebaut. Bei hochwertigen Kristallen findet die Rekristallisation in der Regel über einen Zeitraum von 1 Woche oder länger statt. Die Methode kann bei der Vorbereitung anderer Modellkoordinationskomplexe angewendet werden und kann in Lehrlabors für Bachelor-Studiengänge eingesetzt werden. Schließlich, Es wird angenommen, dass andere diese Rekristallisationsmethode finden können, um einzelne Kristalle vorteilhaft für ihre Forschung zu erhalten.
Einleitung
Der Zweck der vorgestellten Methode ist es, kleinmolekulare Analoga von LADH vorzubereiten, um die katalytische Aktivität von Metalloenzymen weiter zu verstehen. LADH ist ein dimerisches Enzym, das eine Cofaktor-bindende Domäne und Zink(II) metallhaltige katalytische Domäne1enthält. LADH, in Gegenwart von Co-Faktor NADH, kann Ketone und Aldehyde auf ihre jeweiligen Alkoholderivate reduzieren2. In Gegenwart von NAD+kann LADH eine umgekehrte Katalyse der Oxidation von Alkoholen zu Ketonen und Aldehyden2durchführen. Die Kristallstruktur der aktiven Stätte von LADH zeigt, dass sein Zink(II)-Metallzentrum an ein Stickstoffatom gebunden ist, das durch eine Histidin-Seitenkette und zwei Schwefelatome bereitgestellt und von zwei Cysteinliganden3angeboten wird. Weitere Forschungen haben gezeigt, dass das Zinkmetallzentrum mit einem labilen Wassermolekül ligiert ist, was zu pseudotetraeder Geometrie um das Metallzentrum4führt.
Wir haben bereits berichtet und verwendet SNS Zangenligaden Vorläufer sowie metalliert die Liganden-Vorläufer mit ZnCl2 Zu bilden Zn(II) Komplexe, die die Dreizack Liganden Vorläufer5,6,7enthalten. Diese Ligandenvorstufen sind in Abbildung 1dargestellt. Diese Zink(II)-Komplexe zeigten Aktivität zur stoichiometrischen Reduktion elektronenarmer Aldehyde und sind somit Modellkomplexe für LADH. Anschließend wurden die Synthese und Charakterisierung einer Reihe von Kupfer(I) und Kupfer(II)-Komplexen, die SNS-Liganden-Vorläufer enthalten,8,9,10berichtet.
Obwohl LADH ein Zink(II)-Enzym ist, sind wir daran interessiert, Kobalt(II)-Modellkomplexe von LADH herzustellen, um mehr spektroskopische Informationen über die Kobalt(II)-Analoga von LADH zu erhalten. Die Kobalt(II)-Komplexe sind gefärbt, während die Zink(II)-Komplexe weiß sind. Da die Kobalt(II)-Komplexe gefärbt sind, können ultraviolette sichtbare Spektren der Komplexe gewonnen werden, in denen auch Informationen über die Stärke des Ligandenfeldes in Kobalt(II)-Komplexen gesammelt werden können. Anhand von Informationen aus Gaußschen Berechnungen und den experimentell erhaltenen ultravioletten sichtbaren Spektren lassen sich Informationen über die Stärke des Ligandenfeldes ableiten. Kobalt(II) ist ein guter Ersatz für Zink(II), da beide Ionen ähnliche ionische Radien und ähnliche Lewis-Säuren11,12aufweisen.
Die vorgestellte Methode beinhaltet die Synthese und Charakterisierung von Modellkomplexen, um zu versuchen, das natürliche katalytische Verhalten von LADH5,6nachzuahmen. Wir haben zuvor eine Familie von Ligandenvorläufern mit ZnCl2 zu Zink(II)-Modellkomplexen von LADH metalliert, die die Struktur und Reaktivität der Zink-Aktivstelle in LADH4modelliert haben. Durch mehrere Experimente haben sich diese Zangenligaden unter verschiedenen Umgebungsbedingungen als robust erwiesen und sind mit einer vielfältigen Sammlung anhändernder R-Gruppen stabil geblieben. 5,6
Tridentat-Liganden sind im Vergleich zu Monodentat-Liganden vorzuziehen, da sie aufgrund der starken Chelateffekte von Dreizackliganden erfolgreicher mit Metallung sind. Diese Beobachtung ist auf eine bevorzugte Entropie der Dreizackzangenligadenbildung im Vergleich zu einem Monodentat-Ligand13zurückzuführen. Darüber hinaus sind Dreizackzangenliganden wahrscheinlich, um eine Dimerisierung der Metallkomplexe zu verhindern, was bevorzugt wird, weil die Dimerisierung die katalytische Aktivität eines komplexen14verlangsamen kann. So hat sich die Verwendung von Dreizackzangenligaden in der organometallischen Chemie bei der Herstellung katalytisch aktiver und robuster Komplexe bewährt. SNS-Zangenkomplexe wurden weniger untersucht als andere Zangensysteme, da Zangenkomplexe in der Regel Übergangsmetalle der zweiten und dritten Reihe enthalten15.
Diese Forschung über Metalloenzyme kann dazu beitragen, das Verständnis ihrer enzymatischen Aktivität zu fördern, die auf andere Bereiche der Biologie angewendet werden kann. Diese Methode der Synthese von Modellkomplexen im Vergleich zur alternativen Methode (Synthese des gesamten Proteins von LADH) ist aus einer Reihe von Gründen günstig. Der erste Vorteil besteht darin, dass Modellkomplexe wenig molekulare Masse haben und immer noch in der Lage sind, die katalytische Aktivität und die Umgebungsbedingungen der aktiven Stelle des natürlichen Enzyms genau darzustellen. Zweitens sind Modellkomplexe einfacher zu arbeiten und erstellen zuverlässige und relatable Daten.
Dieses Manuskript beschreibt die synthetische Vorbereitung und Charakterisierung von zwei Kobalt(II) Zangenmodellkomplexen von LADH. Beide Komplexe verfügen über einen Zangenligaden, der Schwefel-, Stickstoff- und Schwefelspenderatome enthält. Der erste Komplex (4) basiert auf einem Imidazol-Vorläufer und der zweite (5) auf einem Triazol-Vorläufer. Die Komplexe zeigen Reaktivität zur Stoiiometriereduktion elektronenarmer Aldehyde in Gegenwart eines Wasserstoffspenders. Diese Reaktivitätsergebnisse werden in einem nachfolgenden Manuskript berichtet.
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Protokoll
1. Synthese von Chlor-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazol-2-thion)pyridin]kobalt(II)tetrachlorocobaltate [4]
- Zur Herstellung komplexer 4, fügen Sie 0,121 g (3,12 x 10-4 mol) von 2,6-bis(N-isopropyl-N'-Methyleneimidazol-2-thion)pyridin (C19H25N5S2)6 bis 15 ml Acetonitril in einem 100 ml runden Bodenkolben hinzu. Als nächstes, um diese Lösung, fügen Sie 0,0851 g (3,58 x 10-4 mol) Kobaltchlorid(II) Hexahydrat (CoCl26H2O). Die Reaktionslösung sollte die Farbe von hellgelb zu smaragdgrün ändern, unmittelbar nachdem das Kobalt(II)-Chloridhexahydrat zugegeben wurde.
- Fügen Sie dem Kolben eine Rührstange hinzu. Reflux und rühren Sie die Reaktion für 20 h, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotovap unter reduziertem Druck.
2. Rekristallisation von Chlor-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methyleneimidazol-2-thion)pyridin]kobalt(II)tetrachlorocobaltate [4] durch langsame Dampfdiffusion
- Lösen Sie die Lösung in Acetonitril (7,5 ml), filtern Sie die Lösung und legen Sie die Lösung gleichmäßig in 1 Dram-Fläschchen. Jede Durchstechflasche mit 1,5 ml Acetonitrillösung füllen.
- Fügen Sie Baumwolle hinzu, um die Fläschchen zu kappen, was eine langsame Dampfdiffusion ermöglicht. Passen Sie die Baumwolle eng in die Öffnung an der Oberseite der Durchstechflasche.
- Legen Sie die Durchstechflaschen in ein 240 ml Glas mit 50 ml Diethylether. Schließen Sie das Glas mit einer Kappe.
- Lassen Sie die Kristalle über einen Zeitraum von 1 Woche wachsen.
HINWEIS: Die Rekristallisation kann länger als 1 Tag dauern.
3. Synthese von Chlor-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methylenetriazol-2-thion)pyridin]kobalt(II)tetrachlorocobaltate [5]
- Zur Herstellung komplexer 5, fügen Sie 0,183 g (4,70 x 10-4 mol) von 2,6-bis(N-isopropyl-N'-Methylenetriazol-2-thion)pyridin (C17H23N7S2)6 bis 15 ml Acetonitril in einem 100 ml runden Bodenkolben hinzu. Zu dieser Lösung 0,223 g (9,37 x 10-4 mol) Kobaltchloridhexahydrat (CoCl2x 6H2O) hinzufügen. Die Reaktionslösung sollte die Farbe von hellgelb zu königsblau ändern, unmittelbar nachdem das Kobalt(II)-Chloridhexahydrat zugegeben wurde.
- Fügen Sie dem Kolben eine Rührstange hinzu. Reflux und rühren Sie die Reaktion für 20 h, um eine vollständige Reaktion zu gewährleisten. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Rotovap unter reduziertem Druck.
4. Rekristallisation von Chlor-(n3-S,S,N)-[2,6-bis(N-isopropyl-N'-methylenetriazol-2-thion)pyridin]kobalt(II)tetrachlorocobaltate [5] durch langsame Dampfdiffusion
- Lösen Sie die Lösung in Acetonitril (9,0 ml), filtern Sie die Lösung und legen Sie die Lösung gleichmäßig in 1 Dram-Fläschchen. Jede Durchstechflasche mit 1,5 ml Acetonitrillösung füllen.
- Fügen Sie Baumwolle hinzu, um die Fläschchen zu kappen, was eine langsame Dampfdiffusion ermöglicht. Passen Sie die Baumwolle eng in die Öffnung an der Oberseite der Durchstechflasche.
- Die Durchstechflaschen in ein Glas mit 50 ml Eethylether geben. Schließen Sie die Durchstechflasche mit einer Kappe.
- Lassen Sie die Kristalle über einen Zeitraum von 1 Woche wachsen.
HINWEIS: Die Rekristallisation kann länger als 1 Tag dauern.
5. Röntgenkristallographie
- Montieren Sie einen Kristall von 4 auf einer Nylonschlaufe. Sammeln Sie die Daten auf einem Rigaku Oxford Diffraction Diffraktometer. Hier werden Röntgenbeugungsdaten bei 173(2) K gesammelt. Lösen Sie die Kristallstruktur mit Olex216 und ShelXT17 Strukturlösungsprogrammen mit direkten Methoden. Verfeinern Sie die Struktur mit dem ShelXL18 Verfeinerungspaket mit der minimierenden minimierung der kleinsten Quadrate.
- Montieren Sie einen Kristall von 5 auf einer Nylonschlaufe. Sammeln Sie die Röntgenbeugungsdaten auf einem Rigaku Oxford Diffraction Diffractometer. Hier werden Röntgenbeugungsdaten bei 173(2) K gesammelt. Lösen Sie die Kristallstruktur mit Olex216 und ShelXT17 Strukturlösungsprogrammen mit direkten Methoden. Verfeinern Sie die Struktur mit dem ShelXL18 Verfeinerungspaket mit der minimierenden minimierung der kleinsten Quadrate.
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Ergebnisse
Synthese
Die Synthesen der Komplexe 4 und 5 wurden erfolgreich durchgeführt, indem eine Acetonitrillösung reagiert wurde, die einen Bis-Thion-Ligand-Vorläufer mit Kobalt (II)-Chlorid-Hexahydrat enthielt (Abbildung 2). Diese Reaktion trat bei einer Refluxtemperatur in Gegenwart von Luft auf. Im Allgemeinen wurden die Komplexe 4 und 5 in Acetonitril, Dimethylsulfoxid, Dichlormethan und Methanol löslich beob...
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Diskussion
Die Vorbereitung der Komplexe 4 und 5 ist einfach. Der schlüsselfertige Schritt besteht darin, die feste CoCl2-6H2O zu einer Acetonitrillösung hinzuzufügen, die den jeweiligen Ligandenvorläufer enthält. Die Lösung wird innerhalb von Sekunden nach dem Hinzufügen von CoCl2'6H2O zu komplex 4. Die Lösung wird hellblau nach dem Hinzufügen von CoCl26H2O, um komplex zu bilden 5. Um eine vollständ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
John Miecznikowski erhielt finanzielle Unterstützung von folgenden Personen für dieses Projekt: die Connecticut NASA Space Grant Alliance (Award Number P-1168), das Fairfield University Science Institute, College of Arts and Sciences Publication Fund, Fairfield University Faculty Summer Research Stipend, und National Science Foundation-Major Research Instrumentation Program (Grant Number CHE-1827854) für Denerbe eines 400 MHz NMR Spektrometers. Er dankt auch Terence Wu (Yale University) für die Unterstützung beim Erwerb von Elektrospray-Massenspektren. Jerry Jasinski erkennt das National Science Foundation-Major Research Instrumentation Program (Grant Number CHE-1039027) für den Kauf eines Röntgendiffraktometers an. Sheila Bonitatibus, Emilse Almanza, Rami Kharbouch und Samantha Zygmont würdigen das Hardiman Scholars Program für die Bereitstellung ihres Sommerforschungsstipendiums.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 100 mL Rundkolben | Chem Glass | CG150691 | 100 mL Einhalskolben mit rundem Boden, 19/22 Außengelenk |
| Acetonitril | Fisher | HB9823-4 | HPLC Grade |
| Chiller für Roto-Vap | Lauda | L000638 | Alpha RA 8 |
| Kobaltchlorid-Hexahydrat | Acros Organics | AC423571000 | Acros Organics |
| Diethylether | Fisher | E-138-1 | Diethylether Anhydorus |
| Messzylinder | Fisher | S63456 | 25 mL Messzylinder |
| Heizplatte | Fisher | 11-100-49SH | Isotemp Basic Rührkessel |
| Gläser Fisher | 05-719-481 | 250 mL | |
| Gläser Ligand | ----- | ----- | Zuvor von Professor Miecznikowski Medium synththetisiert |
| Wattebällchen | Fisher | 22-456-80 | mittelgroße Wattebällchen |
| einem Dram Fläschchen | Fisher | 03-339 | ein Dram-Fläschchen mit TFE Lined Cap |
| Pipette | Fisher | 13-678-20B | 5,75 Zoll Pipetten |
| Pipettenbirnen | Fisher | 03-448-21 | Fisher Brand Latex Bulb für Pipette |
| Rekristallisationsschale für Sandbad | Fisher | 08-741 D | 325 mL Rekristallisationsschale für |
| Sandbad-Rückflusskondensator | Chem Glass | CG-1218-A-22 | Kondensator mit 19/22 Innenfuge |
| Rotovap | Heidolph Collegiate | 36000090 | Brinkmann; Heidolph Collegiate Rotationsverdampfer mit Heidolph WB Eco Bad Heidolph Rotationsverdampfer |
| Meersand für Sandbad | Acros Organics | 612355000 | gewaschener Meeressand für Sandbad |
| Rührstab | Fisher | 07-910-23 | Eiförmiger Magnetrührstab |
| Vakuumfett | Fisher | 14-635-5D | Dow Corning Hochvakuum Fett |
| Vakuumpumpe für Rotovap | Heidolph Collegiate | 36302830 | Heidolph Rotovac Ventilsteuerung |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
