Ein standardisiertes Protokoll für Präferenztests zur Bewertung des Wohlbefindens von Fischen

Zusammenfassung

Ein grundlegender Aspekt bei der Beurteilung des Wohlergehens von Tieren in Gefangenschaft ist die Frage, ob die Tiere haben, was sie wollen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Bestimmung der Haltungspräferenz im Zebrafisch (Danio rerio) in Bezug auf das Vorhandensein/Fehlen von Umweltanreicherung und Zugang zum Fließen von Wasser vor.

Zusammenfassung

Die Techniken zur Bewertung des Tierschutzes versuchen, die spezifischen Bedürfnisse und Wünsche des betreffenden Tieres zu berücksichtigen. Die Bereitstellung von Anreicherung (das Hinzufügen von physischen Objekten oder Konspezifen in der Wohnumgebung) ist oft eine Möglichkeit, gefangenen Tieren die Möglichkeit zu geben, zu wählen, mit wem oder was sie interagieren und wie sie ihre Zeit verbringen. Ein grundlegender Bestandteil der aquatischen Umwelt, der in Gefangenschaft oft übersehen wird, ist jedoch die Fähigkeit des Tieres, sich für körperliche Bewegung zu entscheiden. Für viele Tiere, einschließlich Fische, ist Bewegung ein wichtiger Aspekt ihrer Lebensgeschichte, und ist dafür bekannt, viele gesundheitliche Vorteile zu haben, einschließlich positiver Veränderungen im Gehirn und Verhalten. Hier stellen wir eine Methode zur Bewertung der Habitatpräferenzen bei in Gefangenschaft gehaltenen Tieren vor. Das Protokoll könnte leicht angepasst werden, um eine Vielzahl von Umweltfaktoren (z. B. Kies versus Sand als Substrat, Kunststoffpflanzen versus lebende Pflanzen, geringer Durchfluss im Vergleich zu hohem Wasserfluss) in verschiedenen aquatischen Arten oder für die Verwendung mit terrestrischen Arten zu betrachten. Die statistische Bewertung der Präferenz erfolgt anhand des Jakobspräferenzindex, der die Lebensräume von -1 (Vermeidung) bis +1 (am meisten bevorzugt) einordnet. Mit diesen Informationen kann ermittelt werden, was das Tier aus Sicht des Tierschutzes, einschließlich ihres bevorzugten Standorts, will.

Einleitung

Die Vorschriften, wie Labortiere in Gefangenschaft untergebracht werden sollen, sind explizit und klar definiert. Die Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International betreut und verwaltet alle Organisationen und Institutionen, die mit Forschungstieren arbeiten, und verfügt über spezifische Richtlinien für artgerechte Haltung und Unterbringung. Zum Beispiel, Die AAALAC Guidance on the Housing and Care of Zebrafish, Danio Rerio¹ "stark fördert" die Verwendung von Anreicherung (die Zugabe von physischen Objekten oder Konspezifischen in der Wohnumgebung) bei der Unterbringung von Zebrafischen in Gefangenschaft. Weiter heißt es in dem Ratgeber: "Die Bereitstellung künstlicher Pflanzen oder Strukturen, die den Lebensraum der Zebrafische imitieren, ermöglicht den Tieren eine Wahlmöglichkeit in ihrer Umwelt."

Beweise deuten darauf hin, dass Anreicherung das Wachstum neuer Neuronen (Neurogenese) in Bereichen des Gehirns an der Verarbeitung räumlicher Informationen stimulieren kann², und es wird angenommen, dass diese neuronalen Veränderungen mit verbesserten Lernfähigkeit verbunden sind³. Die Auswirkungen der Anreicherung auf Neurogenese und Lernen wurden in verschiedenen Taxa, einschließlich Fisch^4,5, Vögel⁶, Reptilien⁷und Säugetiere^{8 .} Obwohl diese Arten von Studien wichtig sind, um die Auswirkungen der Anreicherung auf das Gehirn und das Verhalten zu verstehen, berücksichtigen sie nicht die besonderen Entscheidungen oder Vorlieben von Tieren für eine bestimmte Umgebung gegenüber einer anderen.

Eine grundlegende Frage bei der Beurteilung des Wohlergehens von tieren in Gefangenschaft ist, ob die Tiere haben, was sie wollen⁹. Eine Möglichkeit, dieser Frage nachzugehen, die greifbare Beweise liefert, besteht darin, den Tieren Entscheidungen zu geben, die es uns ermöglichen, ihre subjektiven Vorlieben zu verstehen. So wurde beispielsweise in zwei Studien untersucht, ob Zebrafische den Zugang zu einer angereicherten oder einer einfachen Umgebung bevorzugen, wobei beide Studien auf eine Präferenz für Gebiete hinweisen, die eine Anreicherung enthalten^10,11. Es wurde jedoch auch vorgeschlagen, dass Zebrafische der Umweltanreicherung gleichgültig erscheinen¹², so dass die Antwort auf die Frage offensichtlich nicht eindeutig ist. Eine weitere Anwendung von Präferenztests im Zusammenhang mit dem Tierschutz erstreckt sich auf den Versuch zu verstehen, wie verschiedene Aspekte einer angereicherten Umwelt bei den Entscheidungen eines einzelnen Tieres eine Rolle spielen. Allein bei Fischen haben verschiedene Arten der Anreicherung unterschiedliche Auswirkungen auf das Gehirn und das Verhalten, und diese Beziehung wird durch individuelle Unterschiede in den Persönlichkeitsmerkmalen noch komplizierter¹³. Darüber hinaus könnten Präferenztests für vergleichende Studien zur Umweltanreicherung nützlich sein. Sogar über verschiedene Fischarten hinweg hat sich gezeigt, dass die Anreicherung einen Einfluss auf viele verschiedene Arten von Verhalten hat, einschließlich Aggression¹⁴, Kühnheit¹⁵, Fortbewegung¹⁶und Risikoverhalten¹⁷.

Jacobs Präferenzindex ist ein statistischer Test, der häufig zur Quantifizierung von Wohnungspräferenzen verwendet wird¹⁸. Der Jakobs Präferenzindex weist jedem einzelnen Lebensraum einen Wert zu, basierend auf der Anzahl der Tiere, die in jedem Lebensraumtyp zu unterschiedlichen Zeitpunkten vorhanden sind, wobei die Präferenz von -1 (Vermeidung) bis +1 (am meisten bevorzugt) reicht. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verwendung von Jacobs Präferenzindex, um Die Haltungspräferenzen bei Fischen zu untersuchen, und verwenden das Beispiel der Bewertung von zwei wichtigen Merkmalen der aquatischen Umwelt: 1) das Vorhandensein oder Fehlen von Anreicherung; und 2) den Wasserfluss¹⁹. Das Protokoll könnte jedoch leicht angepasst werden, um eine Vielzahl von Umweltfaktoren (z. B. Kies versus Sand als Substrat, Kunststoffpflanzen versus lebende Pflanzen, niedriger und hoher Wasserdurchfluss) über verschiedene Arten und Landschaften (z. B. Aquarien und Terrester) zu untersuchen.

Protokoll

Die aktuelle Studie hat Die Zulassung und erfüllt alle Anforderungen der Tierpflege- und Gebrauchsprotokolle der Pennsylvania State University; IACUC-Nr. 46466.

1. Einrichtung des Präferenzgeräts

1. Erhalten Sie die Genehmigung des Tierschutzausschusses (oder einer gleichwertigen Organisation) des Instituts für alle Versuchs- und Haltungsverfahren, an denen lebende Tiere beteiligt sind, bevor Sie mit dem Experiment beginnen.
2. Verwenden Sie einen experimentellen Tank aus undurchsichtigem weißem Kunststoff. Die Wände zwischen den Zonen sind aus grauem Acryl gefertigt, das mit Silizium-Dichtmittel fixiert ist.
   HINWEIS: Die Größe des Versuchsbeckens hängt von der Größe der interessierten Arten und der Anzahl der verwendeten Personen ab (z. B. wird für 8 erwachsene Zebrafische ein Tank von 76 cm L x 76 cm B x 30 cm H empfohlen).
3. Teilen Sie den Versuchsbehälter in vier Zonen auf, die je nach den zu prüfenden spezifischen Lebensraumparametern variieren. Beispiele für verschiedene Arten der zu untersuchenden Anreicherung sind sandiges vs. felsiges Substrat, künstliche Pflanzen vs. Schutzräume oder Wasserfluss vs. Vorhandensein künstlicher Pflanzen (Abbildung 1).
   1. Wenn Sie den Wasserfluss als Parameter von Interesse verwenden, verwenden Sie kleine Pumpen, um Wasserstrahlen zu liefern (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie die Pumpen auf eine gewählte Geschwindigkeit ein, sodass sie einen konstanten und gerichteten Wasserfluss gewährleisten. Wählen Sie die gewünschte Geschwindigkeit basierend auf der Ökologie und Lebensgeschichte der Arten (z.B. 14 cm/s für Zebrafische).
4. In der Mitte des experimentellen Tanks, haben eine zentrale Arena, wo Lebensmittel geliefert werden (Abbildung 1). Der Zugang zur zentralen Arena von jeder Zone ist durch eine kleine Öffnung in den Trennwänden. Die Öffnung ist groß genug, damit sich die Interessensarten ungehindert zwischen den Zonen bewegen können, aber klein genug, um visuelle Hinweise zu reduzieren, die die Fische aus anderen Zonen erleben könnten.
5. Legen Sie einen Biofilter und eine Heizung in jede Ecke des Tanks, aber außerhalb des Versuchsbereichs, um den Wasserfluss nicht zu stören und eine konstante Wassertemperatur über alle Zonen hinweg zu gewährleisten.
6. Richten Sie zusätzliche Versuchstanks ein, wie es der Weltraum vorschreibt. Drehen Sie die verschiedenen Zonen in jedem Versuchsbehälter, um sequenzielle Verzerrungen zu begrenzen. Stellen Sie sicher, dass alle Replikationstanks einheitliche Bedingungen aufweisen (gleiche Lichtverhältnisse, Wassertemperatur usw.)
7. Platzieren Sie Kameras (siehe Materialtabelle)auf Stativen direkt über jedem Versuchsbehälter, damit alle Zonen sichtbar sind. Vermeiden Sie Weitwinkellinsen und stellen Sie sicher, dass die Speicherkarten genügend Platz für die Aufnahme haben.
8. Stellen Sie die Raumbeleuchtung schrittweise (z.B. 1/2 h) 12 L: 12 D-Zyklus ein, um Sonnenaufgang und Sonnenuntergang zu simulieren. Halten Sie die Wassertemperatur bei 25 °C bei 1 °C.

2. Erfassung, Akklimatisierung und Verfahren

1. Halten Sie Fische in heimischen Tanks auf, wenn sie nicht getestet werden. Alle Testfische aus ihren heimischen Tanks und platzen in der Mittelarena des Versuchstanks (Tag 1). Minimieren Sie die Aufnahmezeiten, um Stress zu reduzieren (z. B. weniger als 30 s).
   HINWEIS: Ein alternatives Verfahren für die Übertragung von Fischen aus ihrem Heimattank in den Versuchstank, die Stress minimieren kann, ist der Transport der Fische in einem Becher mit Tankwasser.
2. Halten Sie die Anzahl und das Geschlecht der Fische in jedem Versuchsbecken konstant über Replizierungstanks und wählen Sie basierend auf der Artengröße und Ökologie.
3. An den Tagen 1–4 verbringen Fische Zeit damit, sich zu akklimatisieren und die verschiedenen Zonen zu erkunden. Sammeln Sie an diesen Tagen keine Daten.
   ANMERKUNG: Erweitern oder reduzieren Sie die Anzahl der Tage für die Akklimatisierung in Abhängigkeit vom jeweiligen experimentellen Protokoll. Die Eingewöhnungszeit sollte jedoch ausreichen, um die Auswirkungen der Handhabung zu minimieren und die Fische an die Fütterung im Gerät zu gewöhnen.
4. Überwachen Sie während der Akklimatisierungsphase die Wasserqualität genau, indem Sie regelmäßige Wasserqualitätstests (z. B. pH-, Nitrat- oder Nitritwerte) durchführen und das Wasser ersetzen, wenn Probleme festgestellt werden (siehe Materialtabelle).
5. Füttern Sie die Fischflockenfutter (siehe Tabelle der Materialien) in der zentralen Arena mit einem schwimmenden Nahrungsring (siehe Tabelle der Materialien) an der Wand der zentralen Arena an der Wasseroberfläche befestigt. Ein Lebensmittelring sorgt dafür, dass Lebensmittelpartikel in der zentralen Arena bleiben und keine Verzerrung für Zonen aufgrund von Nahrungsdriften darstellen.
6. Geben Sie dem Fisch .5 h ad libitum zu füttern, bevor Sie die übrig gebliebenen Lebensmittel aus dem Versuchsbecken mit einem Tauchnetz entfernen. Füttern Sie die Fische einmal am Morgen und einmal am Nachmittag.
7. Bewerten Sie das Verhalten an den Tagen 5–7. Schalten Sie die Kameras ein und zeichnen Sie das Fischverhalten für 2 stunden nach jedem geplanten Morgen- und Nachmittagsfutter auf. Am 8. Tag alle Fische mit einem Tauchnetz aus den Versuchsbecken entfernen und wieder in ihre heimischen Tanks legen.
8. Je nachdem, wie viel Sumpfwasser zur Verfügung steht, ersetzen Sie mindestens ein 1/3 des Wassers im Versuchstank durch frisches Sumpfwasser, um die Auswirkungen von Stresshormonen auf Fische in folgenden Wiederholungen zu reduzieren.
9. Richten Sie die Versuchstanks gemäß dem Zonenrotationszeitplan für diese Woche ein. Das Drehen der Zonen verringert die Wahrscheinlichkeit einer Verhaltensverzerrung, die durch die Platzierung einer beliebigen Zone relativ zueinander auftritt. Dann beginnen Sie den Testprozess wieder mit einer neuen Charge Fisch.

3. Messungen und Datenanalyse

1. Laden Sie die Videos am Ende jedes Aufnahmetages auf einen Computer herunter. Dadurch wird sichergestellt, dass vor jedem Gebrauch Platz auf der Speicherkarte vorhanden ist.
2. Verwenden Sie Videosoftware (siehe Tabelle der Materialien), um die Zoneneinstellungen zu quantifizieren. Zählen Sie manuell die Anzahl der Fische in jeder Zone in 5 minuten Intervallen in jedem 2-Stunden-Aufzeichnungszeitraum (die zentrale Arena in diese Zählungen einzubeziehen). Definieren Sie das Geschlecht der Fische während der Analyse, wenn eine Differenzierung zwischen Männchen und Weibchen aus dem Videomaterial möglich ist.
3. Um die Habitatpräferenz zu analysieren, berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Fische pro Zone für jeden Replizierungstank (d. h. alle Daten über die 3 Tage durchschnittlich). Um eine Präferenzbewertung für die Strukturverwendung zu erhalten, berechnen Sie Densonderindex¹⁵
   
   J = (r_x x - p)/[(r_x + p) – 2*r_x*p]
   
   wobei x die Zone des Interesses ist, r _x das Verhältnis von Fisch in Zone x zur Gesamtzahl der Fische in allen Zonen und p der verfügbare Anteil aller Zonen im Versuchsbecken. Der Index liegt zwischen +1 für maximale Präferenz und 1 € für maximale Vermeidung.
4. Um festzustellen, ob sich die Geschwindigkeit, mit der Fische während eines Beobachtungszeitraums zwischen den Zonen wechseln, ändert, berechnen Sie die Schaltrate r_srin der ersten und letzten 5 min jedes_{Beobachtungszeitraums,} wobei rsr die Häufigkeit ist, mit der ein Fisch aus der zentralen Arena in jede Zone eindringt, dividiert durch die Gesamtzahl der Fische.
5. Betrachten Sie einen Fisch, der in eine Zone eingedrungen ist, wenn der ganze Körper des Fisches durch die Öffnung kreuzt, die die Zonen trennt. Berechnen Sie eine Anfangs- und eine endende mittlere Schaltrate für jeden Replikationstank. Führen Sie alle Verhaltensbeobachtungen durch denselben Experimentator durch, um jede Voreingenommenheit der Experimentierbeobachtung zu reduzieren.
6. Führen Sie mit Hilfe statistischer Software (siehe Tabelle der Materialien) relevante statistische Analysen durch. Vorgeschlagene Analysen umfassen eine einseitige ANOVA mit Präferenzindex als abhängige Variable und Zone als Prädiktorvariable und einen gekoppelten t-Test auf der Anfangs- und Endwert-Wechselrate für jeden Tank.
7. Wenden Sie Tukeys Multiple-Vergleich-Post-hoc-Test an, um Zonenvergleiche weiter zu untersuchen, bei denen jede Zone miteinander verglichen wird. Komplexere statistische Analysen umfassen gemischte Modelle, die Zeiteffekte, Arenaeffekte, Geschlechtseffekte oder sogar individuelle Verhaltensunterschiede bewerten.

Ergebnisse

Wir nutzten den Präferenztest, um Die Wohnpräferenzen bei Zebrafischen zu untersuchen, die zwischen unterschiedlicher Anreicherung einschließlich 1) Kunststoffpflanzen und sandigem Substrat wählen; und 2) Wasserdurchfluss. Diese wurden in vier Zonen unterteilt: (i) Nur angereichert; ii) Nur Fluss; iii) Angereichert und fließend; iv) Ebene; und eine zentrale Arena, wo Essen geliefert wurde¹⁹. Zebrafische zeigten die höchste Präferenz für die Enriched and Flow Zone, die sich deutlich von allen ander...

Diskussion

Hier präsentieren wir ein experimentelles Design, das es uns ermöglicht, die Präferenzen von Fischen für verschiedene Arten von Lebensräumen zu untersuchen. Einige wichtige Schritte, die bei Präferenztests wichtig sind, sind: 1) Gewährleistung, dass einheitliche Bedingungen über verschiedene Repliken hinweg aufrechterhalten werden (z. B. externe Geräusche oder Bewegungen, Experimentatoren, Wasserchemie, Lichtpegel); 2) sicherstellung, dass die Zonen zwischen Wiederholungen gedreht werden und eine erhebliche Menge Wasser ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Künstliche Aquarienpflanzen	Smarlin	B07PDZQ5M5
Künstliche Algen Wasserpflanzen für Aquarium	MyLifeUNIT	PT16L212
Versuchsbecken	United States Plastic Corporation	6106
Schwimmender Futterring	SunGrow	B07M6VWH9V
Durchflussmesser	YSI	BA1100
Jäger Aquarium Thermostat Heizung	Ehiem	3619090
Master Wasserqualität Test Kit	API	34
SPSS Statistik für Macintosh	IBM	Version 25.0
Tauchpumpe, SL-Songlong		SL-381
TetraMin Tropical Flakes	Tetra	16106
Triple Flow Corner Biofilter	Lee's	13405
Videokamera	Coleman	TrekHD CVW16HD
Windows Media Player (Videosoftware)	Microsoft	Windows Media Player 12