Prenylierung ist eine wichtige Modifikation an peripheren Membranbindungsproteinen. Insektenzellen können manipuliert werden, um farnesylierte und carboxymethylierte KRAS4b in Mengen zu produzieren, die biophysikalische Messungen von Protein-Protein- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen ermöglichen
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Methodenartikel
Vollverarbeitetes rekombinantes KRAS4b: Isoliert und charakterisieren das farnesylierte und methylierte Protein
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Proteinpränylierung ist eine wichtige Modifikation, die für die Ausrichtung von Proteinen auf intrazelluläre Membranen verantwortlich ist. KRAS4b, das bei 22% der menschlichen Krebsarten mutiert ist, wird durch Farnesylierung und Carboxymethylierung durch das Vorhandensein eines CAAX-Boxmotivs am C-Terminus verarbeitet. Ein technisches Baculovirus-System wurde verwendet, um farnesylierte und carboxymethylierte KRAS4b in Insektenzellen auszudrücken und wurde zuvor beschrieben. Hier beschreiben wir die detaillierte, praktische Reinigung und biochemische Charakterisierung des Proteins. Insbesondere wurden Affinität und Ionenaustauschchromatographie verwendet, um das Protein auf Homogenität zu reinigen. Intakte und native Massenspektrometrie wurde verwendet, um die korrekte Modifikation von KRAS4b zu validieren und die Nukleotidbindung zu überprüfen. Schließlich wurde die Membranassoziation von farnesylierter und carboxymethylierter KRAS4b zu Liposomen mittels Oberflächen-Plasmonresonanzspektroskopie gemessen.
Einleitung
Posttranslationale Modifikationen spielen eine Schlüsselrolle bei der Definition der funktionellen Aktivität von Proteinen. Modifikationen wie Phosphorylierung und Glykosylierung sind gut etabliert. Lipidmodifikationen sind jedoch weniger gut charakterisiert. Es wird geschätzt, dass bis zu 0,5% aller zellulären Proteine pränylatiert sein können1. Pränylierung ist die Übertragung eines 15-Kohlenstoff-Farnesyls oder einer 20-Kohlenstoff-Geranylgeranyl-Lipidkette auf ein Akzeptorprotein, das das CAAX-Motiv2enthält. Pränylate Proteine wurden in das Fortschreiten mehrerer menschlicher Krankheiten verwickelt, einschließlich vo....
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Protokoll
1. Proteinreinigung
- Vorbereiten der Puffer A–H, wie in Tabelle 1zu sehen ist.
| Pufferlösung | Puffer-Agent (alle 20 mM) | pH | NaCl (mM) | Imidazol (mM) | MgCl2 | TCEP |
| Eine | HEPES | 7.3 | 300 | - | 5 | 1 |
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Ergebnisse
Eine der größten Variablen im Protokoll ist die Menge des exprimierenden Zielproteins (His6-MBP-tev-KRAS4b). Dieses Protokoll wurde unter Verwendung eines Isolats aus einer Trichoplusia ni-Zelllinie, Tni-FNL17, entwickelt, das für das Suspensionswachstum angepasst und aus Serum entwöhnt wurde. Angesichts der vielzahl von Ergebnissen, die über die verschiedenen Insektenzelllinien mit dem Baculovirus-Expressionssystem berichtet werden, ist es ratsam, Dass Tni-FNL zumindest anfangs verwendet.......
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Diskussion
Wie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse erwähnt, ist der wichtigste Schritt während der Reinigung die Handhabung der Probe während der Zeit, in der sie sich in geringerem Salz befindet. Die Begrenzung der Zeit, die die Probe weniger als 200 mM NaCl ausgesetzt ist, trägt dazu bei, die Niederschlagsmenge zu reduzieren und die Probenausbeute zu erhöhen. Die Interpretation der Ergebnisse der CEX kann schwierig sein, wenn das Profil nicht den Erwartungen entspricht (siehe Abbildung 2). Bis das.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Wir würdigen die Unterstützung des Klonens und der Ausdruckshilfe von Carissa Grose, Jen Melhalko und Matt Drew im Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Dieses Projekt wurde ganz oder teilweise mit Bundesmitteln des National Cancer Institute, National Institutes of Health, im Rahmen des Vertrags Nr. HHSN261200800001E. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des Department of Health and Human Services wider, noch impliziert die Erwähnung von Handelsnamen, kommerziellen Produkten oder Organisationen eine Billigung durch die US-Regierung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,8 mL Safe-Lock Röhrchen, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Fläschchen | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin (POPC) | AVANTI POLARE LIPIDE | 850457 als flüssige Aktien kaufen in Chloroform | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serin (POPS) | AVANTI POLARE LIPIDE | 840034 Kauf als flüssige Aktien in Chloroform | |
| 5427R Zentrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitril, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammoniumacetat | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argongas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Dichtungen, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultraschallbad | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Säule für Kationenaustauschchromatographie (CEX) | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose |
| Hochleistungs-CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Massenspektrometer | Thermo Scientific | ||
| Ameisensäure | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Verwendung Reagenzienqualität oder besser |
| Gilson Fläschchen 7x14 mm Röhrchen | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Fläschchen aus Glas mit Schraubgewinde und PTFE-Schaumauskleidungen | Scientific Specialities | B69302 | |
| Hochgeschwindigkeits-/Tischzentrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | mit einer Kapazität von bis zu 4.000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV)-Protease | Addgene | 92414 | gereinigt gemäß Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (Hrsg.) Heterologe Genexpression in E.coli. Methoden in der Molekularbiologie, Bd. 1586. Humana Press, New York, NY |
| Säule für immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| Interne Wasserversorgung, Arium Advance | Sartorius Stedim | Widerstand von 18 MΩ | |
| mit Halterung | AVANTI POLAR LIPIDS 610023 | ||
| Flüssigstickstoff | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH Mikrofluidisierer | Mikrofluidik | ||
| MabPac RP UHPLC-Säule, 4 μm, 3,0 x 50 mm | Thermo Scientific | ||
| , 300 μm, 2,1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran Software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatographie System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatographie System |
| Protease Inhibitor Cocktail ohne EDTA oder andere Chelatoren | Millipore Sigma | P8849 | |
| Gummikappen Typ 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Serie S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spektrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorption bei 280 nm |
| Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten, 10 K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES-Membran |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Zentrifugenfilter | Amicon | UFC501024 | |
| Ultrazentrifuge | Beckman Coulter | Optima - L80K | mit einer Kapazität von 100.000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pumpe, Column Hearter und LC-System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Wasser, HPLC-Qualität | Sigma-Aldrich | 270733-1L | Kann eine hauseigene Wasserquelle verwenden (siehe unten) |
| Whatman GD/XP PES 0,45 mm Spritze Filter | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | Proteomik-Software |
Referenzen
- Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
- Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.
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Nachdrucke und Genehmigungen
