Methodenartikel

LINE-1 Methylierungsanalyse in mesenchymalen Stammzellen, die mit Osteosarkom-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden

DOI:

10.3791/60705

⸱

1. Februar 2020

 ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, 2Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschrieben wird hier die Verwendung einer methylierungsspezifischen Sondenverstärkungsmethode zur Analyse der Methylierungvon LINE-1-Elementen in mesenchymalen Stammzellen, die mit osteosarkomabgeleiteten extrazellulären Vesikeln behandelt werden. Ultrazentrifugation, ein beliebtes Verfahren zur Trennung extrazellulärer Vesikel vom fetalen Rinderserum, wird ebenfalls demonstriert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Methylierungsspezifische Sondenverstärkung (MSPA) ist eine einfache und robuste Technik, mit der relative Unterschiede in den Methylierungswerten von DNA-Proben erkannt werden können. Es ist einfallsreich, erfordert kleine Mengen an DNA und dauert etwa 4-5 h hands-on Arbeit. In der vorgestellten Technik werden DNA-Proben zunächst denaturiert und dann zu Sonden hybridisiert, die entweder auf methylierte oder Referenzstellen als Kontrolle abzielen. Hybridisierte DNA wird in parallele Reaktionen getrennt, eine unterzieht sich nur ligation und die andere wird ligation, gefolgt von der HhaI-vermittelten Verdauung in nicht methylierten GCGC-Sequenzen. Die resultierenden DNA-Fragmente werden durch PCR verstärkt und durch Kapillarelektrophorese getrennt. Methylierte GCGC-Standorte werden von HhaI nicht verdaut und erzeugen Spitzensignale, während nicht methylierte GCGC-Standorte verdaut werden und keine Spitzensignale erzeugt werden. Der Vergleich der kontrollnormalisierten Spitzen verdauter und unverdauter Versionen jeder Probe ergibt das Methylierungs-Dosierungsverhältnis einer DNA-Probe. Hier wird MSPA verwendet, um die Auswirkungen von Osteosarkom-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) auf den Methylierungsstatus von lang durchsetzten Kernelement-1 (LINE-1) in mesenchymalen Stammzellen zu erkennen. LINE-1 sind repetitive DNA-Elemente, die typischerweise bei Krebs hypomethyliert werden und in dieser Eigenschaft als Biomarker dienen können. Ultrazentrifugation wird auch als kostengünstige Methode verwendet, um extrazelluläre Vesikel von biologischen Flüssigkeiten zu trennen (d. h. bei der Herstellung von EV-erschöpftem fetalem Rinderserum [FBS] und der Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Osteosarkom-konditionierten Medien [Differentialzentrifugation]). Für die Methylierungsanalyse sind benutzerdefinierte LINE-1-Sonden für drei Methylierungsstandorte in der LINE-1-Promotorsequenz und sieben Kontrollstellen ausgelegt. Dieses Protokoll veranschaulicht die Verwendung von MSPA für die LINE-1-Methylierungsanalyse und beschreibt die Herstellung von EV-erschöpftem FBS durch Ultrazentrifugation.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-Methylierung ist eine wichtige epigenetische Modifikation, die in menschlichen Zellen auftritt. DNA-Methylierung bezieht sich auf die Verknüpfung von Methylgruppen mit Zytosinrückständen in CpG-Dinukleotiden. Solche Dinukleotide finden sich in der Regel in Clustern (CpG-Inseln) in der 5' Region der Gene1. In normalen Zellen existieren die meisten dieser Dinukleotide in einem unmethylierten Zustand, der eine DNA-Transkription ermöglicht. Übrigens sind viele Krebsarten mit hypermethylierten CpG-Inseln und transkriptomischer Silencing2verbunden, insbesondere in Tumorsuppressor-Genen, die wiederum zu verschiedenen Merkmalen von Krebs beitragen3.

Andererseits sind lange durchsetzte Kernelemente-1 (LINE-1s oder L1s) repetitive, transponierbare DNA-Elemente, die normalerweise einen hohen Methylierungsgrad auf CpG-Inseln aufweisen. Die Methylierung von LINE-1 verhindert die Translokation und trägt zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität bei. Bei mehreren Krebsarten wird LINE-1 hypomethyliert, was zu einer Aktivierung und anschließender retrotranspositionierter chromosomaler Instabilität4führt. LINE-1 macht fast 17% des menschlichen Genoms5aus, und sein Methylierungsstatus kann als Indikator für die globale genomische Methylierung6dienen. Globale LINE-1-Hypomethylierung gilt als vor dem Übergang von Zellen zu einem Tumor-Phänotyp7; daher verspricht sie als potenzieller Marker für den frühen Krebsbeginn.

Derzeit gibt es mehrere Methoden für die Methylierungsanalyse, einschließlich Pyrosequencing, methylierungsspezifischer PCR, Mikroarrays und Chromatin-Immunpräzipitation1. Die Verwendung der Sequenzierung der nächsten Generation hat es auch ermöglicht, genomweite Ansätze zum Nachweis der DNA-Methylierung zu integrieren. Viele dieser Methoden basieren auf bisulfitbehandelter DNA, bei der unmethylierte Zytosine in Uracil umgewandelt werden und methylierte Zytosine unverändert bleiben. Die Arbeit mit bisulfitbehandelter DNA hat jedoch mehrere Fallstricke, wie unvollständige Umwandlungen von nicht methylierten Zytosinen in Uracil, voreingenommene Amplifikation von Sequenzen und Sequenzierungsfehler8.

Bei der methylierungsspezifischen Sondenverstärkung (MSPA) zielen Sonden aus zwei Oligonukleotiden auf DNA-Sequenzen ab, die eine Restriktionsstelle (GCGC) für das methylierungsempfindliche Restriktionsenzym HhaI9enthalten. Nachdem die Sonden mit der DNA hybridisiert wurden, wird jede Probe in zwei Sätze unterteilt. Sonden im ersten Satz werden einer Ligation unterzogen, während Sonden im zweiten Satz einer Ligation unterzogen werden, gefolgt von der HhaI-vermittelten Verdauung an unmethylierten CGCG-Standorten. Beide Probensätze werden dann durch PCR verstärkt, und die Produkte werden durch Kapillarelektrophorese getrennt. Sonden an unmethylierten Standorten werden von HhaI verdaut und während der PCR nicht verstärkt, was zu keinen Spitzensignalen führt. Im Gegensatz dazu sind Sonden an methylierten Standorten vor der Verdauung geschützt und werden daher während der PCR verstärkt, wodurch anschließend Spitzensignale10erzeugt werden.

MSPA hat mehrere Vorteile gegenüber alternativen Methoden. Erstens benötigt es eine geringe Menge an DNA (50–100 ng) und eignet sich gut für die Analyse der DNA aus formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Proben10. Es erfordert keine Bisulfit-behandelte DNA; in der Tat, es ist ungeeignet für DNA, die auf diese Weise modifiziert wird. Viele Proben können gleichzeitig analysiert werden, und MSPA-Sonden können so konzipiert werden, dass sie mehrere Gene oder Sequenzen gleichzeitig zielen. Darüber hinaus sind die Sonden spezifisch und empfindlich für methylierte DNA, da die HhaI Restriktionsstelle einer Sequenz entspricht, die typisch für CpG-Inseln10ist.

Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von Osteosarkom (OS)-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln (EVs) auf die LINE-1-Methylierung in fettgewebeabgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (AT-MSCs; Abbildung 1). Elektrofahrzeuge sind nanoskalige, membrangebundene Vesikel, die von den meisten Zelltypen abgesondert werden. Sie tragen Proteine, Lipide, mRNA, microRNA und zusätzliche Moleküle aus den Elternzellen11,12. EVs vermitteln interzelluläre Kommunikation und spielen eine wichtige Rolle bei mehreren pathophysiologischen Bedingungen13,14. Eine aktuelle Studie zeigte, dass krebsverlesene Elektrofahrzeuge aktive S.1-V1 auf Empfängerzellen übertragen können15. Es wurde bereits berichtet, dass Elektrofahrzeuge aus der HOS-143B-Zelllinie den Methylierungsstatus von LINE-1 in MSCs verändern können, zusätzlich zu anderen genetischen Effekten16.

Beim Anbau von Zellen zur EV-Isolierung ist es wichtig, EV-dezimiertes fetales Rinderserum [FBS] im Wachstumsmedium zu verwenden, da FBS-abgeleitete Elektrofahrzeuge EVs aus anderen Quellen stören und die Ergebnisse17,18behindern können. Ultrazentrifugation ist eine der häufigsten Methoden zur Erschöpfung von Elektrofahrzeugen von FBS. Es ist ein relativ einfaches und kostengünstiges Verfahren im Vergleich zu Alternativen wieUltrafiltration und kommerzielle EV-erschöpftfb19 . Hier zeigt das Protokoll auch, wie EV-erschöpfte FBS durch Ultrazentrifugation vorbereitet werden.

Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die oben genannten Techniken vor, von der Isolierung von Elektrofahrzeugen von einer OS-Zelllinie bis zur Methylierungsanalyse von LINE-1 in OS-EV behandelten MSCs (Abbildung 1).

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Protokoll

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Diese Studie wurde von der Ethikkommission von Helsinki und Uusimaa Hospital District genehmigt (ethische Zulassung D. Nr. 217/13/03/02/2015).

1. Vorbereitung von EV-erschöpftem FBS durch Ultrazentrifugation

  1. Nehmen Sie FBS in (Ultra-)Zentrifugenröhren und legen Sie sie in Ultrazentrifugen-Eimer. Um sicherzustellen, dass die Ultrazentrifugation reibungslos und sicher abläuft, balancieren Sie die Eimer innerhalb von 10 mg voneinander.
  2. Laden Sie die Eimer auf einen schwingenden Rotor (Typ SW28, k-Faktor 246). Den Rotor in die Ultrazentrifuge legen und bei 100.000 x g bei 19 h bei 4 °C laufen.
  3. Sammeln Sie vorsichtig die helle obere Schicht des Überstandes (ca. neun Zehntel) und übertragen Sie sie auf ein 50 ml Rohr. Stören oder pipetten Sie das dunkelbraune Pellet nicht, da es EVs von FBS enthält.
  4. Übergeben Sie den Überstand durch einen 0,22 m Filter in ein neues 50 ml Rohr.
  5. Fügen Sie den filtersterilisierten, EV-erschöpften FBS zu Zellkulturmedien hinzu, wenn Zellen für die EV-Isolierung wachsen.

2. Isolierung von Osteosarkom-eVs

  1. Platten-OS-Zellen (HOS-143B-Zelllinie) in einem T-175-Kolben mit RPMI 1640 Medium, ergänzt durch 10% normale FBS und 1% Antibiotika (100 U/ml Penicillin, 0,1 mg/ml Streptomycin). Legen Sie den Kolben in einen Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.
  2. Wenn der Kolben 70% –80% konfluent ist, waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Saline (PBS) und wachsen Sie sie dann in Medien, die 10% EV-erschöpftes FBS enthalten (im Folgenden als EV-depleted media bezeichnet).
    HINWEIS: 1 x 106 HOS-143B-Zellen, die in einem T175-Kolben plattiert sind, erreichen 70% Konfluenz nach ca. 60 h.
  3. Während der nächsten 48 h, sammeln Konditionierte Medien aus Osteosarkomzellen nach 24 h und fügen Sie frische EV erschöpfte Medien.
  4. Zentrifugieren Sie das konditionierte Medium bei 2500 x g für 20 min bei 4 °C, um Zellen und Zellablagerungen zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre, so dass ca. 2 ml Medien am Boden bleiben.
    HINWEIS: Wenn sie in diesem Stadium nicht direkt mit der EV-Isolierung fortfahren, kann der Überstand bei -80 oC gelagert werden.
  5. Gießen Sie den Überstand in Ultrazentrifugenrohre und balancieren Sie sie wie früher. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 100.000 x g für 2 h bei 4 °C.
  6. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig und lassen Sie ca. 1 ml am Boden. Rund 20 ml PBS (0,1 m gefiltert) in das Rohr und die Pipette geben, um das EV-Pellet sanft zu waschen und wieder aufzuhängen.
  7. Balancieren Sie die Rohre und führen Sie eine weitere Runde der Ultrazentrifugation mit den gleichen Einstellungen.
  8. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und setzen Sie das EV-Pellet in 200 l PBS durch sanftes Pipettieren wieder auf. Bewahren Sie die Elektrofahrzeuge in niedrigverbindlichen Rohren auf.
    HINWEIS: Elektrofahrzeuge können sofort verwendet oder in -80 °C gespeichert werden, bis sie benötigt werden.

3. Charakterisierung von OS-EVs

HINWEIS: Gereinigte Elektrofahrzeuge können durch Western Blotting (WB), Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)16charakterisiert werden.

  1. Führen Sie WB gemäß dem Standardprotokoll16 mit den EV-Markern CD63, TSG101 und Hsp70 und mit Calnexin als Negativkontrolle aus, um die Reinheit der EV-Probe20anzuzeigen.
  2. Bei NTA wird zunächst die EV-Probe in 0,1 m gefilterten Dulbecco-PBS verdünnt, um (idealerweise) 30–100 Partikel pro Frame zu erhalten.
    1. Nehmen Sie ca. 500 l der Probe in eine 1 ml Spritze und laden Sie sie in den Einlassanschluss des NTA-Instruments. Prüfen Sie, ob pro Rahmen genügend Partikel für genaue Messungen vorhanden sind.
    2. Öffnen Sie die NTA-Software und zeichnen Sie fünf Videos mit einer Dauer von 60 s auf, indem Sie die Kamerastufe 13 bei Umgebungstemperatur verwenden. Verwenden Sie während der Analyse den Erkennungsschwellenwert = 5 und gain = 10.
  3. Analysieren Sie EV-Proben von TEM, wie zuvor beschrieben21.

4. AT-MSC-Kultur

HINWEIS: Menschliches Fettgewebe für die mesenchymale Stammzellisolierung wurde als Fettabsaugungaspirat bereitgestellt (Department of Plastic Surgery, Laser Tilkka Ltd., Finnland). Schriftliche Informierte Zustimmung wurde von den Lipoaspirat-Spendern, die sich einer elektiven Fettabsaugung unterzogen wurden, eingeholt.

  1. Isolieren Sie AT-MSCs von Fettabsaugungaspiraten mit Standard-Mechanischen und enzymatischen Isolationsmethoden22.
    HINWEIS: MSCs aus anderen Quellen (einschließlich kommerzieller Zelllinien) können ebenfalls verwendet werden.
  2. Kulturzellen in DMEM/F-12-Medien, ergänzt durch 10% FBS und 1% Antibiotika.

5. Behandlung von MSCs mit OS-EVs

  1. Platte 15.000 AT-MSCs pro Brunnen in einer 24 Well Platte.
  2. Nach 24 h die alten Medien entfernen, Zellen mit PBS waschen und auf EV-erschöpfte Medien umstellen.
  3. Behandeln Sie Zellen mit OS-EVs (bei einer Partikelkonzentration von 1 x 106 EVs pro Zelle) an Tag 1 (24 h nach Zelladhäsion), Tag 3 (48 h nach Tag 1) und Tag 5 (96 h nach Tag 1).
    1. Beenden Sie die OS-EV-Behandlung für Timepoint (TP) 0 Proben an Tag 1, TP 3 Proben an Tag 3 und TP 7 Proben an Tag 7 (48 h nach Tag 5).
      HINWEIS: Andere Zeitpläne gemäß den experimentellen Plänen können ebenfalls befolgt werden.
  4. Extrahieren Sie DNA aus den MSCs mit einer geeigneten Methode. Fügen Sie positive und negative Kontrollbeispiele für die Datenanalyse ein.

6. LINE-1-Methylierungstest

  1. Entwerfen Sie die kundenspezifischen LINE-1-Sondengrundierungen, wie sie zuvor von Pavicic et al.23durchgeführt wurden. Wählen Sie für Methylierungssonden drei Sequenzen aus, die die Hha-I-Einschränkungsstelle innerhalb des Promotorbereichs von LINE-1 enthalten. Wählen Sie für Kontrollsonden sieben Sequenzen aus, die nicht die HhaI-Einschränkungssite aus dem Rest der LINE-1-Sequenz entnehmen.
    HINWEIS: Die LINE-1-Sequenz ist in der GenBank-Datenbank24 (L1.2, Beitritts-Nr. AH005269.2). Verwenden Sie die Anweisungen des MSPA-Herstellers für die Konstruktion der Sonden25.
  2. 70 ng DNA-Probe im TE-Puffer auf ein Volumen von 5 l verdünnen.
  3. Führen Sie nachfolgende Thermocycling- und PCR-Schritte wie in Tabelle 1erwähnt. Die Proben 10 min bei 98 °C erhitzen, dann auf 25 °C abkühlen lassen.
  4. Fügen Sie jeder Probe 3 L Sondenhybridisierungsmix hinzu und führen Sie den Thermocycler aus, damit die Sonden mit der DNA hybridisieren können.
  5. Fügen Sie bei Raumtemperatur (RT) jeder Probe 13 L Nachhybridisierungsmischung hinzu. Übertragen Sie 10 l in ein zweites Rohr.
  6. Legen Sie beide Röhrensätze in den Thermocycler und brüten Sie mindestens 1 min bei 48 °C.
    1. Während die Proben bei 48 °C liegen, fügen Sie dem ersten Satz von Röhren (unverdaute Serie) und dem zweiten Satz von Röhren (verdauliche Serie) 10 l der Ligations-Verdauungsmischung hinzu. Führen Sie das nächste Thermocycler-Programm aus.
  7. Drehen Sie die Rohre herunter und stellen Sie gleichzeitig den Thermocycler auf 72 °C ein.
  8. Fügen Sie jedem Rohr 5 l Polymerase-Mix hinzu und legen Sie die Rohre in den Thermocycler. Führen Sie das PCR-Programm aus.
  9. Während das PCR-Programm läuft, bereiten Sie eine Lösung aus 1 ml Formamid vor, die einen Standard von 2,5 l enthält. Pipette 10 l dieser Lösung für jeden Brunnen einer optischen 96-Wellplatte (mit Barcode).
  10. Nach pcR die unverdauten und verdauten Proben auf 1:100 bzw. 1:200 in Reinstwasser verdünnen. Fügen Sie der 96-Well-Platte 2 L verdünntes PCR-Produkt hinzu. Zentrifugieren Sie die Platte bei 200 x g für 15–20 s, um Luftblasen zu entfernen.
  11. Durchführung der Fragmentanalyse von Proben durch Kapillarelektrophorese.
    HINWEIS: Die Platte sollte bis zur Analyse bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.

7. Fragmentdatenanalyse

  1. Öffnen Sie die Kapillarelektrophorese ergibt eine Elektropherogramm-Analyse-Software.
    1. Wählen Sie unter der Spalte Panel für eines der Beispiele MLPA aus dem Menü aus. Klicken Sie auf den Panel-Header und drücken Sie Strg+D, um MLPA auf alle Samples anzuwenden.
    2. Legen Sie auf die gleiche Weise die Analysis-Methode für alle Samples auf Microsatellite-Standard fest.
    3. Wählen Sie alle Samples aus und klicken Sie auf die Schaltfläche Grün spielen, um die Samples gemäß den gewählten Einstellungen zu analysieren.
    4. Wählen Sie alle Samples aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Graph, um die Sondenspitzen zu visualisieren.
    5. Zoomen Sie auf den Spitzenbereich für eine höhere Auflösung der einzelnen Sondenspitzen. Stellen Sie sicher, dass alle 10 Spitzen, die den Sonden des LINE-1-Sondenmixes entsprechen, beschriftet sind. Verwerfen Sie zusätzliche Spitzen (<95 bp und >160 bp).
    6. Exportieren Sie auf der Registerkarte Genotypes die Ergebnisse im CSV-Format (Comma-Separated-Values).
  2. Öffnen Sie die CSV-Datei in einer Datenanalysesoftware, und sortieren Sie die Daten in Spalten.
    1. Kennzeichnen Sie die drei Methylierungs-Standortspitzen auf der Grundlage ihrer ungefähren Größe (L1-1m bei 153 bp, L1-2m bei 119 bp, L1-3m bei 133 bp). Die restlichen sieben Spitzen entsprechen den Kontrollsonden.
      HINWEIS: Hier werden Werte der L1-2m-Sondenspitzen verwendet, die eine Größe von 117 bp haben, da diese Region in den meisten LINE-1-Methylierungstests23verwendet wurde.
    2. Berechnen Sie für jede Probe (unverdaute und verdauliche) die Summenspitzenfläche aller sieben Kontrollspitzen. Teilen Sie den Spitzenbereich jeder LINE-1-Sonde durch diese Summe.
    3. Teilen Sie für jede DNA-Probe den Wert der verdauten Probe durch den Wert der unverdauten Probe, um das Methylierungsdosisverhältnis (DM) unter Verwendung der folgenden Gleichung zu erhalten:
      figure-protocol-1
      Wobei: DM ist Methylierungs-Dosierungsverhältnis, Ax ist die Fläche unter Peak x (z. B. L1-2m Peak), und AStrg ist die Summe Spitzenfläche aller sieben Kontrollsonden.

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Ergebnisse

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Das Hauptziel dieser Studie war es, die epigenetischen Wirkungen von OS-EVs auf MSCs zu bewerten. OS-EVs wurden aus HOS-143B-Zellen mit der Standard-Differentialzentrifugationsmethode isoliert. Der Ausdruck der typischen EV-Marker CD63, Hsp70 und TSG101 durch Western Blotting bestätigte das Vorhandensein von OS-EVs. (Abbildung 2A). Das Fehlen eines Calnexin-Signals deutete auf die Reinheit des OS-EV-Isolats hin. Zusätzliche Reinheitsangaben wurden bei TEM beobachtet, wobei i...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie zeigt, wie MSPA verwendet werden kann, um den Methylierungsstatus eines bestimmten genetischen Elements zu erkennen und zu quantifizieren. LINE-1 stand hier im Mittelpunkt, aber die Sonden können so konzipiert werden, dass sie auf eine Reihe von Genen und Sequenzen abzielen. Darüber hinaus gibt es eine wachsende Liste von Sondenmischungen, die für verschiedene Anwendungen verfügbar sind. MSPA ist eine einfache und robuste Technik für die DNA-Methylierungsanalyse, die keine Bisulfitumwandlung

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch die Projektförderung der Universität Helsinki (WBS490302, WBS73714112) gefördert. Maja-Lisa Selander Fund (Minerva Foundation). Wir danken Walter Pavicic für die Bereitstellung des modifizierten MSPA-Protokolls und für den damit verbundenen technischen Support. Wir danken Teemu Masalin (Universität Helsinki) für die Unterstützung bei der Videoproduktion.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1 mL SpritzeTerumoSS+01T1für NTA
24-Well-PlatteCorning3524MSC Zellkultur
3730XL DNA AnalyzerApplied Biosystems, ThermoFisher Scientific3730XL
50 mL ZentrifugenröhrchenCorning430829
Beckman Optima LE-80K UltrazentrifugeBeckman
BlueStar Prestained ProteinMarker Nippon GeneticsMWP03WB: Proteinmarker
Calnexin (Klon C5C9)Cell Signaling Technology2679WB, Verdünnung 1:800
CD63 (Klon H5C6)BD Biosciences556019WB, Verdünnung 1:1000
Zentrifuge 5702 REppendorf5703000010Für konditionierte Medien und Zellen
Zentrifuge 5810Eppendorf5810000010Zum Schleudern von 96-Well-Platten
Zentrifugenröhrchen (Polyallomer, 14x95 mm)Beckman331374Ultrazentrifugation
DMEM/F-12 + GlutaMAX mediumGibco, Life Technologies31331-028Für AT-MSC-Kultur
Fötales RinderserumGibco, Life Technologies10270-106
GeneScan 500 LIZ GrößenstandardAngewendet Biosystems, Life Technologies4322682für Kapillarelektrophorese
GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) KitSigmaWGA2-10RXNfür die MSPA-Negativkontrolle
Hi-Di-FormamidApplied Biosystems, Life Technologies4311320für die Kapillarelektrophorese
HOS-143B ZelllinieATCCCRL-8303
Hsp70 (Klon 5G10)BD Biosciences554243WB, Verdünnung 1:1000
IRDye 800CW Ziege Anti-MausLi-Cor926-32210WB: sekundär
IRDye 800CW Ziege Anti-KaninchenLi-Cor926-32211WB: sekundäre
LINE-1 Sonden-Mix-PrimerIDTSequenzen in Tabelle 1
MicroAmp Optische 96-Well-Reaktionsplatte mit BarcodeApplied Biosystems, Life Technologies4306737erfordert auch Versiegelungsfolie
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23235Messung der Proteinkonzentration
MiniProtean TGX 10% GeleBio-Rad456-1034WB: Gelelektrophorese
NanoSight LM14CMalvern Instrumentsfor NTA
Nitrocellulosemembran 0,2 & Mikro; mBio-Rad1620112WB: Proteintransfer
NucleoSpin Tissue XSMacherey-Nagel740901.50für die DNA-Extraktion
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000WB: Blockierung, Antikörper
PBS, 1XCorning21-040-CVR
Penicillin-StreptomycinGibco, Life TechnologiesDE17-602EAntibiotika für Nährmedien
Protein LoBind Röhrchen, 0,5 mLEppendorf22431064Zur Aufbewahrung von Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution KitLi-Cor926-11015WB: Gesamtproteinfärbung
RKO ZelllinieATCCCRL-2577für MSPA Positivkontrolle
RPMI Medium 1640 + GlutaMAXGibco, Life Technologies61870-010Für HOS-143B Zellkultur
SALSA MLPA HhaI EnzymMRC-HollandSMR50
SALSA MLPA ReagenzienkitMRC-HollandEK1-FAM
SALSA MLPA P300 Sonde-MixMRC-HollandP300-100R
Schwingrotor SW-28Beckman Coulter342207Ultrazentrifugation
Spritzenvorsatzfilter, 0,22 & Mikro; mJet BiofilFPE-204-030Sterilfiltration FBS
Tecnai 12FEI Companyausgestattet mit Gatan Orius SC
1000B CCD-Kamera
(Gatan Inc., USA); für TEM
TBS, 1X TablettenMedicago09-7500-100WB: Puffer
Trans-Blot TurboBio-RadWB: Transfer
ThermocyclerThermoFisher Scientific
TrypLE ExpressGibco12604-021zur Trypsinisierung von Zellen
TSG101 (Klon 4A10)SigmaSAB2702167WB, Verdünnung 1:500
TCA0096

Referenzen

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