Ärmel-Gastrektomie bei Mäusen mit chirurgischen Clips

Zusammenfassung

Die Prävalenz von Diabetes und Adipositas nimmt weltweit kontinuierlich zu. Die Mechanismen zwischen Diabetes, Adipositas und der damit verbundenen Sterblichkeit und Komorbiditäten müssen weiter untersucht werden. Hier stellen wir ein Protokoll zur Hülsengastrektomie (SG) bei Tieren als unkompliziertes präklinisches Modell der bariatrischen Chirurgie vor.

Zusammenfassung

Die Zahl der Übergewichtigen und Fettleibigen nimmt sowohl in der Erwachsenen- als auch in der Jugendbevölkerung kontinuierlich zu. Dies fällt mit dem erhöhten universellen Phänomen von Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen Stoffwechselproblemen zusammen. Bariatrische Chirurgie, wie SG, ist derzeit eine der effektivsten und am häufigsten verwendeten Langzeitbehandlung für Adipositas und T2D, aber der Zusammenhang zwischen ihnen ist noch nicht vollständig erforscht. Die Mechanismen, die den Ergebnissen nach der bariatrischen Operation beim Menschen zugrunde liegen, können auf der Grundlage präklinischer Tierstudien untersucht werden. Die SG reduziert Körpergewicht, Glukosespiegel und viele metabolische Parameter, und ist einfach mit einer geringen Inzidenz von Komplikationen durchzuführen. Ziel dieser Arbeit ist es, Forschern eine einfache Methode und ein unkompliziertes präklinisches Modell der bariatrischen Chirurgie bei Tieren zur Verfügung zu stellen.

Einleitung

Die Prävalenz von Adipositas hat sich seit 1975 weltweit fast verdreifacht. Im Jahr 2016 waren mehr als 1,9 Milliarden Erwachsene über 18 Jahre übergewichtig und über 650 Millionen Erwachsene fettleibig. Die Prävalenz von T2D in der erwachsenen Bevölkerung hat sich ebenfalls von 4,7 % auf 8,5 % verdoppelt, wobei die Zahl zwischen 1980 und 2014 weltweit von 108 Millionen auf 422 Millionen Erwachsene gestiegen ist¹. Die meisten bariatrischen Operationen führen zu signifikanten Gewichtsverlust, eine Verringerung des Körperfetts, und Verbesserung der Glukosetoleranz, Insulinresistenz und Diabetes-Kontrolle². Neben Gewichtsverlust und Remission von T2D, bariatrische Chirurgie produziert weitere gesundheitliche Vorteile wie Bluthochdruck Kontrolle und eine geringere Inzidenz von bestimmten Arten von Adipositas im Zusammenhang mit Krebs Entwicklung und Progression³. Die bariatrische Chirurgie induziert auch eine dauerhafte vollständige, partielle Remission von T2D und verringert das Risiko für eine zehnjährige schwere koronare Herzkrankheit (CHD) und ein gewisses Maß an zerebrovaskulärem Risiko. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nicht vollständig verstanden⁴.

Es gibt mehrere Verfahren für bariatrische/metabolische Chirurgie. Sowohl restriktive als auch gastrointestinale Bypass-Operationen bieten positive Auswirkungen auf den Stoffwechsel⁵. Von den bariatrischen chirurgischen Modellen haben SG und modifizierter Roux-en-Y Magenbypass einen höheren Erfolg und niedrigere Sterblichkeitsraten und zeigen zuverlässige restriktive und gastrointestinale Bypass-Chirurgiemodelle bei Mäusen⁶. Obwohl die Magen-Darm-Bypass-Operation bietet mehr Gewichtsverlust und eine signifikante Verbesserung der Glukosetoleranz und Lebersteatose als das restriktive Verfahren auf lange Sicht, die SG produziert immer noch eine gute Kontrolle des Körpergewichts und Glukosespiegel und ist leicht mit einer geringen Inzidenz von Komplikationen durchzuführen⁶. Der Anteil der SG stieg von 30% auf 54% und Roux-en-Y Magenbypass-Chirurgie sank von 52% auf 32% von 2008 bis 2014⁷. Derzeit ist laparoskopische SG das am häufigsten durchgeführte bariatrische Verfahren auf nationaler Ebene innerhalb akademischer Zentren in den Vereinigten Staaten⁸. Obwohl es viele veröffentlichte Berichte über die pathophysiologischen Prozesse zwischen bariatrischer Chirurgie, Diabetes und Adipositas gibt, brauchen wir weitere Tierversuche, um unbekannte Mechanismen weiter zu erforschen.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine tiertierische Methode zu entwickeln, um die Mechanismen zu untersuchen, die den Ergebnissen nach bariatrischen Operationen beim Menschen zugrunde liegen. Die aktuelle translationale Studie kann Erkenntnisse über den Mechanismus der Adipositas und T2D-Behandlung von der SG liefern.

Protokoll

Alle Verfahren für die Tierverwendung wurden vom National Yang-Ming University Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt und entsprachen dem "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals". ^8. Auflage, 2011". Das anästhetische Verfahren wurde gemäß der Richtlinie für die Schmerzkontrolle, Anästhesie, präoperative und postoperative Versorgung der Versuchstiere von der National Yang Ming University, ICAUC-016, 2015,^1. Auflage durchgeführt.

1. Tierzubereitung

1. Erhalten Sie 20 8 Wochen alte wilde Typ C57BL/6 männliche Mäuse aus dem National Laboratory Animal Center (NLAC), die etwa 16-18 Gramm wiegen. Ordnen Sie diese Mäuse zufällig der SG oder der Schein-Operationsgruppe mit jeweils 10 Mäusen zu.
2. Starten Sie die Mäuse auf Chow oder eine fettreiche Ernährung (siehe Ergänzungsdatei) vor der bariatrischen oder Scheinoperationen⁹. Produzieren Sie ernährungsbedingte Fettleibigkeit mit mindestens 2 präoperativen Wochen der HFD.
3. Beherbergen Sie die Mäuse im National Yang-Ming University Laboratory Animal Center unter einem helldunklen Zyklus von 12:12 mit Lichtbeginn um 07:00 A.M. und lassen Sie die kostenlose Fütterung an Standard-Nagetier Chow und Wasser.
4. Beschränken Sie alle Tiere von der Nahrung, aber erlauben Sie freien Zugang zu Wasser in der Nacht vor der Operation.

2. Allgemeine präoperative Präparation

1. Fasten Sie die Mäuse für mindestens 6 Stunden vor der Operation. Induzieren Anästhesie in einer Induktionskammer mit 5% Isofluran und Sauerstoff (beide 3-4 L/min).
   1. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, um sicherzustellen, dass die Pinch-Stimulation (stumpf gekrümmte gezackte glatte Mikrozange) der Hinterpfote, der Vorderpfote und des Ohrs keinen motorischen Reflex hervorruft. Verabreichen Sie Antibiotika (25 mg/kg Cefazolin) durch subkutane Injektionen vor der Operation.
2. Weisen Sie eine bestimmte Arbeitszone für chirurgische Eingriffe zu. Reinigen Sie den Operationsbereich und besprühen Sie den OPERATIONStisch vor einer Operation mit 75% Alkohollösung.
3. Die Maus in den Nasenkegel legen und anästhesien mit 2% Isofluran (2 L/min) und Sauerstoff (4 L/min) erhalten.
4. Für Hülsengastrektomie und Scheinoperation, nach Bestätigung der entsprechenden Tiefe der Anästhesie durch Zehenstimulation, wenden Sie das 0,2% Carbomer Augengel auf die Augen der Maus an, um trockene Augen zu verhindern.
5. Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer, um Haare vom Bauch bis zum Brustbein zu rasieren. Entfernen und reinigen Sie das restliche Haar mit einer Enthaarungscreme. Platzieren und fixieren Sie die Maus auf den OPERATIONStisch in einer Supine-Position.
6. Desinfizieren Sie die Bauchwand der Maus mit Povidon-Jod-Lösungen abwechselnd mit 75% Alkohol für 3 Anwendungen.

3. Sleeve-Gasttrektomie und Schein-Verfahren

1. Mediane Laparotomie
   1. Verwenden Sie eine Mikroschere, um einen 1-1,5 cm langen Mittellinienschnitt am Oberbauch zu machen.
2. Magen- und Darmexternalisierung
   1. Führen Sie das SG-Verfahren mit Hilfe eines Lupensizierendes Mikroskops oder einer Lupe aus, um unvorhersehbare Blutungen und hypovolämische Schocks zu verhindern.
   2. Verwenden Sie zwei gekrümmte glatte gezackte Mikrozangen, um den Magen sanft zu bewegen und vollständig externisieren.
   3. Teilen Sie das gastrosplenische Band, das den linken Magen mit der Milz verbindet, vorsichtig mit einer Baumwollsonde und Elektrokauterie nach Bedarf, wodurch der Magenfundus von der umgebenden Milz und anderen inneren Organen seziert wird.

4. Magenisolierung und Clip

HINWEIS: Die SG für Mäuse wurde mit der neuen Clip-Applier-Technik durchgeführt, wie zuvor veröffentlicht¹⁰.

1. Dehnen Sie den Fundus und pylorus des Magens sanft und seitlich mit Zangen, identifizieren Sie die Mittellinie (Abbildung 1 und Abbildung 2), und tragen Sie vorsichtig chirurgische Clips auf die Hälfte der medialen Seite der Magenmittellinie von der gastroösophagealen Kreuzung minderwertig und der unteren Pol überlegen auf. Klemmen und schließen Sie etwa 75-80% des Magens aus, wodurch die gesamte seitenärmelige Hülse des Magens entsteht(Abbildung 1 und Abbildung 2).
2. Bewegen Sie den Darm auf die nackte Haut auf der Seite und bedecken Sie es mit einer warm-saline befeuchteten Gaze und führen Sie intraperitoneale Hydratation nach Bedarf, um Dehydrierung und Unterkühlung zu verhindern.
3. Resektieren Sie den seitlich abgeschnittenen Magen, entfernen Sie die ausgeschlossene Hülse des Magens mit Mikroschere und sterilisieren Sie dann den Schnittrand des Magens mit Povidon-Jod-Lösung.
4. Übernähen Sie die Clip-Linie mit einer 5-0 Monofilament-Nicht-Absorber-Naht, um keine Leckage zu gewährleisten. Knoten Sie die Enden der Naht und verankern Sie an den Clips an beiden Enden.
5. Geben Sie Magen und Darm in die richtige Position in der Bauchhöhle zurück und schließen Sie den Bauch mit einem laufenden 5-0 Monofilament nicht resorbierbaren kontinuierlichen und diskontinuierlichen Naht an der Faszie und Bauchwand.
6. Verabreichen Sie Analgetika mit Ketoprofen (2-5 mg/kg) und Antibiotika mit Cefazolin (25 mg/kg) intraperitoneal nach dem gesamten Verfahren.

5. Scheinverfahren der SG

1. Führen Sie ein ähnliches Verfahren wie zuvor mit einer Mittellinien-Laparotomie beschrieben, und externalisieren Sie den Darm und Magen mit 37 °C nass warme Saline Gaze Abdeckung für 5 min.
2. Bringen Sie Magen und Darm an die richtigen Stellen dieser inneren Organe zurück.
3. Schließen Sie die Bauchwand sorgfältig, wie zuvor beschrieben, mit 2 Schichten kontinuierlichen und diskontinuierlichen Verschlusses an Faszien und Haut mit langsamen oder nicht resorbierbaren Monofilamentnähten. Verabreichen Sie Analgetika mit Ketoprofen (2-5 mg/kg) und Antibiotika mit Cefazolin (25 mg/kg) intraperitoneal nach dem gesamten Verfahren.

6. Allgemeine postoperative Versorgung

1. Stoppen Sie Isofluran und fahren Sie mit einem Raumluftstrom von 3-5 L/min fort, bis die Maus vollständig wach ist.
2. Beobachten Sie die Maus, während sie wieder beweglichkeit ist und beginnt, um den Käfig zu gehen.
3. Legen Sie die Maus 5 Tage lang in einen unabhängigen Inkubator von 30 °C. Stellen Sie sicher, dass es nur eine Maus pro Käfig gibt, um zu verhindern, dass sich die Mäuse gegenseitig verletzen.
4. Geben Sie 3 Tage nach der Operation freien Zugang zu einer Gel-Diät (fettreiche Gel-Diät: 10% Schmalz, 10% flüssiger Zucker, 57% Wasser) zurück und führen Sie die zuvor zugewiesene Diät 3 Tage nach der Operation wieder ein.
5. Subkutan oder intraperitoneal Ketoprofen (2-5 mg/kg) und Cefazolin (25 mg/kg) für 1 Tag nach der Operation injizieren.
6. Bewerten Sie das Körpergewicht der Maus wöchentlich während des gesamten Studienzeitraums. Ketoprofen (2-5 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion zur Schmerzkontrolle einmal täglich nach Bedarf zur Schmerzkontrolle bereitstellen, wenn das Tier nach der Operation in Not ist.
   HINWEIS: Hier lag die Überlebensrate von SG nach der Lernzeit bei 90%.

7. Metabolische Parameterbewertung

1. Schnelle Mäuse für 6 h, und nehmen Sie Basisblutproben (0 min). Erhalten Sie alle Blutproben von der Spitze der Schwanzvene frei bewegender Mäuse^11,12.
2. Liefern Sie 1 mg/g 50% Dextrose durch intraperitoneale Injektion für den Glukosetoleranztest.
3. Messen Sie den Blutzucker aus den Spitzen der Schwanzvenen frei beweglicher Mäuse bei 0, 5, 15, 30, 60 und 120 min nach Derglukoseverabreichung an doppelten Proben mit Glukometern und Teststreifen.
4. Die Vollblutprobe (n = 10 pro Gruppe) bei Raumtemperatur mit Gerinnung 30 Minuten aufbewahren.
5. Zentrifuge die Blutprobe bei 3.000 x g für 10 Minuten bei 4 °C zentrieren.
6. Das Plasma in separate Röhrchen überführen, ohne blutgerinnsel zu stören und bei -80 °C aufzubewahren.
7. Untersuchen Sie die Plasmaproben am Ende der Studie mit kommerziellen Mäusen ELISA-Kits für Hämoglobin A1c (HBA1c), Glukose, Cholesterin, und Insulinspiegel nach den Richtlinien des Herstellers.

Ergebnisse

Die Ergebnisse des Vorgangs sind in Abbildung 3 und Abbildung 4dargestellt. Die Überlebensrate der Studie betrug 90%. Eine Maus starb in der Scheingruppe aufgrund von Schwächen und eine weitere Maus starb in der SG-Gruppe am dritten Tag nach der Operation aus unbekannten Gründen. Die Ergebnisse, die bei der Gewichtsabnahme(Abbildung 3A) nach der Operation (in Woche 3) an HFD-gefütterten Mäusen erzielt wurden, waren denen beim Mensch...

Diskussion

Die meisten prospektiven Kohortenstudien haben bestätigt, dass die Erhöhung des Body-Mass-Index mit der Erhöhung der Sterblichkeit zusammenhängt. Adipositas ist mit einem höheren Risiko für Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) und Tod bei beiden Geschlechtern verbunden. Die spezifischen pathologischen Prozesse haben einen Zusammenhang zwischen Diabetes, Adipositas und Sterblichkeit¹⁴hergestellt. Die systematischen Überprüfungen zeigen die Vorteile der bariatrischen Chirurgie bei der Verring...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,9% normale Kochsalzlösung	China Chemical & Pharmazeutische Co., Ltd.
5-0 monofile Naht	Shineteh Inc. Taiwan		Ethicon
Alm	Shineteh Inc. Taiwan	ST-A072PK	UNIK
Tieranästhesie	Step Technology	0712VAP11076	Matrx
Barraqer-Troutman Pinzette	Shineteh Inc. Taiwan	ST-N309 (H-4410)	UNIK
cefazolin	Taiwan Veteran Apothekenunternehmen
Chow Diät	Forschung Diäten
Glukosestreifen und Blutzuckermessgerät	BeneCheck	BKM13-1	BeneCheck
HbA1c Kit	Level	OKEH00661
Hämatologiesystem	Fuji	FUJI DRI-CHEM 4000i	Europa
Fettreiche Diät	Forschung Diäten	1810724	LabDiet
Iriszange	Shineteh Inc. Taiwan	ST-1210	UNIK
Iris Schere	Shineteh Inc. Taiwan	ST-S011	UNIK
Isofluran	Panion & BF biotech INC	8547	Panion & BF
Ketoprofen	Sigma	22071154	Sigma-Aldrich
Stereomikroskop	MicroTech	SZ-5T	MicroTech
Chirurgischer Clip (M)	Echicon Inc., Somerville, NJ		Größe M, 5mm
Vidisic	Gel Dr. Gerhard Mann Chem.-pharm. Fabrik GmbH