Transkriptom-weite Profilierung von Protein-RNA-Wechselwirkungen durch Vernetzung und Immunpräzipitation durch FLAG-Biotin-Tandemreinigung

Summary

Hier stellen wir ein modifiziertes CLIP-seq-Protokoll namens ^FbioCLIP-seq mit FLAG-Biotin-Tandemreinigung vor, um die RNA-Ziele von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) in Säugetierzellen zu bestimmen.

Abstract

RNA- und RNA-bindende Proteine (RBPs) steuern mehrere biologische Prozesse. Die räumliche und zeitliche Anordnung von RNAs und RBPs liegt der heiklen Regulierung dieser Prozesse zugrunde. Eine Strategie namens CLIP-seq (Cross-Linking und Immunprecipitationung) wurde entwickelt, um endogene Protein-RNA-Wechselwirkungen mit UV-Vernetzung mit anschließender Immunpräzipation zu erfassen. Trotz des breiten Einsatzes der konventionellen CLIP-Seq-Methode in der RBP-Studie wird die CLIP-Methode durch die Verfügbarkeit hochwertiger Antikörper, potentieller Verunreinigungen aus den korifizierten RBPs, die Anforderung der Isotopenmanipulation und den potenziellen Informationsverlust während eines mühsamen experimentellen Verfahrens eingeschränkt. Hier beschreiben wir eine modifizierte CLIP-seq-Methode namens ^FbioCLIP-seq mit der FLAG-Biotin-Tag-Tandemreinigung. Durch Tandemreinigung und strenge Waschbedingungen werden fast alle interagierenden RNA-bindenden Proteine entfernt. Somit werden auch die RNAs, die indirekt durch diese korifizierten RBPs vermittelt werden, reduziert. Unsere ^FbioCLIP-seq-Methode ermöglicht einen effizienten Nachweis von direkten proteingebundenen RNAs ohne SDS-PAGE- und Membrantransferverfahren in isotop- und proteinspezifischer Antikörperfreiheit.

Introduction

RNAs und RNA-bindende Proteine (RBPs) steuern verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich Spleißen, Translation, Ribosomenbiogenese, epigenetische Regulation und Zellschicksalübergang^1,2,3,4,5,6. Die empfindlichen Mechanismen dieser Prozesse hängen von der einzigartigen räumlichen und zeitlichen Anordnung von RNAs und RBPs ab. Daher besteht ein wichtiger Schritt zum Verständnis der RNA-Regulierung auf molekularer Ebene darin, die Positionsinformationen über die Bindung....

Protocol

1. Zelllinienbau

1. Klonen Sie das gen von Interesse in einem PiggyBac Vektor pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA von Interesse]-(Hygromycin-resistent) Plasmid, das ein FLAG-Biotin-Epitop^13,21 trägt, um ein FLAG-Biotin-Tag geschmolzenes RBP (^FBRBP) auszudrücken.
2. Kotranssekte den FB-RBP-Exezierenden Vektor mit dem pBase-Vektor in eine Zelllinie, die das BirA-Enzym²²exzisiert.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde das FB-RBP-Gen in embryonale Mundzellen (mESCs) transfiziert, die einen integrierten BirA-Expressionsvektor²¹tragen. ....

Results

Die schematische Darstellung der ^FbioCLIP-seq-Prozedur ist in Abbildung 1dargestellt. Im Vergleich zur FLAG-vermittelten oder streptavidinvermittelten einstufigen Affinitätsreinigung entfernte die FLAG-Biotin-Tandemreinigung fast alle korifizierten Proteine, wodurch die Kontamination indirekter Protein-RNA-Wechselwirkungen vermieden wurde (Abbildung 2). Repräsentative Ergebnisse für ^FbioCLIP-seq für LIN28 und WDR43 sind in

Discussion

Hier stellen wir eine modifizierte CLIP-seq-Methode namens ^FbioCLIP-seq vor, bei der das FLAG-Biotin-Doppel-Tagging-System für die Tandemreinigung von Protein-RNA-Komplexen genutzt wird. Das FLAG-Biotin-Doppel-Tagging-System hat sich als leistungsfähig bei der Identifizierung von Protein-Protein- und Protein-DNA-Wechselwirkungen^13,21erwiesen. Hier zeigen wir die hohe Spezifität und den Komfort dieses Systems bei der Identifizierung der RNAs, die mit Pr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
UV Vernetzer	UVP	HL-2000 HybrilLinker
Affinity Purification Beads
ANTI-FLAG	beads Sigma-Aldrich	A2220
Streptavidin beads	Invitrogen	112.06D
Reagenzien
10x PBS	Gibco	70013032
3 M NaOAc	Ambion	AM9740
3 x FLAG Peptid	Sigma-Aldrich	F4799
ATP	Sigma-Aldrich	A6559
Calciumchlorid (CaCl2)	Der Sigma-Aldrich	C1016
CIP	NEB	M0290S	CIP-Puffer befindet sich im selben Gehäuse.
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Gel-Aufreinigungskit	QIAGEN	28704
Glykogen	Ambion	AM9510
Magnesiumchlorid (MgCl2)	Sigma-Aldrich	449172
MNase	NEB	M0247S
NP-40	Amresco	M158-500ML
PMSF	Sigma-Aldrich	10837091001
Porteinase K	TAKARA	9033
Proteaseinhibitor	Cocktail Sigma-Aldrich	P8340
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix	NEB	0492S
reverse Trancriptase ( Invitrogen		18080093
(Trizol)	Invitrogen	15596018
RNase Inhibitor	ThermoFisher	EO0381
RNaseOUT	Invitrogen	10777019
RQ1 Dnase	Promega	M6101
SDS	Sigma-Aldrich	1614363
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	S9888
Natriumdesoxycholat	Sigma-Aldrich	D6750
T4 PNK	NEB	M0201S	PNK-Puffer befindet sich in der gleichen Packung.
T4-RNA-Liga,	ThermoFisher	EL0021	T4-RNA-Ligase-Puffer und BSA befinden sich in derselben Packung.
T4-RNA-Ligase2, verkürzter			und 50 % PEG befinden sich in derselben Packung.
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200072
Harnstoff	Sigma-Aldrich	208884
mESC
DMEM (80%)	Gibco	11965126
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
FCS (15%)	Hyclone
Glutamax (1%)	Gibco	35050061
LIF			gereinigtes rekombinantes Protein; 10.000-fache Verdünnung
NEAA (1%)	Gibco	11140050
Nukleosid-Mix (1%)	Millipore	ES-008-D
Penicillin-Streptomycin (1%)	Gibco	15140122
Kit
DNA Gel-Extraktionskit	QIAGEN	28704