Lokalisation und Quantifizierung von Begomoviren in Whitefly-Geweben durch Immunfluoreszenz und quantitative PCR

Summary

Wir beschreiben eine Immunfluoreszenz und quantitative PCR-Methode zur Lokalisierung und Quantifizierung von Begomoviren in Insektengeweben. Das Immunfluoreszenzprotokoll kann zur Kolokalisierung viraler und vektorieller Proteine verwendet werden. Das quantitative PCR-Protokoll kann erweitert werden, um Viren in ganzen Weißfliegenkörpern und virusinfizierten Pflanzen zu quantifizieren.

Abstract

Begomoviren (Gattung Begomovirus, Geminiviridae)werden von Weißfliegen des Bemisia Tabaci-Komplexes in einer anhaltenden, zirkulierenden Weise übertragen. Angesichts der umfangreichen Schäden, die begomoviren weltweit durch Begomoviren verursacht werden, ist es unerlässlich, die Wechselwirkung zwischen Begomoviren und ihrem Whitefly-Vektor zu verstehen. Dazu ist die Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in den Vektorgeweben von entscheidender Bedeutung. Hier beschreiben wir am Beispiel des Tomaten-Gelbblattcurlvirus (TYLCV) ein detailliertes Protokoll zur Lokalisierung von Begomoviren in Weißfliegen-Midguts, primären Speicheldrüsen und Eierstöcken durch Immunfluoreszenz. Die Methode basiert auf der Verwendung spezifischer Antikörper gegen ein Virusbeschichtungsprotein, mit Farbstoff gekennzeichnete Sekundärantikörper und ein konfokales Mikroskop. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um begomovirale und Whitefly-Proteine zu kolokalisieren. Wir beschreiben ferner ein Protokoll zur Quantifizierung von TYLCV in Weißfliegen-Midguts, primären Speicheldrüsen, Hämolymphen und Eierstöcken nach quantitativer PCR (qPCR). Mit Primern, die speziell für TYLCV entwickelt wurden, ermöglichen die Protokolle zur Quantifizierung den Vergleich der TYLCV-Menge in verschiedenen Geweben der Weißfliege. Das beschriebene Protokoll ist potenziell nützlich für die Quantifizierung von Begomoviren im Körper einer Weißfliege und einer virusinfizierten Pflanze. Diese Protokolle können verwendet werden, um den Zirkulationsweg von Begomoviren in der Weißfliege zu analysieren oder als Ergänzung zu anderen Methoden zur Untersuchung von Whitefly-Begomovirus-Wechselwirkungen.

Introduction

In den letzten Jahrzehnten haben Begomoviren (Gattung Begomovirus, Familie Geminiviridae) schwere Schäden an der Produktion von vielen Pflanzlichen, Fasern und Zierpflanzen weltweit verursacht¹. Begomoviren werden in beharrlicher Weise durch die Weißfliege Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) übertragen, die eine komplexe Art mit über 35 kryptischen Arten^2,3ist. Begomoviren können direkt oder indirekt Diephysiologie und das Verhalten von Weißfliegen beeinflussen, wie z. B. Fruchtbarkeit⁴, Langlebigkeit⁴und Wir....

Protocol

1. Whitefly, Virus, Pflanzen und Erwerb des Virus

1. Hintere Weißfliegen (MEAM1) auf Baumwolle (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) in insektensicheren Käfigen in einem Gewächshaus bei 26 °C bei 14:10 Licht:Dunkel-Zyklus und 60 x 10% relativer Luftfeuchtigkeit.
2. Führen Sie konventionelle PCR basierend auf Whitefly mitochondriale Cytochromoxidase I Gen, um die Reinheit der Whitefly-Population zu bestimmen.
   1. Sammeln Sie 20 erwachsene Weißfliegen und übertragen Sie sie einzeln in ein PCR-Rohr mit 30 l Lysepuffer (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] Gelatine, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Protein....

Results

Die MEAM1 Whiteflies des B. tabaci Komplexes und TYLCV wurden hier als Beispiel verwendet, um die Verfahren zu beschreiben. Abbildung 1zeigt die in diesem Manuskript beschriebenen Immunfluoreszenz- und viralen Quantifizierungsverfahren. Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse des Immunfluoreszenznachweises von TYLCV- und DAPI-Färbung in PSGs, Mittelgut und Eierstöcken, was darauf hindeutet, dass sich TYLCV in den PSGs und Midguts mehr angesammelt ha.......

Discussion

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Lokalisierung und Quantifizierung eines Begomovirus in den Geweben seines Whitefly-Vektors durch Immunfluoreszenz und qPCR. Die Dissektion stellt den ersten Schritt zur Lokalisierung und Quantifizierung des Virus in Weißfliegengeweben dar. Der Weißfliegenkörper ist etwa 1 mm lang, was bedeutet, dass die Gewebe extrem klein sind, und es ist schwierig, sie zu sezieren. Außerdem gibt es starke Verbindungen zwischen den Geweben. Zum Beispiel sind die Eierstöcke eng mit den Bakteriozyten.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% Paraformaldehyd	MultiSciences	F0001
4',6-diamidino-2-phé Nylindol (DAPI)	Abcam	ab104139
Rinderserumalbumin (BSA)	MultiSciences	A3828
CFX Connect Real-Time PCR Nachweissystem	Bio-RAD	185-5201
Konfokale Mikroskopie	Zeiss	LSM800
Dylight 549-Ziegen-Anti-Maus	Earthox	E032310-02	Sekundärantikörper
Monoklonal Antikörper (MAb 1C4)			Primärer Antikörper
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Sangon Biotech	B548119-0500
Stereomikroskop	Zeiss	Stemi 2000-C
TB grüner Premix Ex Taq (Tli RNase H Plus)	TaKaRa	RR820A	qPCR Mastermix
Thermocycler	Thermofisher	A41182
Tissuelyzer	Shaghai Jingxin	Tissuelyser-48
Triton-X-100	BBI Biowissenschaften	9002-93-1
Tween 20	BBI Biowissenschaften	9005-64-5