Method Article

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

DOI:

10.3791/60738

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January 14th, 2020

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1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Schaffung chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme mit gewünschter Affinität und Spezifität für einen bestimmten kleinen Molekülligand hätte viele biologische Sensor- und Betätigungsanwendungen. Hier beschreiben wir eine effiziente, verallgemeinerbare Methode zur de novo Engineering von chemisch induzierten Dimerisierungssystemen durch die schrittweise Auswahl einer phagenangezeigten kombinatorischen Ein-Domänen-Antikörperbibliothek.

Abstract

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Protein-Dimerisierungsereignisse, die nur in Gegenwart eines kleinmolekularen Ligands auftreten, ermöglichen die Entwicklung von kleinmolekularen Biosensoren zur Zerlegung und Manipulation biologischer Bahnen. Derzeit gibt es nur eine begrenzte Anzahl chemisch induzierter Dimerisierungssysteme (CID) und neue Systeme mit gewünschter Empfindlichkeit und Selektivität für bestimmte kleinmolekulare Liganden zu erschaffen, bleibt eine Herausforderung im Bereich der Proteintechnik. Wir beschreiben hier ein Verfahren zum Screening mit hohem Durchsatz, kombinatorial binders-enabled sElection von CID (COMBINES-CID), für die de novo Engineering von CID-Systemen, die auf eine Vielzahl von Liganden anwendbar sind. Diese Methode verwendet die zweistufige Auswahl einer phagenangezeigten kombinatorischen Nanokörperbibliothek, um 1) "Ankerbinder" zu erhalten, die zuerst an einen Voninteresse gebundenen Liganden und dann an 2) "Dimerisierungsbinder" binden, die nur an Ankerbinder-Ligand-Komplexe binden. Zur Auswahl von Ankerbindern wird eine kombinatorische Bibliothek mit über 109 komplementär-bestimmenden Nanokörpern (CDR)-randomisierten Nanokörpern mit einem biotinylierten Liganden abgeschirmt und Treffer mit dem unbeschrifteten Liganden durch Bioschichtinterferometrie (BLI) validiert. Um Dimerisierungsbindemittel zu erhalten, wird die Nanokörperbibliothek mit Ankerbinder-Ligand-Komplexen als Ziel für positives Screening und den ungebundenen Ankerbindern für negatives Screening abgeschirmt. COMBINES-CID ist allgemein anwendbar auf ausgewählte CID-Bindemittel mit anderen Immunglobulin,Non-Immunoglobulin oder computerisch konstruierten Gerüsten, um Biosensoren für den In-vitro- und In-vivo-Nachweis von Medikamenten, Metaboliten, Signalmolekülen usw. zu erstellen.

Introduction

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CID-Systeme, bei denen zwei Proteine nur in Gegenwart eines kleinmolekularen Liganden dimerisieren (Abbildung 1), bieten vielseitige Werkzeuge zum Sezieren und Manipulieren von Stoffwechsel-, Signal- und anderen biologischen Wegen1. Sie haben das Potenzial in der biologischen Betätigung, wie die medikamentöse T-Zell-Aktivierung2 und Apoptose3,4, zur Verbesserung der Sicherheit und Wirksamkeit der Adoptiv-T-Zelltherapie gezeigt. Darüber hinaus bieten sie eine neue Methodik für den In-vivo- oder In-vitro-Nachweis von Kleinmolekülzielen....

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Protocol

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1. Bibliotheksbau

  1. Verwenden Sie eine synthetische kombinatorische Single-Domain-Antikörperbibliothek mit einer Vielfalt von 1,23–7,14 x 109, wie zuvor beschrieben19. Dieses Protokoll enthält zwar keine Bibliothekserstellung, kann aber auch auf andere kombinatorische Binderbibliotheken angewendet werden.

2. Biotinylierung von Ligandenziel oder Liganden

  1. Biotinylatieren Sie den ausgewählten Liganden, z.B. CBD und Tetrahydrocannabinol (THC)19, über verschiedene chemische Synthesestrategien, abhängig von den geeigneten Biotinylierungsstellen eines Ziels.

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Results

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Wir beschreiben die zweistufige In-vitro-Auswahl und Validierung von Anker- und Dimerisierungsbindern, indem wir die kombinatorische Nanokörperbibliothek mit einer Vielfalt von mehr als 109 unter Verwendung von CBD als Ziel screeningen. Die Beurteilung der Anreicherung der Phagenbiopanning während der aufeinanderfolgenden Selektionsrunden für Anker- und Dimerisierungsbindemittel ist wichtig. Typische Anreicherungsergebnisse nach 4:6 Auswahlrunden, wie in Abbildung 5 dargestellt, s.......

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Discussion

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Es ist wichtig, die richtigen Konzentrationen von Eingangs-Phagenbibliotheken für verschiedene Runden der Biopanning zu wählen. Wir begannen in der Regel mit einer Eingabebibliothek von 1012–1013 Phagenpartikeln mit einer Diversität >109,so dass 100–1.000 Kopien jedes Phagenklons im Pull-Down-Test präsentiert werden konnten. Wenn die Phagenkonzentration in einem Bindungstest zu hoch oder zu niedrig ist, steigt die Wahrscheinlichkeit einer unspezifischen Bindung oder des Verlusts positiver.......

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Disclosures

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Die University of Washington hat ein vorläufiges Patent für diese Arbeit eingereicht.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch den University of Washington Innovation Award (an L.G.), ein Stipendium der U.S. National Institutes of Health (1R35GM128918 to L.G.) und einen Startup-Fonds der University of Washington (zu L.G.) unterstützt. H.J. wurde von einem Stipendium der Washington Research Foundation unterstützt. K.W. wurde von einem Stipendium des University of Washington Institute for Protein Design unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-stufige Ultra TMB ELISA-SubstratlösungThermo Fisher Scientific34029
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-2
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheit (3 kDa Cutoff)MilliporeUFC900324
AmpicillinThermo Fisher ScientificBP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit IIBio-Rad
BirA Biotin-Protein-Ligase Standard ReaktionskitAvidityBirA500
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
CaseinSigma-AldrichC7078-1KG
CM13 HelferphageAntikörper Design LabsPH020L
D-(+)-GlukosemonohydratAlfa AesarA11090
Dynabeads M-280 StreptavidinThermo Fisher Scientific11205D
DynaMag-2 MagnetThermo Fisher Scientific12321D
EDTAThermo Fisher ScientificBP120-1
Fast DNA LadderNew England BiolabsN3238S
FastDigest BglIThermo Fisher ScientificFD0074
GlycerolThermo Fisher ScientificBP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28989335
HiPrep 26/10 EntsalzungssäuleGE Healthcare17508701
HisTrap-FF-1mlGE Healthcare11000458
ImidazolAlfa Aesar161-0718
IPTGThermo Fisher Scientific34060
KanamycinThermo Fisher ScientificBP906-5
M13 Major Coat Protein AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-53004
NaClSigma-AldrichS3014-500G
NanoDrop 2000/2000c SpektralphotometerThermo Fisher ScientificND-2000
Nunc 96-Well Polypropylen DeepWell AufbewahrungsplattenThermo Fisher Scientific260251
NuncMaxiSorp Thermo Fisher Scientific44-2404-21
Octet RED96ForteBioN/A
pADL-23c Phagemid Vector AntibodyDesign LabsPD0111
PEG-6000Sigma-Aldrich81260-1KG
Platinum SuperFi DNA PolymeraseInvitrogen12351010
PureLink PCR AufreinigungskitThermo Fisher ScientificK310001
QIAprep Spin M13 KitQiagen27704
Recovery MediumLucigen80026-1
SpectraMax Plus 384Molecular DevicesN/A
SaccharoseSigma-AldrichS0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) BiosensorenForteBio18-5057
Superdex 75 Erhöhung 10/300 GL SäuleGE Healthcare28-9909-44
T4 DNA LigaseThermo Fisher Scientific15224-025
TG1 Elektrokompetente ZellenLucigen60502-1
TriethylaminSigma-Aldrich471283-100mL
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
TryptonThermo Fisher ScientificBP9726-5
Tween 20Thermo Fisher ScientificBP337-500
HefeextraktThermo Fisher ScientificBP1422-2
Zeba Spin EntsalzungssäuleThermo Fisher Scientific89882
5000002

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.

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Chemically Induced DimerizationPhage Display SelectionCombinatorial Nanobody LibraryAnchor BindersDimerization BindersBio Layer InterferometryStreptavidin Coated BeadsCompetitive ElutionSingle Clone ELISASize Exclusion Chromatography

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