Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellpopulationen in der Tumormikroumgebung

Summary

Hier beschreiben wir eine einfache und zugängliche Strategie zur Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen in formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Tumorgewebeabschnitten. Diese Methode kombiniert vorhandene Bildgebungs- und digitale Analysetechniken mit dem Ziel, die Multiplexing-Fähigkeit und die Multiparameteranalyse von Imaging-Assays zu erweitern.

Abstract

Die Immunlandschaft der Tumormikroumgebung (TME) ist ein entscheidender Faktor für die Krebsprogression und die Reaktion auf die Therapie. Insbesondere die Dichte und die Lage von Immunzellen in der TME haben wichtige diagnostische und prognostische Werte. Die multiomische Profilierung der TME hat unser Verständnis der zahlreichen zellulären und molekularen Netzwerke, die die Tumorinitiierung und -progression regulieren, exponentiell verbessert. Diese Techniken enthalten jedoch keine Informationen über die räumliche Organisation von Zellen oder Zell-Zell-Interaktionen. Erschwingliche, zugängliche und einfach auszuführende Multiplexing-Techniken, die eine räumliche Auflösung von Immunzellen in Gewebeabschnitten ermöglichen, sind erforderlich, um einzelzellbasierte Hochdurchsatztechnologien zu ergänzen. Hier wird eine Strategie beschrieben, die serielle Bildgebung, sequenzielle Beschriftung und Bildausrichtung integriert, um virtuelle Multiparameter-Dias ganzer Gewebeabschnitte zu generieren. Virtuelle Folien werden anschließend automatisiert mithilfe benutzerdefinierter Protokolle analysiert, die die Identifizierung, Quantifizierung und Zuordnung von zellbasierten Zellpopulationen ermöglichen. Die Bildanalyse erfolgt in diesem Fall mit den Analysemodulen Tissuealign, Author und HISTOmap. Wir stellen ein Beispiel vor, in dem wir diese Strategie erfolgreich auf eine klinische Probe angewendet haben, indem wir die Informationen, die aus begrenzten Gewebeproben gewonnen werden können, maximiert und einen unvoreingenommenen Blick auf das TME im gesamten Gewebebereich bieten.

Introduction

Die Krebsentwicklung ist das Ergebnis eines mehrstufigen Prozesses, bei dem es um wechselseitige Wechselwirkungen zwischen bösartigen Zellen und der TME geht. Anders als Tumorzellen besteht das TME aus nichtbösartigen Zellen, Stromalzellen, Immunzellpopulationen und extrazellulärer Matrix (ECM)¹. Die räumliche Organisation der verschiedenen zellulären und strukturellen Komponenten des Tumorgewebes und der dynamische Austausch zwischen dem Krebs und benachbarten Nicht-Krebszellen modulieren letztlich die Tumorprogression und das Ansprechen auf Therapie^2,3,4. Es hat sich gezeigt, dass die Immunantwort bei Krebs räumlich reguliert ist^5,6. Verschiedene Immunzellpopulationen, die die neoplastische Läsion und das angrenzende Gewebe infiltrieren, weisen ausgeprägte räumliche Verteilungsmuster auf und unterschiedliche Aktivierungs- und Differenzierungszustände, die mit verschiedenen Funktionen (z.B. Pro- versus Antitumor) verbunden sind. Diese verschiedenen Immunpopulationen und ihre Parameter koalieren Überstunden mit dem Tumor und den Stromalkompartimenten.

Das Aufkommen von Technologien, die das Profiling von Einzelzellmultiomics ermöglichen, hat unser Verständnis der zahlreichen zellulären und molekularen Netzwerke, die die Karzinogenese und Tumorprogression regulieren, exponentiell verbessert. Die meisten einzelzellbasierten Analysetools mit hohem Durchsatz erfordern jedoch Gewebestörungen und Einzelzellisolation, was zu einem Verlust von Informationen über die räumliche Organisation von Zellen und Zell-Zell-Wechselwirkungen^{führt 7}. Da die Lage und Anordnung spezifischer Immunzellen in der TME diagnostischen und prognostischen Wert haben, sind Technologien, die eine räumliche Auflösung ermöglichen, eine wesentliche Ergänzung der einzelzellbasierten Immunprofilierungstechniken.

Traditionell sind bildgebende Verfahren wie Immunhistochemie (IHC) und Multiplex-Immunfluoreszenz (mIF) auf eine kleine Anzahl von Biomarkern beschränkt, die gleichzeitig visualisiert werden können. Diese Einschränkung hat die Untersuchung der räumlich-zeitlichen Dynamik tumorinfiltrierender Immunzellen behindert, die typischerweise durch mehrere phänotypchende Marker definiert werden. Jüngste Fortschritte in der Bildgebung und analytischen Tools haben die Möglichkeiten des Multiplexings erweitert. Neue Antikörper-basierte Etikettierungstechnologien wie Histozytometrie und bildgebende Massenzytometrie wurden verwendet, um bis zu 12 bzw. 32 Biomarker räumlich zu trennen, bzw.^8,9. Die Bildgebung der Massenspektrometrie, eine Technik, die keine Etikettierung erfordert, hat das Potenzial, Tausende von Biomarkern gleichzeitig in einem einzigen Gewebeabschnitt^10,11abzubilden. Obwohl diese Techniken bereits ein großes Potenzial zur Zersebung der Gewebeimmunlandschaft bei Krebs gezeigt haben, verwenden sie hochentwickelte und teure Geräte und Software und sind für die Mehrheit der Forscher nicht leicht zugänglich.

Alternativ wurde die Multiplexing-Fähigkeit von traditionellen IHC und mIF durch die Verwendung von serieller Bildgebung, sequenziellen Runden der Etikettierung und Spektralbildgebung^{7,12,13,14,15,16}erweitert. Diese Techniken generieren mehrere Bilder aus demselben oder aus seriellen Gewebeabschnitten, die mithilfe einer Bildanalysesoftware in virtuellen Multiparameter-Folien konsolidiert werden können. Dadurch steigt die Anzahl der Marker, die gleichzeitig visualisiert und analysiert werden können.

Hier schlagen wir eine Strategie für die rationale Gestaltung von Gewebemultiplex-Assays mit handelsüblichen Reagenzien, erschwinglichen Mikroskopiegeräten und benutzerfreundlicher Software vor (Abbildung 1). Diese Methode integriert serielle Bildgebung, sequenzielle Multiplex-Beschriftung, gesamte Gewebebildgebung und Gewebeausrichtung, um virtuelle Multiparameter-Dias zu generieren, die für die automatisierte Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen in Gewebeabschnitten verwendet werden können. Mit dieser Strategie haben wir eine virtuelle Folie mit 11 Biomarkern plus zwei häufig verwendeten histologischen Flecken erstellt: Hämatoxylin und Eosin (H&E) und Picrosirius rot (PSR). Mehrere Immunzellpopulationen wurden in verschiedenen Gewebeteilen identifiziert, lokalisiert und quantifiziert und ihre räumliche Verteilung mithilfe von Gewebe-Heatmaps aufgelöst. Diese Strategie maximiert die Informationen, die aus begrenzten klinischen Proben gewonnen werden können, und ist auf formalinfixierte, paraffinintegrierte (FFPE) archivierte Gewebeproben anwendbar, einschließlich vollgewebter, Kernnadelbiopsien und Gewebemikroarrays. Wir schlagen diese Methode als nützlichen Leitfaden für die Gestaltung von benutzerdefinierten Assays zur Identifizierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellpopulationen in der TME vor.

Protocol

Drei serielle FFPE-Abschnitte des resezierten Hepatitis-B-Virus (HBV)-assoziierten humanen hepatozellulären Karzinoms wurden vom Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CHUM) Hepatopancreatobiliary Cancer Clinical Database and Biological Specimen erhalten. Repository (HBP Biobank). Patienten, die an dieser Gewebebank teilnahmen, erteilten ihre Einwilligung in Kenntnis der Sachlage. Diese Studie wurde von der institutionellen Ethikkommission (Protokoll nummer 09.237) genehmigt und in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki durchgeführt.

1. Hematoxylin und Eosin (H&E) Färbeprotokoll

HINWEIS: Die H&E-Färbung wurde von der molekularpathischen Kerneinrichtung des Centre de Recherches du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) mit dem Shandon Multiprogramm-Roboter-Dia-Färbeprogramm mit dem folgenden Programm durchgeführt.

1. Zur Deparaffinierung diagleitet 3x für je 2,5 min in Xylol-Ersatz.
   VORSICHT: Xylol-Ersatzstoffe sind entzündlich, hautreizend und schädlich, wenn sie eingeatmet werden.
2. Zur Rehydrierung gleitet in 100% Ethanol 3x für je 2,5 min. 1 min in doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) zum Rehydrieren waschen.
3. 1 min in Hämatoxylin brüten. Waschen Sie 3x für je 1 min in ddH₂O.
4. Inkubieren Sie für 5 s mit Eosin. Waschen Sie 30 s mit 95% Ethanol. 2x für 1 min mit 100% Ethanol waschen.
   VORSICHT: Ethanol ist entzündlich und ein Augenreiz. Eosin ist ein Augenreiz.
5. Zur Austrocknung 3x für je 1,5 min in den Xylol-Ersatz eintauchen. Führen Sie Dias manuell ein.
   HINWEIS: Die geschätzte Zeit für die Ausführung dieses Teils des Protokolls beträgt 30 min.

2. Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll für FFPE-Abschnitte

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von Robertson et al.¹⁷angepasst.

1. Deparaffinierung und Rehydratation
   HINWEIS: Vor der antikörpervermittelten Etikettierung von FFPE-Abschnitten durch IHC oder mIF sollte das Paraffin entfernt werden. Wenn das Paraffin nicht effizient entfernt wird, führt dies zu einer suboptimalen Färbung.
   1. Platzieren Sie 4 'm FFPE Gewebeabschnitt gleitet in Glasschlittenhalter. Tauchen Sie die Dias unter der Dunstabzugshaube 10 min in ein Coplin-Glas mit 37°C vorgewärmten Xylol ein.
      VORSICHT: Xylol ist entzündlich, hautreizend und schädlich, wenn es eingeatmet wird.
   2. Die Dias für 10 s alle 2 min manuell aufheben. 1x in frischem Xylol für weitere 5 min wiederholen.
   3. In die chemische Haube tauchen Sie die Dias für jeweils 5 min sequenziell in jede der folgenden Lösungen ein: 1) Xylol: Ethanol (1:1 v/v); 2) 100% Ethanol; 3) 70% Ethanol; 4) 50% Ethanol; 5) 30% Ethanol; 6) Phosphat-gepufferte Saline (PBS).
      HINWEIS: Bewahren Sie die Folien in PBS auf, bis sie bereit sind, den Antigenabruf durchzuführen. Halten Sie die entwachsten Abschnitte jederzeit hydratisiert. Das Austrocknen führt zu einer unspezifischen Antikörperbindung und damit zu einer hohen Hintergrundfärbung.
2. Wärmeinduzierte Antigenabruf
   HINWEIS: Antigene können bei formaler Fixierung maskiert werden, wodurch die Antikörperbindung und damit die Visualisierung verhindert wird. Die Verwendung von Antigen-Entlarvungspuffern und Verfahren stellt teilweise die native Konformation von Epitopen wieder her und stellt dadurch die Antikörpererkennung wieder her. Die Art des Antigen-Abrufpuffers und die Dauer sollten für die spezifischen Assay-Bedingungen (z. B. Ziel, Antikörper, Gewebe usw.) optimiert werden.
   1. Tauchen Sie entwachste Dias in ein Coplin-Glas mit der Antigen-Retrieval-Lösung (Rezept in Tabelle der Materialien).
   2. Geschlossenes Coplin-Glas in einen elektrischen Schnellkochtopf mit Leitungswasser geben. Der Wasserstand sollte die Hälfte der Höhe des Glases nicht überschreiten, damit sich das Wasser nicht mit der Antigen-Retrievallösung vermischt.
   3. Schließen Sie den Deckel und das Druckventil des Herds. Wählen Sie Hochdruck für 10 min und starten. Wenn Sie fertig sind, ziehen Sie den Herd ab, lassen Sie den Druck los, öffnen Sie den Deckel und halten Sie das Glas 30 min im Herd, so dass die Dias abkühlen können.
3. Sperrung unspezifischer Bindungen
   1. Übertragen Sie das Rack mit den Dias in ein mit PBS gefülltes Coplin-Glas. Spülen Sie den Antigen-Abrufpuffer mit PBS 2x für jeweils 5 min ab.
   2. Umkreisen Sie die Gewebeabschnitte mit einem PAP-Stift, um eine hydrophobe Barriere zu schaffen. Tauchen Sie die Dias in ein Coplin-Glas mit 0,1 m Glycin in PBS ein. 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
      HINWEIS: Glycin sättigt die Aldehydgruppen, die bei der Antigenabrufung entstehen. Diese Gruppen können primäre und sekundäre Antikörper unspezifisch binden.
   3. Spülen Sie die Glycin-Lösung ab, indem Sie 2x mit PBS für 5 min waschen. Legen Sie die Dias in eine Feuchtigkeitskammer und fügen Sie genügend Blockierlösung hinzu, um alle Gewebeabschnitte abzudecken. Vermeiden Sie ein Überlaufen der hydrophoben Barriere. 30 min bei RT inkubieren.
      HINWEIS: Das Rezept für die Blockierlösung finden Sie in der Tabelle der Materialien. Die Blockierlösung sollte ein Protein (z. B. BSA) enthalten, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Es kann auch Waschmittel wie Triton X-100 oder Tween 20 enthalten, die hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Antikörpern und Gewebezielen reduzieren und dadurch die Antigenerkennung selektiver machen. Die Zugabe von 10% Gesamtserum von der Spezies, aus der das Gewebe stammt, würde Fc-Rezeptoren blockieren und somit die unspezifische Antikörperbindung reduzieren. Schließlich würde die Zugabe von 10 % des Serums aus der Art, in der die sekundären Antikörper aufgezogen wurden, die direkte unspezifische Anhaftung sekundärer Antikörper an den Gewebeabschnitt minimieren.
4. Immunofluoreszenz-Kennzeichnung
   1. Spülen Sie mit PBS-Tween (0,1% v/v) 2x für je 5 min und legen Sie die Dias wieder in die Feuchtigkeitskammer.
   2. Fügen Sie den Cocktail der primären Antikörper in blockiernLösung resuspendiert. Über Nacht bei 4 °C inkubieren. Primäre und sekundäre Antikörper, die für diese Studie verwendet werden,sind in der Tabelle der Materialien aufgeführt.
      HINWEIS: Der Cocktail der primären Antikörper sollte entweder Antikörper enthalten, die bei verschiedenen Arten oder von derselben Art, aber von verschiedenen Isotypen aufgezogen werden. Eine Liste der in dieser Studie verwendeten primär-sekundären Antikörperpaare finden Sie in Tabelle 2. Einzelheiten zu allen verwendeten Antikörpern finden sich in der Tabelle der Werkstoffe und Tabelle 2.
   3. Spülen Sie mit PBS-Tween (0,1% v/v) 3x für 5 min und legen Sie die Dias wieder in die Feuchtigkeitskammer. Fügen Sie im Dunkeln den Cocktail der sekundären Antikörper hinzu und brüten Sie 1 H bei RT.
      HINWEIS: Wenn die primären Antikörper von verschiedenen Arten stammen, sollten die sekundären Antikörper so ausgewählt werden, dass jeder von ihnen nur an einen der primären Antikörper bindet und nicht an einander. Dies wird üblicherweise durch die Verwendung von sekundären Antikörpern erreicht, die alle in derselben Art aufgezogen werden, solange sich diese Art von der Art unterscheidet, bei der die primären Antikörper erzeugt wurden. In Fällen, in denen die primären Antikörper bei derselben Art aufgezogen wurden, aber unterschiedliche Isotypen aufweisen, sollten isotypspezifische sekundäre Antikörper verwendet werden.
   4. Spülen Sie mit PBS-Tween (0,1% v/v) 3x für je 5 min. Spülen Sie mit ddH₂O. Überschüssige Flüssigkeit entfernen und in Montagemedien mit DAPI montieren. Das verwendete Volumen hängt von der Größe des Abschnitts ab. In der Regel reichen 40 l aus, um die Oberfläche eines normalen Mikroskop-Dias abzudecken.
   5. Legen Sie den Deckelschlitten auf den Abschnitt und drücken Sie die überschüssigen Montagemedien vorsichtig aus, um Blasenbildung zu vermeiden. Lassen Sie die Dias 20 min bei RT im Dunkeln trocknen und lagern Sie bei 4 °C, bis sie bezugsfertig sind.
   6. Erfassen Sie Bilder für alle Kanäle mit dem gesamten Diascanner (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Die Antikörper wurden mit humanem hepatozellulärem Karzinomgewebe als positiv ernässt. Für jeden primären Antikörper wurden drei serielle Abschnitte entweder mit primärem Antikörper, Isotypkontrolle oder nur Blockierlösung befleckt, wobei der Rest des Färbeprotokolls nicht variationiert wurde. Die aufgenommenen Bilder wurden verglichen, um die Spezifität der Färbung zu ermitteln. Die Färbung wurde als spezifisch betrachtet, wenn das Signal in dem abschnitts inkubierten mit primärer Antikörper hatte das erwartete Muster und war leicht vom Hintergrund zu unterscheiden. Primäre Antikörper, die ein hohes Hintergrundsignal oder eine Kennzeichnung von Gewebekomponenten im Isotyp und keine primären Antikörperabschnitte begründen, wurden als unspezifisch betrachtet. Die geschätzte Zeit für den Abschluss dieses Teils des Protokolls beträgt 2 Tage. Erforderliche Kontrollen sind: (1) Isotype-Steuerung, um den Beitrag der unspezifischen Bindung des primären Antikörpers an das Hintergrundsignal zu ermitteln. Ein Abschnitt ist auf die gleiche Weise wie die anderen Probengewebe gefärbt, außer dass er mit einem Antikörper mit dem gleichen Isotyp und Ursprung des primären Antikörpers inkubiert wird, aber spezifisch für ein Ziel, das im Gewebeabschnitt fehlt. Wenn der geeignete Isotypkontrollantikörper nicht verfügbar ist, kann er durch das gesamte IgG derselben Art ersetzt werden, in der der primäre Antikörper aufgebracht wurde; (2) Keine primäre Antikörperkontrolle (d. h. negative Kontrolle), um die Spezifität der Färbung zu ermitteln und den Beitrag der unspezifischen Bindung von sekundären Antikörpern an das Hintergrundsignal abzuschätzen. In diesem Fall wird der Kontrollabschnitt auf die gleiche Weise wie die anderen Abschnitte befleckt, mit der Ausnahme, dass kein Primärantikörper hinzugefügt wird; (3) Positive Kontrolle, um festzustellen, dass die Färbung funktioniert. In diesem Fall wird die Färbung an einem Gewebeabschnitt durchgeführt, der bekanntermaßen den marker ausdrückt, der vom primären Antikörper erkannt wird.

3. Picro-sirius rot (PSR)/schnelles grünes Färbeprotokoll

HINWEIS: Das Ziel dieser Färbung ist es, fibrillare Kollagen E und III in den FFPE-Gewebeabschnitten zu visualisieren. Dieses Protokoll wurde von Segnani et al.¹⁸adaptiert. Alle Schritte werden in einer chemischen Haube durchgeführt.

1. Führen Sie die Deparaffinierung und Rehydratation von Gewebeabschnitten ähnlich dem Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll für die FFPE-Abschnitte durch (Abschnitt 2.1).
   HINWEIS: Wenn der zu färbende Abschnitt zuvor für die Immunfluoreszenzkennzeichnung verwendet wurde und das Paraffin bereits entfernt wurde, sind die Deparaffinisierungs-Rehydrierungsschritte nützlich, um die Montagemedien zu entfernen. DAPI wird mit diesem Verfahren nicht entfernt, aber es stört die PSR-Färbung nicht.
2. Tauchen Sie die Dias in ein Glas mit der picro-sirius rot/schnell grünen Lösung (Rezept in Tabelle der Materialien) und inkubieren für 30 min bei RT (mehr als 30 min führt zu unspezifischen Färbung der Kerne von Hepatozyten).
3. Schlitten schnell waschen in ddH₂O (5 Dips). Dann schnell in Ethanol 100% (5 Dips) waschen. Waschen für 30 s in Xylol-100% Ethanol (1:1 v/v). Waschen Sie für 30 s in Xylol. Montieren Sie mit Montagemedien (siehe Materialtabelle), bevor Xylol vollständig verdampft ist (dies hilft bei der Montage).
   HINWEIS: Die geschätzte Zeit für die Ausführung dieses Teils des Protokolls beträgt 1 h.

4. Elution von Antikörpern aus Gewebeabschnitten

HINWEIS: Um Gewebeabschnitte in sequenziellen Etikettierungstests wiederzuverwenden, ist die vollständige Entfernung von primärer und sekundärer Antikörper erforderlich. Gebundene Antikörper wurden wie zuvor beschrieben¹³entfernt.

Ein Wasserbad auf 56 °C vorheizen. Legen Sie die Abschnitte in ein Glas mit Abisolierpuffer (Rezept in Tabelle der Materialien), schließen Sie den Deckel, und versiegeln Sie es mit Paraffin-Filmband, um Leckagen während des Schüttelns zu verhindern.

1. Legen Sie das Glas in das Wasserbad und brüten Für 30 min mit Rührung.
2. 4x für je 15 min in ddH₂O bei RT. Spülen mit PBS-Tween (0,1% v/v) waschen.
3. Halten Sie die Abschnitte in PBS-Tween oder Wasser hydratisiert, bis sie bereit sind, den Abschnitt mit der zweiten Runde der primären Antikörper erneut zu untersuchen.
   HINWEIS: Die geschätzte Zeit für die Ausführung dieses Teils des Protokolls beträgt 2 h.
4. Überprüfen Sie die Effizienz des Antikörper-Elution-Verfahrens.
   HINWEIS: Vor der Verwendung des Protokolls für die Antikörper-Elution in einem sequenziellen Etikettierungstest sollte die Effizienz der Entfernung von primär- und sekundären Antikörpern überprüft werden.
   1. Führen Sie die Färbung und Bildaufnahme eines Abschnitts mit einem bestimmten primär sekundären Antikörper-Interessenpaar durch, wie im Multiplex-Immunfluoreszenz-Färbeprotokoll für FFPE-Abschnitte angegeben (Abschnitte 2.1–2.4.6).
   2. Führen Sie bei der Bildaufnahme die Elution von gewebegebundenen primärsekundären Antikörperkomplexen durch, wie in den Abschnitten 4.1–4.3 angegeben.
   3. Inkubieren Sie den Abschnitt mit dem gleichen sekundären Antikörper und den gleichen Bedingungen, die in Schritt 2.4.3 verwendet werden.
   4. Führen Sie Wasch-, Montage- und Bildaufnahmeschritte durch, wie in 2.4.4–2.4.6 angegeben.
   5. Vergleichen Sie nebeneinander aufgenommene Bilder, die vor und nach dem Abisolieren aufgenommen wurden, um festzustellen, ob das spezifische Signal verschwunden ist oder nicht.
      HINWEIS: Der Vergleich von Bildern vor und nach der Entfernung von Antikörpern bestätigt die Effizienz des Elution-Verfahrens. Es ist jedoch normal, eine Zunahme des Hintergrundsignals in allen Kanälen sowie die Diffusion von DAPI zu sehen. Dadurch wird die Anzahl der Abisolierungen begrenzt, die auf demselben Gewebeabschnitt ausgeführt werden können. Drei Streifengänge scheinen das Maximum zu sein.

5. Bildaufnahme

1. Generieren Sie Bilder mit einem ganzen Diascanner.
2. Verwenden Sie ein 20x 0.75NA Objektiv und eine Auflösung von 0,3225 m/Pixel.

6. Bildanalyse

HINWEIS: Die hier beschriebene Methode bezieht sich auf das aktuelle Beispiel. Siehe Tabelle 1 und den Text, um sich an andere spezifische Beispiele anzupassen.

1. Führen Sie die Gewebeausrichtung mit dem Tissualign-Modul der Bildanalysesoftware (VIS in diesem Protokoll, siehe Tabelle der Materialien) durch.
   1. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software und klicken Sie auf die Registerkarte Tissuealign.
   2. Importieren Sie die Bilder, die in das Folienfach ausgerichtet werden sollen, indem Sie zu Datei | Datenbank, und wählen Sie das erste Bild aus, das ausgerichtet werden soll. Kehren Sie zur Registerkarte Tissuealign zurück, und laden Sie das Bild, indem Sie auf die Schaltfläche Laden im Folienfachklicken. Das Bild wird im Folienfach und im Arbeitsbereich angezeigt.
      HINWEIS: Nur der Stapel von Interesse sollte in das Schiebefach geladen werden.
   3. Wiederholen Sie Schritt 6.1.2 für alle Bilder in der Reihenfolge, in der sie ausgerichtet werden sollen, und laden Sie sie nacheinander. Sobald alle von Interesse interessierten Bilder auf das Folienfach geladen wurden, verknüpfen Sie die Bilder, indem Sie in den Workflowschritten im Menüband auf Weiter klicken.
   4. Ziehen Sie als Nächstes das zweite Bild über das erste Bild. Das erste und das zweite Bild sind nun verknüpft. Wiederholen Sie diesen Schritt, damit die anderen Bilder geordnet nacheinander ausgerichtet werden. Der Name des ersten Bildes ändert sich, was darauf hinweist, dass es mit den anderen Bildern verknüpft wurde. Gleichzeitig werden die verknüpften Bilder im Arbeitsbereich rechts neben dem Folienfach angezeigt.
   5. Richten Sie die Bilder an diesem Punkt entweder mit automatischer Ausrichtung, halbautomatischer Ausrichtung oder manueller Ausrichtung aus. Es ist immer vorzuziehen, zuerst die automatische Ausrichtung zu versuchen. Für die automatische Ausrichtung drücken Sie die Schaltfläche Weiter in den Workflowschritten (Schritt 3) im Menüband.
   6. Überprüfen Sie die automatische Ausrichtung, indem Sie verschiedene Positionen des Gewebes navigieren und visuell überprüfen, ob die entsprechenden Strukturen in verschiedenen Bildern in den beiden Dimensionen des Bildes auf die gleiche Weise angeordnet sind.
   7. Wenn das Ergebnis der automatischen Ausrichtung nicht zufriedenstellend ist, verbessern Sie es mit Pins (verwenden Sie mindestens drei Pins pro Bild), die homologe Gewebemerkmale in den verknüpften Bildern anzeigen. Sobald die Pins an homologen Stellen in den verknüpften Bildern platziert sind, hat der Benutzer zwei Möglichkeiten: halbautomatische Ausrichtung oder manuelle Ausrichtung. Für die halbautomatische Ausrichtung klicken Sie auf die Schaltfläche Auto-Align basierend auf den aktuellen Punktpunkten im Menüband. Für die manuelle Ausrichtung klicken Sie auf die Schaltfläche Pins auf dem Menüband anwenden.
   8. Wenn Sie mit der Ausrichtung zufrieden sind, klicken Sie in den Workflowschritten auf die Schaltfläche Weiter, und speichern Sie das zusammengesetzte Bild in der Datenbank.
      HINWEIS: Das Ausrichten von sechs Folien mit 11 Markern sowie den H&E- und PSR-Bildern dauerte 15 min in der vorgestellten Analyse.
2. Durchführung der Gewebeerkennung mit dem benutzerdefinierten Protokoll Analyseprotokollpaket 1 (APP 1, Tabelle 1).
   1. Öffnen Sie das Bildanalysemodul der Software, indem Sie im Menüband auf die Registerkarte Bildanalyse klicken.
   2. Importieren Sie das zusammengesetzte (ausgerichtete) Bild, indem Sie zu Datei | Datenbank und Auswahl des Bildes von Interesse und Klicken auf die Registerkarte Bildanalyse.
   3. Öffnen Sie das APP-Auswahldialogfeld, indem Sie auf das Symbol APP öffnen klicken und auswählen, welches Analysis Protocol Package (APP) verwendet werden soll. Wählen Sie in diesem Fall APP 1 für die Gewebeerkennung aus.
   4. Sobald APP 1 geöffnet ist, bestätigen Sie, dass APP1 ordnungsgemäß funktioniert, indem Sie zu einer ausgewählten Gewebeposition gehen und auf die Schaltfläche Vorschau klicken. Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
   5. Klicken Sie hier, um APP 1 auszuführen und das Bild mit der ausgewählten APP zu verarbeiten.
   6. Exportieren Sie die Daten (z. B. Bilder, Messungen usw.), wenn die Analyse durchgeführt wird, indem Sie auf Datei/Export klicken.
      HINWEIS: APP 1 erstellt eine Region von Interesse (ROI), die das Gewebe (ROI-Gewebe) abgibt und berechnet den Bereich des Gewebes.
   7. Speichern Sie das geänderte Bild mit dem neu erstellten ROI, indem Sie zu Datei | Speichern.
      HINWEIS: Die Erkennung des Gewebes und die Erstellung eines ROI mit APP 1 im bereitgestellten Beispiel dauerte 5 min in der beschriebenen Bildanalysestation. Der Bereich des verarbeiteten Gewebes betrug 3,2 cm².
3. Durchführung der Gewebesegmentierung in Stroma und Parenchym mit APP 2 (Tabelle 1).
   HINWEIS: APP 2 arbeitet am vordefinierten ROI-Gewebe. APP 2 segmentiert das Gewebe in die ROIs Stroma und Parenchym.
   1. Öffnen Sie das Modul Bildanalyse, indem Sie im Menüband auf die Registerkarte Bildanalyse klicken.
   2. Importieren Sie das Bild, das das ROI-Gewebe enthält, indem Sie zu Datei | Datenbank und Auswahl des in Schritt 6.2.7 gespeicherten Bildes. Kehren Sie zur Registerkarte Bildanalyse zurück, und laden Sie das Bild, indem Sie auf die Schaltfläche Laden im Folienfachklicken. Das Bild wird im Folienfach und im Arbeitsbereich angezeigt.
   3. Öffnen Sie APP 2 mit dem APP-Auswahldialog wie in 6.2.3.
   4. Vorschau APP 2 durch Verarbeitung in einem ausgewählten Sichtfeld. Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, führen Sie APP 2 auf dem vollständigen Bild aus, indem Sie auf die Schaltfläche Ausführen klicken. Als Ausgang von APP 2 wird das ROI-Gewebe in den ROIs Stroma und Parenchyma segmentiert und deren jeweilige Bereiche bestimmt. Exportergebnisse wie in 6.2.6. Speichern Sie das geänderte Bild wie in 6.2.7.
      HINWEIS: Die Segmentierung des Gewebes in Stroma und Parenchym mit APP 2 dauerte 4 h in der vorgestellten Analysestation. Der Bereich des verarbeiteten Gewebes betrug 3,2 cm².
4. Identifizieren und quantifizieren Sie FoxP3^hiCD4+ Zellen mit dem benutzerdefinierten Protokoll APP 3 (Tabelle 1).
   HINWEIS: APP 3 arbeitet auf den vordefinierten ROIs Stroma und Parenchyma.
   1. Öffnen Sie das Modul Bildanalyse, und importieren Sie das Bild mit den ROIs Stroma und Parenchyma wie in 6.3.1 und 6.3.2. Öffnen Sie APP 3 mit dem APP-Auswahldialog wie in 6.2.3.
   2. Vorschau app 3 Verarbeitung in einem ausgewählten Sichtfeld in FoxP3^hiCD4+ Zellen angereichert. Wenn die Ergebnisse zufriedenstellend sind, führen Sie APP 3 auf dem vollständigen Bild aus. Als Ausgabe von APP 3 werden alle einzelnen FoxP3^hiCD4+ Objekte beschriftet und ihre Gewebekoordinaten gespeichert. Die Dichten von FoxP3^hiCD4+ Objekten in den ROIs Stroma und Parenchyma werden bestimmt. Exportieren Sie die Ergebnisse wie in 6.2.6.
   3. Führen Sie gewebewärmemapping von FoxP3^hiCD4+ beschrifteten Objekten durch.
      1. Öffnen Sie das benutzerdefinierte Protokoll FoxP3^hiCD4+ MAP mit dem APP-Auswahldialog wie in 6.2.3.
         HINWEIS: FoxP3^hiCD4+ MAP verwendet die Koordinaten von FoxP3^hiCD4+ beschrifteten Objekten zur Erzeugung von Dichte-Heatmaps. Das Identifizieren und Zählen von FoxP3^hiCD4+ beschrifteten Objekten mit APP 3 dauerte 25 min in der beschriebenen Bildanalysestation. Der Bereich des verarbeiteten Gewebes betrug 3,2 cm².
      2. Führen Sie FoxP3^hiCD4+ MAP aus, indem Sie die Run-Taste drücken. Exportieren Sie die Tissue-Heatmap, indem Sie auf Datei | Export | Arbeitsbereich.
         HINWEIS: Mapping FoxP3^hiCD4+ beschriftete Objekte mit FoxP3^hiCD4+ MAP nahm 5 min in der Bildanalysestation beschrieben.
5. Identifizieren und quantifizieren Sie CD8+, CD68+, MPO+, SMA und CD34 + Objekte mit den benutzerdefinierten Protokollen APP 4, APP5, APP6, APP7 und APP 8 bzw. (Tabelle 1), wie in Abschnitt 6.4 bis 6.4.3.2 beim Laden der APP von Interesse in jedem Fall.
   HINWEIS: APPs 4 bis 8 arbeiten an den vordefinierten ROIs Stroma und Parenchyma.

Results

Überblick über die Strategie zur Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Zellpopulationen, die für das TME von Interesse sind
Um Zellpopulationen von Interesse (COIs) in verschiedenen Gewebeteilen (TCs) zu quantifizieren und ihre räumliche Organisation zu charakterisieren, haben wir einen Workflow entwickelt, der erschwingliche und benutzerfreundliche Techniken integriert und die Positionsinformationen maximiert, die aus wertvollen klinischen FFPE-Proben gewonnen werden können (Abbildung 1). Zunächst wurden serielle FfPE-Abschnitte des ganzen Gewebes zur Visualisierung von COIs (z. B. Immunzellen) und TCs (z. B. Stroma versus Parenchym) gefärbt (Abbildung 1, Schritt 1). Die Anzahl der aufeinander folgenden Abschnitte, die gefärbt werden sollen, sollte auf ein Minimum beschränkt werden, das die Visualisierung der Zellen von Interesse oder Gewebemerkmale ermöglicht, die für die Behandlung der Forschungsfrage erforderlich sind. Je kleiner die Anzahl der seriellen Abschnitte, desto höher ist die Ähnlichkeit der Gewebearchitektur und Konkordanz über zusammenhängende Abschnitte hinweg. Darüber hinaus kann die Multiplexing-Fähigkeit durch Wiederverwendung von fluoreszierend gefärbten Abschnitten durch Stripping- und Reprobing-Techniken¹⁹erweitert werden.

Sobald die Färbeschritte abgeschlossen waren, wurde ein ganzer Diascanner verwendet, um die Bilder zu digitalisieren. Bilder, die aus seriellen Abschnitten aufgenommen wurden, wurden automatisiert in eine virtuelle Multiplexfolie ausgerichtet und konsolidiert(Abbildung 1, Abschnitt 2). Als Nächstes wurde ein ROI für das Gewebe mit einem benutzerdefinierten Protokoll abgegrenzt, das gewebeassoziierte Pixel (TAPs) identifizierte (Abbildung 1,Schritt 3). Anschließend wurde das ROI-Gewebe in TCs segmentiert, die als zusätzliche ROIs definiert wurden. (Abbildung 1, Schritt 4). Als Nächstes wurden von benutzerdefinierten Protokollen COIs in verschiedenen TCs erkannt und quantifiziert (Abbildung 1, Schritt 5). Schließlich wurden Gewebe-Heatmaps von COIs auf der Grundlage ihrer Dichte und ihrer Gewebekoordinaten erstellt(Abbildung 1,Schritt 6).

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Strategie zur Visualisierung, Quantifizierung und Kartierung von Immunzellen im TME. (1) Serielle ganze Gewebeabschnitte wurden für die Kennzeichnung von COIs und TCs gebeizt. Gefärbte ganze Gewebeabschnitte wurden mit einem ganzen Diascanner digitalisiert. (2) Bilder, die aus seriellen Abschnitten stammen, wurden mithilfe eines Tissuealign-Analysemoduls automatisiert verknüpft, ausgerichtet und mitregistriert. Aus der hochpräzisen Ausrichtung einzelner Bilder wurde ein zusammengesetztes Bild erzeugt. (3) Ein benutzerdefiniertes Protokoll wurde zur automatisierten Erkennung von gewebeassoziierten Pixeln (TAPs) im zusammengesetzten Bild verwendet. (4) Das Gewebe wurde in TCs (z. B. Stroma und Parenchym) segmentiert, die als ROIs definiert sind. (5) Benutzerdefinierte Protokolle wurden zur automatisierten Detektion und Quantifizierung von COIs in verschiedenen TCs verwendet. (6) Gewebe-Heatmaps von COIs wurden erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Imaging COIs und TCs
Drei serielle FFPE-Ganzesgewebeabschnitte des resezierten Tumors von einem Subjekt mit HBV-assoziiertem hepatozellulärem Karzinom wurden in einer oder mehreren Färberunden gefärbt, wie in Abbildung 2Abeschrieben. Abschnitt I wurde mit H&E befleckt, um die Gewebearchitektur, die Zellmorphologie zu zeigen und klinisch relevante Parameter wie Malignität, Tumorgrad und Gesamtbewertung der Immuninfiltration zu bestimmen (Abbildung 2C). In zusammenhängendem Abschnitt II wurden zwei Runden mIF zur Kennzeichnung von leberparenchymalen und nicht parenchymalen Zellen verwendet (Abbildung 2A). In der ersten Runde wurden normal- und Tumorgefäße mit CD34-Färbung von Endothelzellen visualisiert. Zusätzlich wurden Epithelzellen (Hepatozyten und Cholangiocyten) mit Cytokeratin 8/18 identifiziert, und fibrogene aktivierte hepatische stellate Zellen wurden als alphaglatte Muskelaktin-positive Zellen identifiziert(SMA+)Zellen ( Abbildung 2C). Nach der Bildaufnahme wurden Gewebeabschnitte abgestreift und mit Antikörpern gegen Makrophagen (CD68) und Myofibroblasten (Desmin) resoniert. Um das Tumorimmuninfiltrat besser charakterisieren zu können, wurde der benachbarte serielle Abschnitt III mit zwei Runden mIF für die Zellmarker CD3, CD4, CD8, Gabelstapler P3 (FoxP3) und Myeloperoxidase (MPO) gebeizt. In allen Fällen wurde DAPI als nukleare Gegenfärbung eingesetzt. Schließlich wurde Abschnitt III mit PSR-Färbung befleckt und mit schnellem Grün kontragefärbt, um fibrillares Kollagen zu visualisieren und das Gewebe in Stroma und Parenchym zu segmentieren (Abbildung 2C).

Ein ganzer Diascanner mit 20-fachem Objektiv wurde verwendet, um gebeizte Abschnitte zu digitalisieren und virtuelle Dias zu erstellen. Aus den drei seriellen Abschnitten (Abbildung 2B) wurden sechs Bilder aufgenommen und die virtuellen Dias anschließend mit der VIS-Software gemäß der schematischen Darstellung in Abbildung 1analysiert.

Bildanalyse
Die Bildanalyse bestand aus fünf Schritten: 1) Gewebeausrichtung; 2) Gewebedetektion; 3) Gewebesegmentierung; 4) automatisierte Quantifizierung der COIs; und 5) Gewebewärmekartierung. Alle Protokolle zur Bildanalyse wurden mit dem Author-Modul der Bildanalyse-Software entwickelt und werden im Text als APP bezeichnet.

Gewebeausrichtung
Sechs virtuelle Dias aus drei seriellen Abschnitten mit 11 Markern plus H&E- und PSR-Flecken wurden in das Tissualign-Modul der Bildanalysesoftware geladen. Als nächstes wurden die Bilder automatisiert verknüpft, ausgerichtet und mitregistriert, wodurch ein virtuelles Zusammengesetzten Bild mit 11 Plex plus H&E und PSR generiert wurde, das alle Ebenen der einzelnen Bilder enthält (Abbildungen 2A–C). Die Ausrichtung war bei Bildern, die aus benachbarten seriellen Abschnitten stammen, genau und zeigte entsprechende Gewebestrukturen, die nach der Ausrichtung homologe und angeordnet sind (Abbildung 2C und Abbildung S1A). Darüber hinaus war die Ausrichtung auf der einzelnen Zellebene für Bilder aus demselben Abschnitt präzise (Abbildung S1B). Die Zeit für die automatische Ausrichtung hängt von der Anzahl, Größe, Komplexität und Ähnlichkeit der zu richtenden Bilder ab. Die Ausrichtung der oben genannten sechs virtuellen Dias dauerte 15 min in unserer VIS-Station.

Abbildung 2: Färbung von seriellen Gewebeabschnitten und Bildausrichtung. (A) Zusammenfassung der Färbungen auf drei seriellen Abschnitten zur Visualisierung von COIs und TCs. Zahlen in Klammern zeigen die Bildbezeichnung an. Für die Abschnitte II und III wurden Gewebe abgestreift und mit einem zweiten Cocktail von Antikörpern nachgeforscht. (B) Übersicht über sechs einzelne Gesamtgewebebilder vor und nach der Gewebeausrichtung (links bzw. rechts). Maßstabsleiste = 3.500 m . (C) Vergrößerte Ansicht der ausgerichteten Bilder. Maßstabsleiste = 80 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Gewebeerkennung
Nachdem die Bilder verknüpft und ausgerichtet wurden, versuchten wir, die TAPs zu identifizieren (Abbildung 3A). Um eine APP für die automatisierte Erkennung von TAPs (APP 1, Tabelle 1) zu entwerfen, haben wir zwei Eigenschaften genutzt, die TAPs von Pixeln unterscheiden, die nicht mit Gewebe assoziiert sind. Erstens ist das DAPI-Signal (blaues Band) auf die Kerne beschränkt, die sich ausschließlich im Gewebe befinden, was bedeutet, dass alle DAPI+-Pixel eine Teilmenge von TAPs sind. Zweitens haben TAPs ein höheres Autofluoreszenzsignal im grünen und gelben Band im Vergleich zu Pixeln, die nicht mit dem Gewebe assoziiert sind. Daher haben wir APP 1 für die Gewebedetektion entwickelt (Tabelle 1), die die TAPs anhand von Basissignalen in diesen Kanälen mit einfachen Schwellenwerttechniken erkennt. Schwellenwerte für die blauen, grünen und gelben Bänder wurden so festgelegt, dass TAPs Hintergrundintensitätswerte über den Schwellenwerten hatten, während Pixel, die nicht mit dem Gewebe verknüpft waren, Werte unten hatten. APP 1 für die Gewebeerkennung wurde auf Bild IIA angewendet, das Schichten in den blauen, grünen und gelben Kanälen enthält (Abbildung 3A). Als Ausgänge von APP 1 wurde eine hellgrüne Maske über den TAPs gelegt und ein ROI namens "Tissue" abgegrenzt (Ausgabe, Abbildung 3A). Darüber hinaus wurde der Bereich des Gewebes als quantitative Ausgangsvariable bestimmt. Da APP 1 die Pixel, die nicht mit dem Gewebe verbunden sind, nicht in das ROI-Gewebe einbezieht, wurden sie von der nachfolgenden Analyse auf der Grundlage dieses ROI ausgeschlossen (Abbildung 3A). Die Genauigkeit von APP 1 bei der Identifizierung von TAPs ist in Abbildung 3Adargestellt.

Gewebesegmentierung und Abgrenzung von ROIs für TCs
Als nächstes haben wir verschiedene Fächer innerhalb des ROI-Gewebes definiert, indem wir das Gewebe in Stroma versus Parenchym segmentiert haben. Wir verwendeten das PSR-Gebeikbild (IIIC, Abbildung 2C), wo der Stroma als der Bereich definiert werden kann, der mit der Ablagerung von fibrillaren Kollagenen (rotes Band) verbunden ist, das Parenchym als den Bereich, in dem fibrillare Kollagene fehlen, und der schnelle grüne Gegenfärbungsfarbstoff vorherrscht (grünes Band) (Abbildung 3B). Wir haben APP 2 (Tabelle 1) erstellt, um die TCs Stroma und Parenchyma digital abzugrenzen. Diese APP arbeitet auf dem vordefinierten ROI-Gewebe (Ausgabe, Abbildung 3A) und verwendet repräsentative Stroma- und Parenchymbereiche für die Schulung des im Modul Bildanalyse integrierten Klassifier-Tools. Der geschulte Klassifier weist die Pixel entweder einem Stroma- oder einem Parenchym-Etikett zu (Lachs bzw. Grün, Abbildung 3B). Nach der Klassifizierung von Pixeln führte APP 2 morphologische Operationen durch, die darauf abzielten, die ROIs Stroma und Parenchym zu definieren (Abbildung 3B und Tabelle 1). Die Leistung von APP 2 bei der Klassifizierung von Pixeln und der Generierung der jeweiligen ROIs ist in Abbildung 3Bdargestellt. Zusätzlich quantifiziert APP 2 die Fläche des Stromas und des Parenchyms. Obwohl die Segmentierung mit dem PSR-Gefärbten abschnittsweise erfolgt, können die umrissenen Stroma- und Parenchym-Bereiche auf jedes Bild übertragen werden, das am PSR-Bild ausgerichtet ist.

Abbildung 3: Automatisierte Gewebedetektion/-segmentierung und Generierung der jeweiligen ROIs. (A) Bild IIA wurde verwendet, um die TAPs zu identifizieren (linkes Bild, Maßstabsleiste = 6.000 m). Eine hellgrüne Maske wurde den TAPs mit APP 1 (Tabelle 1) zugewiesen, die einen ROI namens Gewebe (Ausgang 1) erzeugte. Rechts zeigt die Einlage die vergrößerte Ansicht an, die die Genauigkeit von APP 1 beim Erkennen von TAPs demonstriert. Skala bar = 350 m. (B) Das ROI-Gewebe (Ausgang 1) wird mit APP 2 in Stroma und Parenchym segmentiert. Das Bild links zeigt eine Ansicht des ROI-Gewebes, segmentiert in ROI stroma (Lachs) und ROI Parenchym (grün). Skala bar = 4.500 'm. Auf der rechten Seite zoomten Ansichten des Einfalls für ROI Tissue, der ursprünglichen PSR-Färbung (Bild IIIC) und der ROIs stroma und parenchyma. Skalenbalken = 250 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Automatisierte Quantifizierung von COIs
Als Nächstes haben wir COIs in den ROIs Stroma und Parenchyma identifiziert, lokalisiert und quantifiziert. ApPs 3 bis 8 (Tabelle 1) wurden erstellt, um die folgenden COIs zu suchen und zu zählen: CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+, MPO+, SMA+ und CD34+-Zellen. APP 3 wurde entwickelt, um CD4+FoxP3+-Zellen (Bild IIIA, Abbildung 2C) als Ersatzmarker von regulatorischen T-Zellen (Tregs) zu lokalisieren und zu zählen. Dieses Protokoll erkennt die Kolokalisierung des Signals aus dem nuklearen Transkriptionsfaktor FoxP3 (rotes Band) und dem DNA-Etikettierungsfarbstoff DAPI (blaues Band). Angesichts der Tatsache, dass kürzlich aktivierte T-Zellen FoxP3 hochregulieren, legen wir für Tregs Schwellenwerte für die Vorauswahl nur heller FoxP3+-Zellen fest (FoxP3^hi). Als nächstes wurden von allen vorgewählten DAPI+FoxP3-Hi-Zellen nur diejenigen, die von hellen ringförmigen CD4-Signalen (grünes Band) umgeben waren, beschriftet und als FoxP3^hiCD4+ Zellen gezählt (rosa Label, Abbildung 4A).^hi Die Dichte der FoxP3^hiCD4+ Zellen in den ROIs Stroma und Parenchyma wurde als quantitative Ausgangsvariablen von APP 3 (Abbildung 4A) bestimmt.

In ähnlicher Weise wurden APPs 4 bis 6 für die Erkennung von CD8+-, CD68+- und MPO+-Zellen entwickelt. Diese APPs haben denselben Basisentwurf für die Erkennung und Quantifizierung von COIs. Insbesondere werden COIs anhand der Signalintensität des spezifischen Zellpopulations-Biomarkers identifiziert, und dann werden mehrere morphologische Schritte nach der Verarbeitung ausgeführt, um einzelne Zellen abzugrenzen (Tabelle 1). Die einzelnen Zellen oder COIs werden beschriftet, gezählt und ihre Gewebekoordinaten registriert. DIE APPs 4 bis 6 bestimmen auch die Dichte der COIs in den ROIs Stroma und Parenchyma (Abbildung 4B–D).

Die Qualität unserer DAPI-Färbung war nicht gut genug, um die Kernsegmentierung in APPs 3 bis 6 zu integrieren, so dass wir nicht sicherstellen können, dass alle einzeln gekennzeichneten Objekte einzelne Zellen sind. Aus diesem Grund haben wir die Dichte der Zellen in Deranzahl der markierten Objekte/mm² (Abbildung 4) ausgedrückt. In den in APPs 3 bis 6 integrierten Nachbearbeitungsschritten wurden Zellaggregate jedoch erfolgreich in einzelne Zellen getrennt, und eine umfassende visuelle Untersuchung zeigte, dass die meisten beschrifteten Objekte einzelnen Zellen entsprachen.

Für die Erfassung des Bereichs SMA+ und CD34+ haben wir APPs 7 bzw. 8 entwickelt (Tabelle 1). Beide APPs erkennen das spezifische Signal auf der Grundlage von Schwellenwerten und bestimmen den Prozentsatz der positiven Fläche in den ROIs Stroma und Parenchyma (Abbildung 4E–F).

Eine der interessantesten Möglichkeiten zum Generieren virtueller Multiplex-Folien ist die Analyse des Colokalisierungsausdrucks. Wir generierten APP 10, um die Kolokalisierung zwischen SMA und Desmin zu erkennen, zwei Marker, die durch Myofibroblasten in der Leber koausgedrückt werden. APP 10 verwendet Schwellenwerte für die Suche nach Pixeln positiv für sMA, desmin und sMA plus desmin (Tabelle 1). Als quantitative Ausgangsvariablen bestimmt APP 10 den Bereich sMA+, den Desmin+-Bereich und den Bereich der kolokalisierten Expression dieser beiden Marker (Abbildung S3).

Abbildung 4: Identifizierung und Quantifizierung von COIs in den TCs stroma und Parenchym. (A–F) Automatisierte Erkennung und Quantifizierung von CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+, MPO+, SMA+und CD34+ COIs in den ROIs Stroma und Parenchyma unter Verwendung der Protokolle 3, 4, 5, 6, 7 bzw. 8(Tabelle 1). Links sind die Originalbilder, in der Mitte die verarbeiteten Bilder und rechts die Quantifizierungen zu sehen. Für die Abbildungen 4A–Dist die Skala bar = 40 m. Für die Abbildungen 4E und F, skalieren Sie die Leiste = 350 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Als Alternative zur Quantifizierung der COIs in den TCs Stroma und Parenchyma haben wir die Dichte von Immunzellen in den verschiedenen bösartigen Knötchen mit den Namen 1 bis 4 ermittelt (Abbildung 5A, Hund I). Der ROI für jeden Knötohne wurde manuell abgegrenzt, wie in Abbildung 5Aangegeben. Auffällige Gewebe-Immunsignaturen charakterisierten jeden Knötper und zeigten die intrinsische Heterogenität des TME weiter.

Gewebe-Heatmaps
Wie oben erwähnt, speichern APPs 3 bis 8 die Gewebekoordinaten jedes einzeln beschrifteten Objekts. Diese Funktion ermöglicht die automatisierte Generierung von Gewebekarten, in denen Regionen mit hoher Dichte einer bestimmten Zellpopulation als Hotspots (rot) und Regionen mit relativ geringer Dichte als kalte Flecken (dunkelblau) angezeigt werden. Mitteldichtewerte werden Farben entsprechend der in Abbildung 5dargestellten Farbskala zugewiesen. Gewebe-Heatmaps wurden von APPs generiert, die die Bilder in Kreise mit einem Durchmesser von 50 m unterteilten und eine Farbe entsprechend der relativen Dichte eines bestimmten COI innerhalb des Kreises zuordneten. Wie in Abbildung 5B-Gdargestellt, waren die Positionierungsmuster und die Intensitätsverteilung der verschiedenen COIs in der TME recht unterschiedlich. Darüber hinaus war auf der Ebene der einzelnen Knötchen die Anordnung verschiedener Populationen im Gewebebereich einzigartig (Abbildung S2A–C). Um ein Beispiel für die Leistungsfähigkeit dieser Technik zu geben und die räumliche Organisation von Hotspots aus verschiedenen Populationen im selben Knoten zu visualisieren, wurden die Hotspots aus einzelnen Zelltypen manuell extrahiert und zusammen auf die Umrisse von Knoten 2 gruppiert (Abbildung S2, Abbildung Dund Abbildung E).

Abbildung 5: Gewebe-Heatmaps von COIs in der TME. (A) Picrosirius Rote Färbung zeigt Position der Knötchen 1, 2, 3 und 4. (B–G) Gewebe-Heatmaps für CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+, MPO+, CD34+ bzw. SMA+ COIs. Dunkelblau zeigt eine relativ niedrige Dichte an, und Rot zeigt eine relativ hohe Dichte an. Mitteldichtewerte werden entsprechend der angezeigten Farbskala Mitfarben zugewiesen. (H und I) Quantifizierung der COIs in den Knötchen 1, 2 und 3 + 4, die pro Zelltyp bzw. Pro Knoten organisiert sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S1: Validierung der Gewebeausrichtung. (A) CD34 Färbung (rot) auf Abschnitt II (Eingang 1) wird zur Erzeugung einer CD34-Maske in grün (Ausgang 1) verwendet. Die grüne Maske (Ausgang 1) wird auf dem H&E-Bild aus dem ausgerichteten seriellen Abschnitt I (Eingang 2) überlagert. Das Verschmelzungsbild zeigt eine perfekte Entsprechung von Gefäßstrukturen. Skalenbalken = 50 m. (B) Bild IIIA, das die Zusammenführung von DAPI, CD4 und FoxP3 (Eingang 1) anzeigt, wurde verwendet, um ein Label für CD4+FoxP3+-Zellen zu generieren (Ausgang 1 in Magenta). Ausgabe 1-Label wurde auf ausgerichtetes Bild IIIB übertragen (Eingang 2) und zeigt eine perfekte Übereinstimmung zwischen den Paaren FoxP3/DAPI und CD4/CD3 im Zusammenführungsbild. Skalenbalken = 15 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S2: Vergrößerte Ansicht von Gewebe-Heatmaps. (A–C) Gewebe-Heatmaps für CD4+FoxP3+-, CD8+-, CD68+- und MPO+-Zellen in Knoten 1–4. Die Skalenstäbe in den Knötchen 1, 2 und 3 + 4 stellen 1.500 m, 700 m bzw. 500 m dar. (D) Umriss von Knötohne 2 mit schwarzer durchgezogener Linie. (E) Hot Spots für CD4+FoxP3+, CD8+, CD68+ und MPO+ Zellen in Knoten 2 wurden extrahiert und zusammen auf die in Ddefinierte Kanallinie 2 abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung S3: Kolokalisierungsanalyse. (A) Auf der linken und mittleren Seite sind Bilder des SMA-Labels in grün und desmin label in rot bzw. Auf der rechten Seite befindet sich ein doppelpositiver Bereich in Gelb. (B) Quantifizierung der Fläche von SMA+, Desmin + und desMin-Doppelpositivbereichs. Skalenbalken = 150 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

App	Zweck	Klassifizierung	Klassifizierung	Nachbearbeitungsschritte	Ausgabevariablen
		Methode	Funktionen
			(Pixelwert)
1	Gewebeerkennung	Schwelle	Kanal-DAPI (150)	o Beschriftung von Objekten mit kolokalisierten Überschwellwerten für die 3 Kanäle	o ROI Gewebe
			Kanal FITC/A488 (120)	o Positives Objekt 5 Pixel schließen	o Gewebebereich
			Kanal TRITC/A568 (40)	o ROI-Gewebe erstellen
2	Gewebesegmentierung	Decision Forest	RGB-R Median	o Fülllöcher	o ROI Stroma
			RGB-G Median	o ROI Stroma erstellen	o Stroma Bereich
			RGB-B Median	o ROI Parenchym erstellen	o ROI Parenchym
			IHS-S Median		o Parenchyma-Gebiet
			H&E Eosin Median
3	So suchen und quantifizieren Sie CD4+ FoxP3+-Zellen	Schwelle	Kanal-DAPI (>600)	o Label-Objekte mit Kolokalisierung von DAPI und Cy5/A647, umgeben von FITC/A488-Signal	o Anzahl und Dichte von CD4+FoxP3+-Zellen in ROIs Stroma und Parenchym
			Kanal FITC/A488 Polyglättung (>850)	o Klare Objekte kleiner als 7 m2	o Koordinaten einzelner CD4+FoxP3+ Zellen
			Kanal Cy5/A647(>800)
4	So suchen und quantifizieren Sie CD8+-Zellen	Schwelle	Kanal-DAPI (<1200)	o Klare positive Objekte kleiner als 15 m2	o Anzahl und Dichte von CD8+-Zellen in ROIs Stroma und Parenchym
			Kanal Cy5/A647 Median (>80)	o Schließen positiver Objekte 2 Pixel	o Koordinaten einzelner Zellen
				o Separate Objekte
5	So suchen und quantifizieren Sie CD68+-Zellen	Schwelle	Kanal FITC/A488 (>200)	o Klare positive Objekte kleiner als 20m2	o Anzahl und Dichte von CD68+-Zellen in ROIs Stroma und Parenchym
				o Positive Objekte 3 Pixel dediieren	o Koordinaten einzelner CD68+-Zellen
				o Separate Objekte
6	So suchen und quantifizieren Sie MPO+-Zellen	Schwelle	Kanal-DAPI (>400)	o Klarseinsichte Objekte kleiner als 5 m2	o Anzahl und Dichte von MPO+-Zellen in ROIs Stroma und Parenchym.
			Kanal TRITC/A568 (900-4000)	o 3 Pixel positive Objekte dediieren	o Koordinaten einzelner MPO+-Zellen.
				o Separate Objekte
7	So suchen und quantifizieren Sie den Bereich "SMA+"	Schwelle	Kanal TRITC/CF568 (>1050)	o Klare positive Objekte kleiner als 25 m2	o Anzahl und Dichte des SMA+-Gebiets in ROIs Stroma und Parenchym
				o 3 Pixel positive Objekte dediieren	o Koordinaten von SMA+ Pixeln
8	So suchen und quantifizieren Sie den CD34+-Bereich	Schwelle	Kanal-DAPI (<5000)	o Klare positive Objekte kleiner als 25 m2	o Anzahl und Dichte der CD34+-Fläche in ROIs Stroma und Parenchym
			Kanal Cy5/A647 Median (>120)	o 3 Pixel positive Objekte dediieren	o Koordinaten von CD34+ Pixeln
9	Erstellen von Gewebe-Heatmaps für eine bestimmte Zellpopulation	Objekt Heatmap	Objekt Heatmap		o Heatmap
			Zeichnungsradius 50 'm	---
10	Quantifizierung der Kolokalisierung zwischen SMA und Desmin	Schwelle	Kanal TRITC (CF568) (>1050)	o Beschriftungsobjekte mit über den Schwellenwerten für TRITC (CF568)	o Quantifizieren der kolokalisierten Expression von SMA und Desmin
			Kanal Cy5 (A647) (>1000)	o Beschriftungsobjekte mit über den Schwellenwerten für Cy5 (A647)
				o Label-Objekte mit Kolokalisierung von oben genannten Schwellenwerten für TRITC (CF568) und Cy5 (A647)
				o Klare positive Objekte kleiner als 25 m2

Tabelle 1: Allgemeine Parameter, die für die Gestaltung von APPs verwendet werden, die für die Bildanalyse verwendet werden. Die in dieser Tabelle angegebenen Parameter werden an die eindeutigen Eigenschaften der in dieser Analyse verwendeten Bilder angepasst (z. B. Hintergrund, Artefakte usw.) und sind möglicherweise nicht auf andere Bilder anwendbar. Da die genannten Nachbearbeitungsschritte für die in dieser Studie analysierten spezifischen Bilder definiert wurden, sind sie absichtlich nicht detailliert. Der Benutzer sollte die APPs an die zu analysierenden Bilder anpassen.

Abschnitt/Färbung	Primärer Antikörper	Sekundärer Antikörper
Abschnitt II/1st Färbung	Maus IgG2a anti-human Maus IgG1 antihuman CD34 Kaninchen anti-human es Cytokeratin 8/18	Ziege Anti-Maus IgG2a CF568 Ratte Anti-Maus IgG1 A647 Esel Anti-Kaninchen A488
Abschnitt II/2nd Färbung	Kaninchen anti-human Desmin Maus Anti-Mensch CD68	Esel Anti-Kaninchen A647 Esel Anti-Maus DyLight 755
Abschnitt III/1st Färbung	Maus Anti-Human CD4 Kaninchen anti-human FoxP3 Ziege anti-human MPO	Esel Anti-Maus A488 Esel Anti-Kaninchen A647 Esel Anti-Ziege A568
Abschnitt III/2nd Färbung	Kaninchen anti-human CD3 Maus Anti-Human CD8	Esel Anti-Maus DyLight 755 Esel Anti-Kaninchen A647

Tabelle 2: Primär-Sekundärantikörperpaare für mIF.

Discussion

Einfache, zugängliche und einfach auszuführende Multiplexing-Techniken, die eine räumliche Auflösung von Immunzellen in Gewebeabschnitten ermöglichen, sind erforderlich, um die Immunlandschaft bei Krebs und anderen immunologischen Störungen abzubilden. Hier beschreiben wir eine Strategie, die weit verbreitete Etikettierungs- und digitale Analysetechniken integriert, um die Multiplexing-Fähigkeit und die multidimensionale Bewertung von Bildgebungs-Assays^12,13,17,19zu erweitern. Die Färbung von drei seriellen Abschnitten für verschiedene Marker und die Wiederverwendung von Abschnitten durch Stripping- und Reprobing-Techniken ermöglichten es uns, 11 Parameter zusätzlich zu H&E- und PSR-Färbungen zu visualisieren. Sechs Bilder aus diesen Abschnitten wurden mit dem Gewebeausrichtungsmodul automatisiert ausgerichtet. Die Ausrichtung war auf der einzelnen Zellebene für Bilder aus demselben Abschnitt präzise und für Bilder aus benachbarten Abschnitten sehr konkordante. Virtuelles Multiplexing ermöglichte es uns zu bestimmen, wie Marker, die in einem Abschnitt visualisiert werden, räumlich mit Markern in einem anderen zusammenhängenden Abschnitt in Beziehung stehen. Während einige der Färbungen COIs markierten, bezeichneten andere TCs, so dass wir COIs in den verschiedenen TCs quantifizieren konnten. Der Einsatz von Software-Tools zur automatisierten Quantifizierung von COIs vereinfachte und beschleunigte die Verarbeitung von Bildern erheblich. Darüber hinaus wurde die digitale Analyse auf ganze Gewebeabschnitte anstelle ausgewählter Sichtfelder angewendet, was zu einer unvoreingenommenen Darstellung der TME führte. Da die Gewebekoordinaten von COIs registriert wurden, war es zudem möglich, Gewebe-Heatmaps zu erstellen.

Es gibt mehrere Bereiche in diesem Protokoll, in denen eine Fehlerbehebung erforderlich sein kann. Erstens kann ein schlechter Antigenabruf die Qualität von mIF beeinflussen, daher sollten die Art des Antigen-Abrufpuffers und die Dauer für die spezifischen Assay-/Biomarker-Bedingungen optimiert werden. Zweitens sollte die Art der verwendeten Sperrlösung an die Gewebe/Antigen/Arten von Primär- und Sekundärantikörpern angepasst werden. In unseren Händen, die Zugabe von 10% Gesamtserum von der Spezies, wo das Gewebe von blockierten Fc-Rezeptoren stammt, und damit reduzierte unspezifische Antikörperbindung. Die Zugabe von 10 % des Serums aus der Art, in der die sekundären Antikörper aufgezogen wurden, würde die direkte unspezifische Anhaftung von sekundären Antikörpern an den Gewebeabschnitt minimieren. Drittens ist die Validierung der Spezifität der primären und sekundären Antikörper unter Verwendung der richtigen positiven und negativen Kontrollen von wesentlicher Bedeutung. Viertens sind erhöhte Autofluoreszenz in einigen Kanälen und die Diffusion von DAPI bei primärer Abispperung von Antikörpern ebenfalls üblich. Um die verbesserte Autofluoreszenz zu beheben, verwendeten wir primäre/sekundäre Antikörperpaare, bei denen das spezifische Signal Intensitätswerte von mindestens 5x der des Hintergrunds hatte. Schließlich können einige Antikörper mit hoher Affinität nicht mit regelmäßigen Stripping-Verfahren eluiert werden. In diesem Fall empfehlen wir die Verwendung solcher Antikörper in der letzten Etikettierungsrunde. Der Benutzer muss möglicherweise verschiedene Färbesequenzen ausprobieren, um die optimale Konfiguration für die Antikörper von Interesse zu finden. Die Wirksamkeit des Abisolierens sollte vor einer zweiten oder dritten Etikettierungsrunde bestätigt werden.

Die Hauptbeschränkung und Herausforderung dieser Strategie besteht darin, die richtigen Kombinationen von primären und sekundären fluoreszierenden Antikörpern für die Marker von Interesse zu finden. Die Suche nach primären Antikörpern, die bei verschiedenen Arten oder mit verschiedenen Isotypen aufgezogen werden, die gleichzeitig verwendet werden könnten, ist durch das, was kommerziell erhältlich ist, begrenzt. Die meisten ganzen Diascanner sind mit Lampen und Filtern ausgestattet, die eine Bildgebung von maximal fünf Kanälen ermöglichen, und sekundäre Antikörper bei der richtigen Art und dem rechten Fluorophor sind nicht immer verfügbar. Diese Einschränkungen haben wir teilweise durch serielle Färbungen und sequentielle Beschriftungen überstanden. Möglicherweise müssen mehrere Antikörperkombinationen getestet werden, um die beste Kombination für die Marker von Interesse zu erhalten. Eine weitere Einschränkung ist die Qualität der DAPI-Färbung, da Das Abisolieren und Reprobing möglicherweise nicht immer die Durchführung der Kernsegmentierung ermöglicht.

Das Gewebeausrichtungsmodul erfordert minimale Schulungen und keine Programmierkenntnisse von Benutzern. Die Software ermöglicht theoretisch die Ausrichtung einer unbegrenzten Anzahl von Bildern. Die genaue Ausrichtung hängt jedoch von der Verwandtlichkeit von Abschnitten ab, bei denen nähere Abschnitte, die histologisch konkordantesind, genauer ausgerichtet sind. Wir haben das Author-Modul von VIS zum Generieren der APPs verwendet. Grundlegende Kenntnisse der Bildanalyse sind für die Erstellung von APPs erforderlich, aber dies ist auch der Fall, wenn sie eine andere Bildanalysesoftware verwenden. Zu den einzigartigen Vorteilen von VIS im Vergleich zu anderen Bildanalysesoftware gehören die automatisierte Ausrichtung von Bildern aus Abschnitten, die mit unterschiedlichen Methoden (z. B. IF, Histochemie, IHC) erstellt wurden. Dies ermöglicht Kolokalisierungsstudien mehrerer Marker von Interesse mit virtuellem Multiplexing. Darüber hinaus ermöglicht das flexible und benutzerfreundliche Design von APPs eine benutzerspezifische Anpassung. Automatisierte Quantifizierung und Kartierung sowie die Möglichkeit, ganze Gewebeabschnitte zu verarbeiten, sparen Zeit und reduzieren Verzerrungen im Vergleich zur manuellen Zählung durch visuelle Inspektion.

Diese Strategie ist ein sehr nützliches Forschungsinstrument für die Gewebeimmunologie im Zusammenhang mit Krebs und Autoimmunität, bleibt aber für den klinischen Gebrauch nicht validiert. Mit zusätzlicher Standardisierung und Validierung kann es in Zukunft für mehrere Anwendungen eingesetzt werden (z. B. zur Kartierung der Immunlandschaft bei Krebs, um die Reaktion auf immuntherapeutische Wirkstoffe vorherzusagen und zu überwachen). Es kann auch an verschiedene entzündliche Erkrankungen (z.B. entzündliche Darmerkrankungen) angepasst werden, um pathologische Auswertungen mit prognostischen Biomarkern zu kombinieren.

Die wichtigsten kritischen Schritte in diesem Protokoll sind die Effizienz/Spezifität der Etikettierung und die Robustheit der entworfenen APPs für den vorgesehenen Verwendungszweck oder Biomarker. Daher ist eine regelmäßige Validierung durch visuelle Inspektion, insbesondere bei der Entwicklung einer neuen APP, unerlässlich. Die effiziente Verwendung mehrerer Abisolier- und Reprobing-Runden oder verschiedener Fleckentypen auf demselben Abschnitt sind kritische Komponenten und können gewebe- oder abschnittsspezifisch sein. Die Überprüfung der Effizienz solcher Prozesse vor der Durchführung der Großbatchanalyse ist von entscheidender Bedeutung.

Zusammenfassend bieten wir eine Strategie, die die quantitativen und räumlichen Informationen maximiert, die aus wertvollen klinischen Gewebeproben gewonnen werden können. Die Ressourcen, Ausrüstungen und Kenntnisse, die für die Umsetzung dieser Methode erforderlich sind, sind weithin zugänglich. Wir schlagen diese Methode als nützlichen Leitfaden für die Planung von Assays vor, die darauf abzielen, Immunzellpopulationen in der TME zu identifizieren, zu quantifizieren und zu kartieren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antigen-Retrieval-Lösung: Natriumcitrat-Puffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05 % v/v Tween 20, pH 6,0)
Blockierungslösung: 1 % BSA, 10 % gefiltertes Humanserum, 10 % gefiltertes Eselserum, 0,1 % Tween 20 und 0,3 % Triton in PBS
Rinderserumalbumin (BSA)	Multicell	800-095-EG
Coplin-Dosen (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)	Neueinsteigerbedarf	5300KIT
Cover Slides	Fisherbrand	12-545E 22*50
Direct Red 80	Sigma Aldrich	365548
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9663
Ethanol 100%
Elektrischer Schnellkochtopf	Salton
Eosin	Leica Biosystems	3801600	VORSICHT, Augenreizung
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252	VORSICHT, schädlich durch Einatmen, Verschlucken und Hautabsortierung
FFPE-Sektion (4μ m) Objektträger
Glycin 0,1 M in PBS
Hämatoxylin-Färbelösung, Gil 1. Formulierung, Regular	Strength Ricca Chemical Company	3535-32
Halter (EasyDip Färbeglashalter)	Newcomersupply	5300RK
Human Serum	Gemini	22210
Feuchtigkeitskammer	Millipore Sigma	Z670138-1EA
Pap Pen	abcam	ab2601
PBS
PBS-Tween 20 (0,1 % v/v)
Permount Eindeckmittel	Fisher Chemical	SP15-500
Pikrinsäure 1,3 %	Sigma Aldrich	P6744	VORSICHT, Haut- und Augenreizungen
Picro-Sirius Red/Fast Green Lösung: Fast Green 0,1 % w/v + Sirius Red 0,2 % w/v in 1,3 % Pikrinsäurelösung
Primärer Antikörper Anti-αSMA	Maus IgG2a 1A4	Sigma A2547	Verdünnung 1/100
Primärer Antikörper Anti-CD34	Maus IgG1 HPCA1/763	Novus Biologicals NBP2-44568	Verdünnung 1/250
Primärer Antikörper Anti-Cytokeratin 8/18	Kaninchen EP17/EP30	Agilent IR09461-2	Gebrauchsfertiger
Primärer Antikörper Anti-CD68	Maus KP1	Abcam ab955	Verdünnung 1/200
Primärer Antikörper Anti-Desmin	Kaninchen Polyklonales	Invitrogen PA5-16705	Verdünnung 1/200
Primärer Antikörper Anti-CD4	Maus N1UG0	Affymetrix 14-2444	Verdünnung 1/250
Primärer Antikörper Anti-FoxP3	Kaninchen 1054C	R & D MAB8214	Verdünnung 1/100
Primärer Antikörper Anti-MPO	Ziege Polyklonal	R & D Systems AF3667	Verdünnung 1/250
Primärer Antikörper Anti-CD3	Kaninchen SP7	Abcam ab16669	Verdünnung 1/200
Primärer Antikörper Anti-CD8	Maus C8/144B	Invitrogen 14-0085-80	Verdünnung 1/200
Sekundärer Antikörper Esel Anti-Maus A488	Polyklonales	Invitrogen A-21202	Verdünnung 1/500
Sekundärer Antikörper Esel Anti-Kaninchen A488	Polyklonal	Invitrogen A-21206	Verdünnung 1/500
Sekundärer Antikörper Esel Anti-Ziege A568	Polyklonales	Invitrogen A-11057	Verdünnung 1/500
Sekundärer Antikörper Esel Anti-Kaninchen A647	Polyklonales	Invitrogen A-31573	Verdünnung 1/500
Sekundärer Antikörper Ratte Anti-Maus IgG1 A647	RMG1-1	Biolegend 406618	Verdünnung 1/500
Sekundärer Antikörper Ziege Anti-Maus IgG2a CF568	Polyklonaler	Sigma Aldrich SAB4600315	Verdünnung 1/500
Sekundärer Antikörper Esel Anti-Maus DyLight 755	Polyklonales	Invitrogen SA5-10171	Verdünnung 1/500
Sekundärer Antikörper Esel Anti-Kaninchen DyLight 755	Polyklonales	Invitrogen SA5-10043	Verdünnung 1/500
SDS	BioShop	SDS001,500	VORSICHT, orale Haut- und Augentoxizität
Shandon Multi-Programm-Roboter-Objektträgerfärbemaschine	LabX	11384903
Shandon-Xylol-Ersatz,	Thermo Fisher Scientific	CA89413-336	VORSICHT, Entzündlich, Haut- und Augenreizungen, Gesundheitsschädlich beim Einatmen
Schüttelwasserbad
SlowFade Gold Antifading-Reagenz mit DAPI	Invitrogen	S36938
Natriumcitrat Dihydrat	Millipore Sigma	1545801	VORSICHT,
Augenreizungs-Stripping-Puffer: Mischen Sie 20 ml 10% w/v SDS mit 12,5 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) und 67,5 ml Reinstwasser. Geben Sie unter einem Abzug 800 μl 2-Mercapto-Ethanol (114,4 mM Endkonzentration)
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-50ML
Tris-HCl	BioShop	77-86-1
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-500
VIS Software	Visiopharm
Whole Slide scanner Olympus BX61VS	Olympus		Mikroskop: Olympus Slide Scanner BX61VS, 5-Dia-Scanner, motorisierter Tisch, Autofokus. Kamera: Lichtquelle: Xcite-120. Filter: BrightLine® Sedat-Filterset (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)
Xylol	Sigma Aldrich	214736-4L	ACHTUNG, Entzündlich, Haut- und Augenreizung, Gesundheitsschädlich beim Einatmen
Xylol : Ethanollösung (1:1 v/v)
2-Mercaptoethanol	Sigma	M6250	VORSICHT, gesundheitsschädlich durch Verschlucken, Einatmen, tödlich bei Absortierung. Augenreizung. Verwenden Sie den Abzug