Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

Zusammenfassung

In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit einem bedingten Knockdown-System und einem angepassten Kugelbildungstest, um die Wirkung von Clusterin auf die Stängel von patientenabgeleiteten GCSCs zu untersuchen. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um sowohl die In-vitro- als auch die In-vivo-Funktion von Stammgenen in verschiedenen CSCs-Typen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Krebsstammzellen (CSCs) sind in tumorinititoriöse, Entwicklung und Rezidiv nach der Behandlung involviert und sind in den letzten Jahrzehnten zum Mittelpunkt vieler Studien geworden. Daher ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, um die Rolle der Schlüsselgene zu untersuchen, die an der Vorstämmung von Krebszellen beteiligt sind. Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten und tödlichsten Krebsarten. Magenkrebs-Stammzellen (GCSCs) gelten als die Wurzel von Magenkrebsrückfall, Metastasierung und Medikamentenresistenz. Das Verständnis der GCSCs-Biologie ist notwendig, um die Entwicklung zielgerichteter Therapien voranzutreiben und schließlich die Sterblichkeit bei Patienten zu senken. In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit einem bedingten Knockdown-System und einem angepassten Kugelbildungstest, um die Wirkung von Clusterin auf die Stängel von patientenabgeleiteten GCSCs zu untersuchen. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um sowohl die In-vitro- als auch die In-vivo-Funktion von Stammgenen in verschiedenen CSCs-Typen zu untersuchen.

Einleitung

Magenkrebs (GC) ist eine der häufigsten und tödlichsten Krebsarten¹. Trotz Fortschritten in der kombinierten Chirurgie, Chemotherapie und Strahlentherapie in der GC-Therapie, Prognose bleibt schlecht und die Fünf-Jahres-Überlebensrate ist immer noch sehr niedrig². Rezidivundundundundien sind die Hauptgründe für die Todesfälle nach der Behandlung.

Krebsstammzellen (CSCs) sind eine Teilmenge von Krebszellen, die die Fähigkeit besitzen, sich selbst zu erneuern und die verschiedenen Zelllinien zu erzeugen, die den Tumor rekonstituieren³. CSCs werden geglaubt, um für KrebsRü....

Protokoll

Alle Hier beschriebenen Experimente mit patientenabgeleiteten Magenkrebsstammzellen wurden von der lokalen Ethikkommission⁷genehmigt.

1. Magenkrebs Stammzellkultur

1. Vorbereitung von GCSCs komplettes Kulturmedium
   1. Bereiten Sie GCSCs komplette Kulturmedium durch Zugabe von frischen DME / F12 Medium mit den folgenden wesentlichen Zutaten: 20 ng/mL EGF, 10 ng/mL bFGF, 1% Insulin/Transferrin/Natriumselenit, 0,2% Glukose, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% Nicht-essentielle Aminosäure, 10 m 2-Mercaptoethanol, 0,75 mg/mL NaHCO₃, 10 m Thioglycerol, 100 I.E./ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin. Filtern u....

Ergebnisse

Magenkrebs-Stammzellen aus primären menschlichen Magenadenokarzinom wurden in serumfreiem Kulturmedium kultiviert. Nach 6 Tagen dehnten sich zellenweise aus dem einzelzellähnlichen Phänotyp (Abbildung 1A) zu großen Kugeln aus (Abbildung 1B).

Um die Funktion von Clusterin in GCSCs zu bewerten, wurden shRNA-Sequenzen gegen Clusterin und S.......

Diskussion

GC ist die dritthäufigste Ursache für krebsbedingte Todesfälle weltweit. GCSCs sind entscheidend bei Magenkrebsrückfällen, Metastasen und Medikamentenresistenzen. Mit GCSCs von Magenkrebspatienten können wir ihre Schwachstelle erforschen und die Targeting-Medikamente zur Behandlung von GC-Patienten entwickeln.

Der Sphärenbildungstest ist eine nützliche Methode, um das Selbsterneuerungspotenzial von Krebsstammzellen in vitro zu untersuchen. Die Ergebnisse können als Prozentsatz der gebildeten K.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
0,22 μm m Filter	Millipore	SLGP033RB
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-Mercaptoethanol	Gibco	2068586
tierversuchsfrei rekombinant human EGF	Peprotech	AF-100-15
B-27 Supplement (50X), serumfrei	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Multi-Well-Platte	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Zellzählkammer Objektträger	Invitrogen	C10228
Countess II Automatisierter Zellzähler	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
hoher Glukosegehalt, GlutaMAX, Pyruvat	Gibco
Doxycyclin-Hyclat	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, kein Calcium, kein Magnesium	Gibco	14190250
Fötales Rinderserum, qualifiziert, Australien	Gibco	10099141
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050061
Insulin, Transferrin, Selenlösung (ITS-G), 100X	Gibco
lentiviraler Vektor	GeneChem	GV307
Lenti-X Konzentrator	Takara	631232
Lipofectamine 3000 Transfektionsreagenz	Invitrogen	L3000015
MEM nicht essentielle Aminosäuren Lösung, 100X	Gibco	11140050
Millex-HV Spritzenfiltereinheit, 0,45 &; Mikro; m, PVDF, 33 mm, gammasterilisiert	Millipore	SLHV033RB
Nalgene Allgemeine Kryoröhrchen für die Langzeitlagerung	Thermo Scientific	5000-1020
Nunc Zellkultur-/Petrischalen	Thermo Scientific	171099
Opti-MEM I Medium mit reduziertem Serum	Gibco	31985070
Penicillin-Streptomycin, flüssiges	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (knebel/pol-Komponente)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (VSVG-Komponente)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Rekombinant human FGF-basic	Peprotech	100-18B
Natriumbicarbonat	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Kryokonservierungsmedium	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Zelldissoziationslösung	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Tris-HCI Puffer, pH 7,5	Invitrogen	15567027
ZEISS Inverses Mikroskop	ZEISS	Axio Vert.A1

DMEM, 1056904441400045