Quantifizierung der raumzeitlichen Parameter der zellulären Exozytose in mikrogemusterten Zellen

Summary

Die Live-Bildgebung der lysosomalen Exozytose auf mikromusterten Zellen ermöglicht eine räumliche Quantifizierung dieses Prozesses. Morphologie-Normalisierung mit Mikromustern ist ein hervorragendes Werkzeug, um allgemeine Regeln über die räumliche Verteilung zellulärer Prozesse aufzudecken.

Abstract

Die Live-Bildgebung des pHluorin-markierten Soluble N-Ethylmaleimid-sensitive-Faktor Attachment-Proteins REceptor (v-SNARE) Vesicle-assoziiertes Membranprotein 7 (VAMP7) durch totale interne Reflexionfluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ist eine einfache Möglichkeit, die Sekretion aus dem lysosomalen Fach zu erforschen. Unter Ausnutzung der Zellkultur auf mikrogemusterten Oberflächen, um die Zellform zu normalisieren, wurden eine Vielzahl statistischer Werkzeuge eingesetzt, um eine räumliche Analyse von sekretohierten Mustern durchzuführen. Mit Ripleys K-Funktion und einem statistischen Test basierend auf der nächsten Nachbarentfernung (NND) haben wir bestätigt, dass die Sekretion von Lysosomen kein zufälliger Prozess ist, sondern signifikante Clustering zeigt. Bemerkenswert erweise hat unsere Analyse ergeben, dass Exozytose-Ereignisse auch in Nonadhesionsbereichen gruppiert sind, was darauf hindeutet, dass Haftmoleküle nicht die einzigen Strukturen sind, die sekretole Hot Spots an der Plasmamembran induzieren können. Dennoch haben wir festgestellt, dass die Zellhaftung das Clustering verbessert. Neben genau definierten Klebe- und Nicht-Klebstoffbereichen ermöglicht die kreisförmige Geometrie dieser Mikromuster die Verwendung von Polarkoordinaten und vereinfacht analysen. Wir verwendeten Kernel Density Estimation (KDE) und die kumulative Verteilungsfunktion auf Polarkoordinaten von Exozytoseereignissen, um angereicherte Bereiche der Exozytose zu identifizieren. In ringförmigen Mikromusterzellen kam es an der Grenze zwischen den Klebstoff- und nicht-klebstoffen Bereichen zu Clustering. Unsere Analyse zeigt, wie statistische Werkzeuge eingesetzt werden können, um räumliche Verteilungen verschiedener biologischer Prozesse zu untersuchen.

Introduction

Exozytose ist ein universeller zellulärer Prozess, bei dem ein Vesikel mit der Plasmamembran verschmilzt und seinen Inhalt freisetzt. Das Vesikel kann entweder vollständig mit der Plasmamembran (Vollfusion) verschmelzen oder eine Fusionspore erzeugen, die während einer begrenzten Zeit offen bleibt (Kiss-and-Run)¹. So werden beispielsweise neu synthetisierte Proteine aus Vesikeln, die aus dem Golgi-Komplex stammen, in das extrazelluläre Medium freigesetzt. Dieser biosynthetische, anterograde Weg ist vor allem bei mehrzelligen Organismen primordial, um Signalpeptide (z. B. Hormone, Neurotransmitter) und extrazelluläre Matrixkomponenten (z. B. Kol....

Protocol

1. Herstellung von mikrogemusterten Zellen

1. Transfektion von Zellen
   1. Einen Tag vor der Transfektion 2,5 x 10⁶ hTERT-RPE1-Zellen in einen Brunnen einer 12-Well-Platte (2 x 2 cm) in 1 ml Medium.
   2. Am Tag der Transfektion die Transfektionsmischung mit VAMP7-pHluorin-Plasmid (100 l Puffer, 0,8 g DNA, 3 l Transfektionsgemisch) vorbereiten. 10 min inkubieren.
      HINWEIS: VAMP7 ist ein lysosomales v-SNARE, das mit einem luminalen pHluorin-Tag verschmolzen ist. Die pHluorin-Sonde wird durch niedrigen pH-Wert abgeschreckt, aber während der Exozytose werden Protonen freigesetzt und pHluorin beginnt, ein Signal^10,<....

Results

Die räumlich zeitlichen Eigenschaften von Exozytose-Ereignissen wurden anhand von Lysosomen analysiert, die durch VAMP7-pHluorin^10,11 in hTert-RPE1-Zellen visualisiert wurden. hTert-RPE1-Zellen sind nicht transformierte Zellen, die sich gut an Mikromustern ereignen und in früheren Mikromuster-basierten Studien^4,14ausgiebig verwendet wurden. VAMP7 ist ein lysosomales v-SNARE^15, das .......

Discussion

Wir überwachten Exozytose-Ereignisse aus dem lysosomalen Fach durch TIRFM-Livezellbildgebung von VAMP7-pHluorin in ringförmigen mikromusternormalisierten Zellen und führten eine strenge statistische Analyse der räumlichen Parameter von Exozytoseereignissen durch. Unter Verwendung der transformierten Ripley-Funktion K und eines statistischen Tests auf der Grundlage der nächsten Nachbardistanz bestätigten wir, dass die Sekretion von Lysosomen kein zuzufälliger Prozess ist^8,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamlide Magnetkammer	Chamlide
DMEM/F12	Gibco	21041-025
Fibrinogen-Molekularsonden	, Invitrogen	F35200
Fibronektin Rinderplasma	Sigma	F1141
HEPES (1M)	Gibco	15630-056
hTert RPE1 Zelllinie	https://www.atcc.org
ImageJ	http://rsbweb.nih.gov/ij/	n/a	Verfasst von W. Rasband, NIH/NIMH
JetPRIME Transfektionsreagenz	Polyplus	114-07
Penicilin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Photomask	Delta Mask
PLL-g-PEG-Lösung	Surface Solutions	PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Software	https://www.r-project.org/	n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)	Gibco	12605-010
UV-Ozonofen	Jelight Company Inc	342-220
VAMP7-pHFluorin Plasmid	n/a	n/a	Artikelreferenz :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 5. Dezember 2008; 283(49):34365-73. DOI: 10.1074/JBC. M804587200. Rolle von HRB bei der Clathrin-abhängigen Endozytose. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.