In Vitro gerichtete Evolution einer Restriktionsendonuklease mit strengerer Spezifität

Zusammenfassung

Restriktionsendonukleasen mit neuer Sequenzspezifität können aus Enzymen entwickelt werden, die eine teilweise degenerierte Sequenz erkennen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, das wir erfolgreich verwendet haben, um die Sequenzspezifität des NlaIV-Enzyms zu verändern. Wesentliche Bestandteile des Protokolls sind die In-vitro-Kompartimentisierung der Transkriptions-/Übersetzungsreaktion und die Auswahl von Varianten mit neuen Sequenzspezifitäten.

Zusammenfassung

Restriktionsendonuklease (REase) Spezifitätstechnik ist extrem schwierig. Hier beschreiben wir ein mehrstufiges Protokoll, das hilft, REase-Varianten zu produzieren, die eine strengere Spezifität als das elternde Enzym aufweisen. Das Protokoll erfordert die Erstellung einer Bibliothek von Expressionsauswahlkassetten (ESCs) für Varianten des REase, idealerweise mit Variabilität in Positionen, die die DNA-Bindung beeinflussen können. Der ESC wird auf der einen Seite durch eine Sequenz für die gewünschte Einschränkungs-Site-Aktivität und ein Biotin-Tag und auf der anderen Seite durch eine Restriktionsstelle für die unerwünschte Aktivität und eine Primer-Glühstelle flankiert. Die ESCs werden transkribiert und in eine Wasser-in-Öl-Emulsion übersetzt, unter Bedingungen, die das Vorhandensein von mehr als einem DNA-Molekül pro Tröpfchen unwahrscheinlich machen. Daher wird die DNA in jedem Kassettenmolekül nur der Aktivität des übersetzten, kodierten Enzyms unterworfen. REase-Varianten der gewünschten Spezifität entfernen das Biotin-Tag, aber nicht die Primer-Glühen-Site. Nach dem Bruch der Emulsion werden die DNA-Moleküle einem Biotin-Pulldown unterzogen, und nur die im Überstand bleiben erhalten. Dieser Schritt stellt sicher, dass nur ESCs für Varianten beibehalten werden, die nicht die gewünschte Aktivität verloren haben. Diese DNA-Moleküle werden dann einer ersten PCR-Reaktion unterzogen. Cleavage in der unerwünschten Sequenz schneidet die Primerbindungsstelle für einen der Primer ab. Daher verstärkt PCR nur ESCs aus Tröpfchen ohne die unerwünschte Aktivität. Anschließend wird eine zweite PCR-Reaktion durchgeführt, um die Restriktionsstelle für die gewünschte Spezifität und das Biotin-Tag wieder einzuführen, so dass der Selektionsschritt wiederholt werden kann. Ausgewählte offene Leserahmen können in Bakterienzellen überexprimiert werden, die auch die cognate Methyltransferase der elterlichen REase ausdrücken, da die neu entwickelte REase nur eine Teilmenge der Methyltransferase-Zielstellen anvisiert.

Einleitung

Sequenzspezifitäts-Engineering ist für REases der Klasse II eine große Herausforderung. In dieser Klasse von Endonukleasen sind Sequenzerkennung und Katalyse eng miteinander verflochten, höchstwahrscheinlich als evolutionärer Schutz gegen die Schaffung einer Endonuklease von breiterer Spezifität als ihre cognate Methyltransferase, die die Wirts-DNA schädigen würde. Die gezielte Evolution neuer Spezifitäten in Zellen wird durch die Notwendigkeit, die Wirts-DNA vor der neu entwickelten Endonuklease-Aktivität zu schützen, noch komplizierter. Daher gibt es nur wenige erfolgreiche Versuche von REase Engineering berichtet und alle von ihnen nutzen die einzigartigen Eigenschaften eines bestimmten Enzyms^{1,2,3,4,5,6,7}.

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für Spezifitäts-Engineering zur Verfügung, das verwendet werden kann, um Endonuklease-Varianten zu generieren, die eine engere Spezifität haben als ein Elternenzym, das auf unserer erfolgreichen Konstruktion einer NlaIV Endonuklease⁸basiert. Für jedes solche Enzym mit einer beliebigen Erkennungssequenz kann eine zusätzliche Spezifität für Basen in den Flanken eingeführt werden. Bei Elternenzymen, die teilweise degenerierte Sequenzen erkennen (wie NlaIV mit ihrem GGNNCC-Ziel), kann auch eine zusätzliche Spezifität innerhalb der Erkennungssequenz eingeführt werden. Da zusätzliche Spezifität wahrscheinlich Protein-DNA-Kontakte erfordern, sollten die neu erkannten Basen innerhalb des Fußabdrucks der elterlichen Endonuklease auf DNA liegen. Grundsätzlich können Für jede gewünschte Spezialisierung der Erkennungssequenz Auswahlschemata eingerichtet werden. Die meisten REases, die palindromische und fast palindromische Zielsequenzen erkennen, sind jedoch funktionelle Dimere, die nur eine halbe Stelle des Palindroms erkennen. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Auswahl neuer Spezifitäten, die die Symmetrie von Protein-Nukleinwechselwirkungen verletzen, funktioniert. Für die dimerische NlaIV beispielsweise kann die GGNNCC-Sequenz theoretisch auf GGATCC eingegrenzt werden, aber die Verengung der Spezifität auf GGAACC dürfte schwieriger sein. Unser Schema beinhaltet sowohl eine positive als auch eine negative Auswahl.

Das Verfahren ist effizienter, wenn die negative Auswahl auch verwendet wird, um die Spezifitäten zu entfernen, die alle Sequenzen außer der bevorzugten engeren Spezifität spalten können. Beispielsweise könnte die Auswahl für GGATCC mit einer Antiauswahl gegen GGBVCC kombiniert werden (wobei B eine andere Basis als A und V eine andere Basis als T ist). Wenn einige der möglichen Zielsequenzen nicht abgedeckt sind, hängt das Ergebnis des Auswahlexperiments von der Wirksamkeit der positiven und negativen Selektion ab. In unserer NlaIV-Arbeit haben wir uns für GGATCC und gegen GGSSCC (wobei S G oder C) entschieden hat, und eine Spezifität erhalten, die unter Ignorieren von Symmetriebruchzielen als GGWWCC (wobei W A oder T ist) beschrieben werden könnte, was darauf hindeutet, dass in diesem speziellen Fall die negative Selektion als positive Auswahl.

Unser Ansatz beginnt mit der Erstellung einer Ausdrucksauswahlkassette (ESC). Der ESC ist in Abschnitte gegliedert. Im Innenkernbereich gibt es Varianten des offenen Leserahmens (ORF) der REase unter T7-Promoter-Steuerung. Dieser Kernabschnitt des ESC kann keinen Cognate-Standort für die entwickelte REase enthalten. Der Kern ist zwischen zwei Kognatenstellen für Wildtyp REase eingeklemmt: eine Spaltungsstelle für die unerwünschte Aktivität (in diesem Beispiel die zählergenaue Sequenz GGSSCC) und eine Spaltungsstelle für die gewünschte Aktivität (ausgewählte Sequenz, GGATCC im Beispiel). Der letzte Schritt der Vorbereitung des ESC in PCR fügt Biotin nahe an der gewünschten Aktivität am 5' Ende hinzu und erzeugt eine Vielzahl von gegeneinander ausgewählten Sequenzen (GGSSCC im Beispiel). Die Auswahlstrategie beruht auf der Verwendung sorgfältig ausgearbeiteter Primer im ESC-Reamplifikationsprotokoll nach einem In-vitro-Transkriptions-/Übersetzungs-/Auswahlprotokoll (Abbildung 1A). Die ESC-Bibliothek wird in einer in vitro unterteilten Transkriptionsübersetzung Wasser-in-Öl-Emulsion^9,10,11ausgedrückt. Innerhalb jedes Tröpfchens wirkt sich die Spezifität des exprimierten Enzyms auf den Zustand des ESC aus (Abbildung 1B, Schritt I). Für die beschriebene Anordnung entfernt die gewünschte Spaltaktivität des übersetzten Proteins das Biotin-Tag der DNA, wirkt sich aber nicht auf das andere ESC-Ende mit der gegendien ausgewählten Sequenz aus. Wenn die Emulsion gebrochen ist, werden biotinylierte Fragmente durch Streptavidin-Affinitätspulldown entfernt, so dass nur Fragmente aus Tröpfchen mit der gewünschten Aktivität übrig bleiben(Abbildung 1B, Schritt II). In diesem Schritt werden inaktive REase-Varianten entfernt. Der überstande Teil des Pull-Down-Schritts wird dann durch PCR verstärkt. In den ersten PCR-Reaktionsprimern Werden F2 und R1 verwendet(Abbildung 1A,B, Schritt III). Primer F2 bindet an den ESC-Abschnitt zwischen der gegendien ausgewählten Sequenz und dem Molekülende. Daher werden ESCs, die Varianten exprimieren, die in der Lage sind, die gegensätzliche ausgewählte Sequenz zu trennen (und damit die Bindungsstellen für die Primer F2 und R1 in zwei verschiedene DNA-Moleküle zu trennen), nicht verstärkt und somit aus der Bibliothek entfernt. Der Primer R1 bindet zwischen dem ausgewählten Standort und dem Kern des ESC, so dass er nicht vom Spaltungsstatus des ausgewählten Standorts beeinflusst wird, und stellt die Spaltungsstelle für die gewünschte Aktivität (GGATCC) wieder her. Der Zyklus wird durch eine zweite PCR (mit primer F1 und R2) geschlossen, die Biotin am 5'-Ende in der Nähe des ausgewählten Standorts hinzufügt und die entworfene Variation an der gegenläufigen Stelle in der Nähe des entgegengesetzten Endes des ESC wiederherstellt(Abbildung 1B,Schritt IV). Die resultierende DNA-Mischung ist bereit für eine weitere Auswahlrunde.

Der Erfolg des Auswahlprotokolls hängt stark von der richtigen Wahl der neuen, strengeren Zielerkennungssequenz und von der sorgfältigen Gestaltung der Mutagenese-Strategie und ihrer effektiven Umsetzung ab. Da es viel einfacher ist, leichte bereits bestehende Präferenzen der REase zu verbessern, als sie zu überwinden, empfehlen wir, mit einer kinetischen Studie aller bereits bestehenden Präferenzen zu beginnen. Die Notwendigkeit einer sorgfältigen Mutagenese-Konstruktion ergibt sich aus der begrenzten Größe einer mutierten Bibliothek, die durch das vorgestellte Protokoll verarbeitet werden kann (10⁹ Klone in einem einzigen Experiment). Somit können alle 20 möglichen Aminosäuresubstitutionen in wenigen Positionen effektiv getestet werden (siehe Diskussion). Eine zufällige Mutagenese, wie z. B. fehleranfällige PCR (EP-PCR), die als alternative Methode vorgestellt werden, wird zu einer tiefgreifenden Unterstichprobe der bestehenden Komplexität führen. Wenn Informationen über mögliche Aminosäurepositionen im Zusammenhang mit DNA-Kontakten (oder sogar in unmittelbarer Nähe zu den degenerierten Nukleotiden in einer Cognate-Sequenz) vorliegen, sollte dies sicherlich verwendet werden, um einige Aminosäuren für oligonukleotidgeführte Sättigungsmutagenese auszuwählen (Protokollschritte 1.6-3.10).

Protokoll

1. Vorbereitung der ESK

1. Klonmethyltransferase des Restriktionsmodifikationssystems, das in einem Plasmid mit niedriger Kopierzahl (z. B. pACYC184 oder pACYC174 oder deren Derivaten) entwickelt werden soll.
   HINWEIS: Der bakterielle Wirtsstamm muss in der Lage sein, die durch das geklonte Enzym eingeführte Methylierung zu tolerieren und eine induzierbare Expression der T7-RNA-Polymerase zu ermöglichen. Es wird empfohlen, den ER2566-Stamm (mit McrA-, McrBC- und Mrr-Mutationen) zu verwenden.
2. Bestätigen Sie, dass die rekombinante Plasmid-DNA durch die cognate Endonuklease gegen Spaltung geschützt ist, indem Sie 0,5 g Plasmid-DNA mit 10 Einheiten Cognate REase in Puffer und Temperatur behandeln, die vom Enzymlieferanten für 2 h empfohlen werden.
3. Bereiten Sie kompetente Zellen dieses Stammes vor.
   HINWEIS: Jede Methode kann verwendet werden. Das NlaIV-Ingenieurprojekt verwendete eine einfache Calciumchloridmethode¹².
4. Konstruieren Sie rekombinantes Plasmid mit dem ORF für die REase unter Kontrolle des T7-Promotors aus einer anderen Ausschlussgruppe und mit einem anderen Selektionsmarker als dem, der das Methyltrasferase-Gen in Schritt 1.1 enthält. Die Vektoren pET28 und pET30 können verwendet werden.
5. Entfernen Sie alle Erkennungsstellen für das entwickelte Enzym aus dem Abschnitt des rekombinanten Plasmids zwischen dem T7-Promotor und dem Stop-Codon des Enzyms ORF durch DieEinführung stiller Mutationen(Abbildung 2, Tabelle 1A).
   HINWEIS: Wenn mehr als eine solche Stelle entfernt werden muss, sind mehrere Mutationsrunden erforderlich (Schritte 1.5.1–1.5.7).
   1. Verwenden Sie eine inside-out PCR-Reaktion, die das plasmid in voller Länge mit entworfenen Variationen verstärkt, die an den 5' Enden der Primer eingeführt werden (Tabelle 2A).
   2. Entfernen Sie die Schablonen-DNA, indem Sie 10 U dpnI-Endonuklease zu den 50 L der PCR-Reaktion hinzufügen, und inkubieren Sie für 2 h bei 37 °C.
   3. Lösen Sie die Produkte durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Schneiden Sie das Band aus, das dem Plasmid in voller Länge entspricht, und reinigen Sie es mit einem kommerziellen Kit.
   4. Fügen Sie 10x Ligationspuffer (zu einer 1x Konzentration) hinzu und ergänzen Sie ihn mit ATP (auf 1 mM). 10 U T4-Polynukleotidkinase hinzufügen und 20 min bei 37 °C brüten. Inaktivieren Sie das Enzym durch Erhitzen bei 70 °C für 10 min.
   5. Fügen Sie PEG 4000 bis 5%, ergänzen Sie erneut mit ATP (auf 1 mM), und fügen Sie 5 U T4 DNA Ligase. Inkubieren für 2 h bei Raumtemperatur (RT).
   6. Verwandeln Sie sich in einen kompetenten Bakterienstamm, der Cognate-Methyltransferase trägt (Schritt 1.1).
   7. Isolieren Sie die Plasmid-DNA in kleinem Maßstab und bestätigen Sie die Einführung von Sequenzänderungen durch Dideoxysequenzierung.
6. Einführung einzigartiger Restriktionsstellen in der Nähe der Sequenz(en), auf die Oligonukleotid geführte Mutagenese abzielt (Abbildung 2, Tabelle 1B). Führen Sie die Schritte 1.5.1–1.5.7 für jede Website aus.
   HINWEIS: Dieser Schritt wird nur ausgeführt, wenn eine gezielte Mutagenese verwendet wird. Wenn Sie eine zufällige Mutagenese machen, überspringen Sie die Schritte 2-3 und fahren Sie stattdessen mit Abschnitt 3 fort. Im vorgestellten Beispiel wurden alle Standorte vor den Zielregionen eingeführt, können aber auch flussabwärts eingeführt werden.
7. Design-Primer für die Verstärkung des ESC (Tabelle 1C).
   1. Entwerfen Sie eine Reverse primer Bindung nach dem Endonuklease ORF, die die ausgewählte Erkennungsstelle (R1) und ihre kürzere Version (R2) einführt, die außerhalb der ausgewählten NlaIV-Sequenz bindet und Biotin am 5'-Ende enthält (siehe Abbildung 1).
   2. Entwerfen Sie eine Forward Primer (F1) Bindung an den ESC vor dem T7-Promoter. Dieser Primer sollte auch gegenausgewählte Varianten der ursprünglichen Erkennungssequenz einführen (d. h. das Maximum der Sequenzvariationen, die vom ursprünglichen Enzym mit Ausnahme der gewählten Rücksequenz erkannt werden).
      HINWEIS: Eine kürzere Version dieses Primers (F2), die die Sequenzdistal bis zur gegengewählten Sequenz abdeckt, wird später in der selektiven PCR (Schritt 5.9) verwendet.

2. Split-and-Mix-Synthese von mutagenen Primern

HINWEIS: Dieser Schritt wird nur für Projekte verwendet, die eine Subsättigungsmutagenese an mehr als einem Standort erfordern. Ein Synthesizer mit mehreren Synthesesäulen ist erforderlich. Weisen Sie Spalten für die Synthese von randomisierten NNS-Codon-Triples und Wild-Typ-Codon-Triplets entsprechend den Mutagenese-Frequenzen zu. Wenn z. B. sieben Gleichvolumensynthesespalten verfügbar sind und eine Mutageneserate von 0,3 an einem bestimmten Standort wünschenswert ist, fügen Sie randomisierte NNS-Codons in 0,3 x 7 oder zwei Spalten und Wild-Typ-Codons in 0,7 x 7 oder fünf Spalten hinzu(Abbildung 3).

1. Entscheiden Sie sich für Standorte für subsättigungsmutagenese. Wählen Sie Mutagenese-Frequenzen entsprechend der hypothetischen Bedeutung der Standorte (d. h. je wichtiger der Standort, desto höher die Frequenz), wobei die Gesamtkomplexität der Bibliothek im Auge behalten wird (siehe Diskussion).
2. Synthetisieren Sie Oligonukleotide in allen Spalten, bis zum Triplet unmittelbar vor der zweiten Subsättigungmutagenese-Stelle, die vom 3'-Ende aus zählt. Entfernen Sie die 5'-trityl-Schutzgruppe nicht beim letzten Synthesezyklus (verwenden Sie die trityl-on-Option auf dem Synthesizer). Die Schutzgruppe wird zu Beginn des nächsten Synthesezyklus entfernt (Schritt 1 in Abbildung 3).
3. Öffnen Sie die Synthesespalten. Sammeln Sie kontrollierte Porenglas (CPG) Syntheseunterstützung in einem trockenen 1,5 ml Rohr und mischen durch Wirbeln. Repartitionieren Sie das gemischte CPG-Harz in neue Synthesesäulen. Vermeiden Sie die Einführung von Feuchtigkeit, da sie den Gesamtertrag verringert (Schritte 2 und 4 in Abbildung 3).
4. Fortsetzung der Synthese, beginnend mit der Subsättigung Mutagenese-Site Triplet. Weisen Sie randomisierten NNS-Triples oder Wildtyp-Triples entsprechend der gewünschten Mutagenesehäufigkeit Spalten zu (siehe Anmerkung oben). Wenn zusätzliche Subsättigungsstellen vorhanden sind, fahren Sie nur mit dem Triplet vor dem nächsten Subsättigungsmutagenese-Standort fort. Lassen Sie am Ende erneut eine 5'-trityl-Gruppe an (5'-trityl-on-Option auf dem Synthesizer) (Schritt 3 in Abbildung 3). Fahren Sie dann mit Schritt 2.3 fort.
5. Wenn keine Subsättigungsstellen mehr nachgelagert vorhanden sind, schließen Sie die Synthese ab, so dass am Ende eine 5'-trityl-Gruppe (5'-trityl-on-Option auf dem Synthesizer) übrig bleibt (Schritt 5 in Abbildung 3).
6. Detektion und Reinigung der Oligonukleotid-Bibliothek gemäß den Anweisungen des Reinigungspatronenherstellers.
   HINWEIS: Oligonukleotide, die durch Deprotection aus dem CPG freigesetzt werden, können auch in der Rückphase der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Trityl-on, gefolgt von einer manuellen Trityl-Gruppenentfernung (1 h Behandlung mit 80% Essigsäure bei RT) und einer zweiten HPLC-Reinigung gereinigt werden.
7. Überprüfen Sie die Qualität der Oligonukleotid-Bibliothek in einem Harnstoff-PAGE-Gel.

3. Generieren von Variantenbibliotheken

HINWEIS: Verwenden Sie das rekombinante Plasmid aus Schritt 1.6.

1. Generieren Sie die Bibliotheken durch Oligonukleotid gerichtete Mutagenese.
   HINWEIS: Alternativ können Sie das EP-PCR-Protokoll (Schritt 3.2) verwenden.
   1. Verstärken Sie einen Abschnitt vom T7-Promotor bis zur einzigartigen Restriktionsenzym-Site, die die mit Mutagenese folgende Sequenz flankiert (bei NlaIV: SalI, EcoRI oder Eco52I) (Tabelle 1B-C, Tabelle 2B, Abbildung 4). Verstärken Sie den zweiten Teil von der einzigartigen Restriktionsenzym-Site bis zum 3'-Ende des ESC.
   2. Mischen Sie separat 5 l der PCR-Reaktionen (ab Schritt 3.1.1) mit 8 l Wasser, 1,5 l 10x Restriktionsenzympuffer und 5 Einheiten der entsprechenden Restriktionsenzyme (SalI, EcoRI oder Eco52I) und inkubieren bei der entsprechenden Temperatur für 2 h.
   3. Lösen Sie die Produkte beider Reaktionen mit Agarose-Gel-Elektrophorese. Schneiden Sie die erwarteten Größenbänder aus und reinigen Sie sie mit einem kommerziellen Kit.
   4. Führen Sie bis zu 1/3 der gereinigten Produkte in einem Agarose-Gel aus und messen Sie die Konzentration jedes gereinigten Bandes durch Densitometrie.
   5. Richten Sie die Ligation von zwei Teilen der ESCs in einem 1:1-Molarenverhältnis mit 1x Ligase-Puffer und 1 U T4 DNA-Ligase ein und inkubieren Sie für 2 h bei RT.
   6. Lösen Sie die Reaktionsprodukte im Agarose-Gel. Schneiden Sie die erwartete Größe Produkte und reinigen Sie mit einem kommerziellen Kit.
   7. Verstärken Sie die gereinigten Ligationsprodukte in einer PCR-Reaktion mit den Primern F1 und R2 (Tabelle 1C und Tabelle 2A). Laufen Sie nicht mehr als 20 Amplifikationszyklen.
   8. Fraktionieren Sie die PCR-Reaktionen in einem Agarose-Gel. Schneiden Sie die Produkte aus und reinigen Sie sie mit einem kommerziellen Kit.
   9. Führen Sie einen 5 L Aliquot der gereinigten Bibliothek aus dem vorherigen Schritt im Agarose-Gel aus und messen Sie die Konzentration durch Densitometrie.
   10. Klonen Sie eine kleine Probe der Bibliothek (bis zu 5 L) und Sequenz >15 Klone, um die Mutationshäufigkeit und -verteilung zu überprüfen (Tabelle 3). Fahren Sie mit Schritt 4 fort.
       HINWEIS: Alternativ kann eine hohe Durchsatzsequenzierung der kleinen Stichprobe der ESCs verwendet werden.
2. EP-PCR durchführen.
   1. Verstärken Sie den ESC aus dem plasmid, das in Schritt 1.5.7 mit den Primern F1 und R1 erhalten wurde. Führen Sie 20 Zyklen mit Taq I Polymerase (Tabelle 1B).
   2. Gel reinigt das PCR-Produkt.
   3. Ep-PCR mit 2 ng gereinigtem PCR-Produkt aus dem vorherigen Schritt einrichten und 15 Zyklen EP-PCR (Tabelle 1C) mit F1- und R1-Primern laufen lassen.
   4. Gel reinigt das Produkt und quantifiziert es durch Geldensitometrie.
      HINWEIS: Aufgrund der geringen Konzentration des gereinigten EP-PCR-Produkts wird ca. 1/3 zur Quantifizierung verwendet.
   5. Klonen Sie ein kleines Beispiel der Bibliothek (bis zu 1/5) und sequenzieren Sie >15 Klone, um die Mutationshäufigkeit und -verteilung zu überprüfen (Tabelle 4).
      HINWEIS: Alternativ können Sie eine Sequenzierung der kleinen Stichprobe der ESCs mit hohem Durchsatz durchführen.

4. Durchführung von unterteilter In-Vitro-Transkriptions-Übersetzungsreaktion

1. Testendonuklease-Expression und enzymatische Aktivität in in vitro Transkription-Translation.
   1. Bereiten Sie ein kurzes (200–500 bp) Substrat mit einer einzigen Erkennungsstelle für die Endonuklease vor, die sich in der Nähe des Molekülzentrums befindet, damit die Spaltungsreaktion leicht erkannt werden kann.
      HINWEIS: Der einfachste Weg, das Substrat vorzubereiten, ist durch PCR-Verstärkung eines geeigneten Fragments eines beliebigen DNA-Moleküls. Das Substrat kann radioaktiv oder fluoreszierend gekennzeichnet werden, um die Spaltungserkennung zu vereinfachen.
   2. Richten Sie nach den Empfehlungen des Herstellers 50 l einer Transkriptions-Translation-Reaktion mit 0,5 g Wild-ESC ein. Magnesiumsalz (MgCl₂, MgSO₄und Magnesiumacetat können getestet werden) auf 1,5 mM und die entsprechende Menge an Substrat aus dem vorherigen Schritt (mindestens 0,5 g bei nicht beschrifteter DNA) hinzufügen.
      HINWEIS: Jedes Transkriptions-/Übersetzungskit, das keine durch Magnesium aktivierte Nuklease enthält, kann verwendet werden. Einige Kit-Anbieter verwenden Nukleasen, um DNA-Kontamination während der Produktion zu entfernen und dann Chelatoren als Nuklease-Inhibitoren hinzuzufügen. Solche Kits sind mit dieser Methode nicht kompatibel.
   3. Inkubieren Sie die Transkriptions-Übersetzungsreaktion gemäß den Anweisungen des Herstellers. Dann übertragen Sie das Reaktionsgemisch auf die optimale Temperatur für das Restriktionsenzym für 2 h.
   4. Analysieren Sie die Spaltung des Substrats in einem Agarose-Gel, gefolgt von entsprechender Detektion (z. B. DNA-Färbung, Fluoreszenzvisualisierung oder Autoradiographie) (Abbildung 5).
      HINWEIS: Mindestens eine teilweise Spaltung des Substrats ist notwendig, bevor mit der Abschottung fortfährt. Wird dies nicht erreicht, ist eine weitere Optimierung der Magnesium-Chemikalienform oder ihrer Konzentration erforderlich.
2. Bereiten Sie ein Öl-Tensid-Gemisch vor, indem Sie 225 l Span 80 und 25 l Tween 80 bis 5 ml Mineralöl in einem 15 ml konischen Rohr hinzufügen. Mischen Sie gründlich durch sanfte Inverting der Röhre 15x.
3. Für jede Bibliothek übertragen Sie 950 l des Öl-Tensid-Gemischs in eine 2 ml runde bodenkryogene Durchstechflasche, etikettieren Sie mit einem Bibliotheksnamen und übertragen Sie sie auf Eis. Legen Sie einen kleinen zylindrischen Rührstab (5 x 2 mm²) in jede Durchstechflasche.
4. Bereiten Sie ein In-vitro-Transkriptions-Translation-Reaktionsgemisch (50 l für jede Bibliothek) nach den Vorschlägen des Herstellers vor. Das Gemisch mit Magnesiumchlorid auf eine Endkonzentration von 1,5 mM aufzuergänzen (siehe Schritt 4.1.4).
5. Geben Sie 50 L Aliquots in 1,5 ml Rohre auf Eis.
6. 1,7 Fmole der Bibliothek (ab Abschnitt 3) zum Reaktionsgemisch auf Eis hinzufügen.
   HINWEIS: Verwenden Sie keine höhere Ausdrucksbibliothek für die Auswahleffizienz. Es ist entscheidend, die Häufigkeit von wässrigen Tröpfchen zu minimieren, die mehr als ein DNA-Molekül enthalten.
7. Bereiten Sie wasser-in-Öl-Emulsion nacheinander für jede Bibliothek vor.
   1. Legen Sie einen kleinen Becher (oder großen Flaschenbecher) mit Eis gefüllt auf einen Magnetischen Rührer mit der Rührgeschwindigkeit bei 1.150 Rpm eingestellt.
   2. Eine kryogene Durchstechflasche mit 950 l Öl-Tensid-Mischung und einem kleinen Rührstab ab Schritt 4.3 in ein eiskaltes Becherglas am Magnetrührer geben. Überprüfen Sie, ob sich der Rührstab dreht.
   3. Fügen Sie fünf 10 L Aliquots des In-vitro-Bibliotheks-Transkriptions-Übersetzungsgemischs über einen Zeitraum von 2 minuten in 30 s hinzu und rühren Sie eine weitere Minute. Die Durchstechflasche mit der Emulsion in einen Eisbehälter geben. Fahren Sie mit der nächsten Bibliothek fort, die mit Schritt 4.7.2 beginnt.
   4. Nachdem alle Bibliotheken verarbeitet werden, starten Sie die Inkubation aller Bibliotheken nach den Empfehlungen des Kitherstellers.
8. Übertragen Sie die Fläschchen für die technische Endonuklease für weitere 2 h auf die für die technische Endonuklease optimale Temperatur und legen Sie sie dann mindestens 10 min auf Eis.

5. Kontinuierliche Verarbeitung von Bibliotheken und Auswahl

1. Die Emulsionen aus den kryogenen Durchstechflaschen in kalte 1,5 ml-Rohre geben, 1 l 0,5 M EDTA hinzufügen und bei Raumtemperatur bei 13.000 x g zentrifugieren.
2. Entfernen Sie die obere Ölphase mit einer Pipette. Wenn eine Öl-Wasser-Interphase nicht sichtbar ist, das Rohr mindestens 5 min bei -20 °C inkubieren, um die wässrige Phase einzufrieren, dann die Flüssigölphase sofort herausleiten.
3. Fügen Sie 100 l von 10 mM Tris HCl pH 8.0 hinzu und führen Sie sofort die Extraktion mit 150 l Phenol:Chlor(chloroform(1:1 v/v) durch kurze Wirbelung, gefolgt von Phasentrennung durch 30 s Zentrifugation bei 13.000 x gdurch. Sammeln Sie die obere wässrige Phase.
4. Niederschlagen Sie die DNA, indem Sie 0,1 Vol. (15 l) von 3 M Natriumacetat (pH = 5,2), 2,5–5 g Glykogen und 2,5 Vol. (375 l) Ethanol hinzufügen. Bei -20 °C für 1 h und Zentrifuge 15 min bei 13.000 x g, 4 °C inkubieren. Den Überstand entsorgen und das Pellet kurz mit 1 ml kaltem 70% Ethanol waschen.
5. Trocknen Sie das DNA/Glykogenpellet in einem Speedvac oder lufttrocken für >5 min.
6. Lösen Sie das Pellet in 50 l von 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5). Fügen Sie 5 l Streptavidin-Magnetperlen nach den Anweisungen des Herstellers hinzu und mischen Sie für 1 h bei RT, vorzugsweise in einem Karussellmischer oder durch sanftes Wirbeln.
7. Trennen Sie die Perlen auf einem magnetischen Ständer und sammeln Sie die in DNA angereicherte Flüssigkeit ohne Biotin.
8. Konzentrieren Sie die DNA durch Ethanolfällung (Schritte 5.4–5.5).
9. Lösen Sie die konzentrierte DNA aus dem vorherigen Schritt in 5 l Wasser auf und verwenden Sie sie als Vorlage in einer PCR-Reaktion mit F2- und R1-Primern (Tabelle 1A).
   HINWEIS: Um Probleme mit der Kontamination von Vorlagen zu vermeiden und PCR-Artefakte zu minimieren, verwenden Sie Taq-Polymerase (nicht Pfu oder Phusion) und führen Sie 18–20 Zyklen mit der Verlängerungszeit proportional zur Vorlagengröße (1 kb = 1 min) aus (siehe Tabelle 2B).
10. Fraktionieren Sie das PCR-Produkt in einem Agarose-Gel und schneiden Sie das erwartete Produkt aus. Einige Schmierereien deuten darauf hin, dass es Produkte unterschiedlicher Größe gibt (siehe Abbildung 6). Reinigen Sie die DNA aus der Gelplatte mit einem kommerziellen Kit.
11. Führen Sie eine zweite PCR-Reaktion mit bis zu 50 ng DNA aus Schritt 5.10 und Primer F1 und R2 mit dem gleichen Protokoll wie in Schritt 5.9 aus. Fahren Sie mit der Produktreinigung gemäß 5.10 fort. Gereinigte DNA nach Quantifizierung durch Agarose-Gel-Densitometrie (nicht UV-Spektroskopie) kann in der nächsten Runde der In-vitro-Auswahl (Schritt 4.6) verwendet werden.

6. Screen-Varianten für Altered Sequence Specificity

1. Klonen Ausgewählter Varianten.
   1. Verdauen Sie das Produkt von Schritt 5.10 für 2 h mit 10 U Restriktionsenzymen, die für das Klonen des ORF geeignet sind, in den Expressionsvektor (für NlaIV: NcoI und XhoI) in der vom Enzymlieferanten empfohlenen Temperatur und Puffer. Lösen Sie die Produkte mit Agarose-Gel-Elektrophorese und isolieren Sie das erwartete Größenfragment.
   2. Bereiten Sie den Plasmidvektor (z. B. pET28) durch Doppelspaltung mit den gleichen Enzymen wie in Schritt 6.1.1 vor und gel reinigen Sie das Produkt mit einem kommerziellen DNA-Gel-Reinigungskit.
   3. Schätzen Sie die Konzentrationen von Vektoren und setzen Sie durch Densitometrie mit Agarose-Gel-Elektrophorese ein.
   4. Richten Sie eine Ligation mit 1–5 U T4 DNA Ligase und Vektor:Insert Molar Verhältnis 1:3-1:5 in 1x Ligase Puffer vom Enzymhersteller empfohlen. 2 h bei RT inkubieren und durch Umwandlung oder Elektroporation¹²in geeignete Wirtsbakterien (ab Schritt 1.3) einführen.
   5. Wählen Sie Extransformantien auf LB-Platten, die das entsprechende Antibiotikum (50 g/ml Kanamycin für pET28- oder pET30-Vektoren) und 1% Glukose enthalten.
2. Express-Protein-Varianten.
   1. Impfen Einzelnerkolonien aus der Transformation (bis zu 24 Klone können leicht in einem Durchgang verarbeitet werden) in 2 ml mit Kanamycin (50 g/ml) und 1% Glukose und wachsen über Nacht bei 37 °C mit Schütteln.
   2. Impfen Sie 15 ml warmes (37 °C) LB mit 100 g Kanamycin und ohne Glukose mit 0,75 ml der Nachtkultur und inkubieren Sie bei 37 °C mit kräftigem Schütteln.
      HINWEIS: Es können entweder 50 ml Zentrifugenrohre oder 100 ml Erlenmayer-Kolben verwendet werden.
   3. Fügen Sie 176 l Glycerin zu 1 ml Nachtkultur hinzu (Endkonzentration von Glycerin = 15%) gründlich mischen und bei -70 °C einfrieren.
   4. Nach 2–3 h Ergänzung 15 ml kultur (ab Schritt 6.2.1) mit IPTG auf 1 mM und Kultur für weitere 5 h.
   5. Das bakterielle Pellet durch Zentrifugation (10.000 x g, 4 °C, 10 min) sammeln und bei -70 °C einfrieren.
3. Reinigen Sie die Proteinvarianten.
   1. Übertragen Sie 20 l Nickelaffinitätsharzsuspension in 200 l B1-Puffer in einem 1,5 ml-Rohr mit einer breiten Rohrpipettenspitze, mischen Sie sanft und Zentrifuge (5.000 x g, 30 s, 4 °C). Entfernen Sie den Überstand durch Pipetten und lassen Sie die Röhre auf Eis.
   2. Setzen Sie das bakterielle Pellet von Schritt 6.2.5 in 300 l B1 durch kräftiges Wirbeln wieder aus. Übertragen Sie die Suspension in ein 1,5 ml Rohr.
   3. Fügen Sie 3 l 100x Protease-Inhibitor-Cocktail und Lysosomlösung in B1 (Endkonzentration von 1 mg/ml) hinzu. Zerlegen Sie die Zellen durch Beschallung mit einer mit der Spitze ausgestatteten Sonde. Verwenden Sie sechs 10 s Bursts pro Probe mit >15 s Spitzenkühlzeit im Eis dazwischen. Halten Sie Die Zellsuspensionen die ganze Zeit auf Eis.
   4. Pelletzellablagerungen durch Zentrifugation (2 min, 12.000 x g, 4 °C) und Übertragung von 250 l Überstand auf das Harz aliquot ab Schritt 6.3.1.
   5. 15 min in einem Kühlraum mischen, vorzugsweise in einem Karussellmischer oder durch sanftes Wirbeln.
   6. Zentrifuge (5.000 x g, 30 s, 4 °C) und den Überstand mit einer Pipette ansaugen.
   7. Fügen Sie 500 L W Puffer hinzu und setzen Sie das Harz vorsichtig wieder auf. Zentrifuge (5.000 x g, 30 s, 4 °C) und den Überstand mit einer Pipette ansaugen.
   8. Wiederholen Sie Schritt 6.3.7.
   9. Fügen Sie 20 l Puffer E hinzu, setzen Sie das Harz vorsichtig wieder auf, und lassen Sie die Probe für 2–5 min auf Eis. Zentrifuge (5.000 x g, 30 s, 4 °C) und den Überstand sammeln.
   10. Wiederholen Sie Schritt 6.3.9. Pool-Überstand.
   11. Analysieren Sie Proteinproben in mit SDS-PAGE (5–10 l) (Abbildung 7).
4. Bildschirm für Varianten mit der veränderten Spezifität.
   1. Assay Spaltung Aktivität auf Bakteriophagen Lambda DNA. Die Proteinprobe kann bis zu 10% des endigen Reaktionsvolumens ausmachen. Ein guter Ausgangspunkt sind insgesamt 2 l Proteinproben pro 0,5 g DNA und 2 h Reaktionszeit.
   2. Analysieren Sie die Reaktionsprodukte durch Agarose-Gel-Elektrophorese zusammen mit den Produkten, die durch das Wildtyp-Enzym erzeugt werden. Wählen Sie die Klone aus, die Spaltmuster erzeugen, die sich deutlich von dem unterscheiden, das vom Wildtyp-Enzym für die weitere Analyse erzeugt wird (Abbildung 8).

Ergebnisse

Dieses Protokoll ist nur ein Werkzeug, um die Häufigkeit der gewünschten Varianten eines konstruierten REase zu erhöhen, indem zwei unerwünschte Klassen erschöpft (aber nicht beseitigt) werden: inaktive Enzyme und Endonukleasen mit unveränderter Wildtypsequenzspezifität. Da es andererseits äußerst schwierig ist, die Spezifität von REase zu ändern, sollte es als Erfolg angesehen werden, selbst eine solche Variante zu finden, die ein Spaltmuster erzeugt, das sich vom Wildtyp-Enzym in einem einzigen Screening von 24 Klonen unterscheidet. In unseren Händen konnten die besten Bildschirme bis zu 20% der vielversprechenden Varianten identifizieren (Abbildung 8A).

Das positive Ergebnis hängt stark von einer Bibliotheksqualität (d. h. einer begrenzten Häufigkeit von Substitutionen und deren zufälliger Verteilung) und einer effizienten Erfassung der biotinylierten Population von Bibliotheksmitgliedern ab (Schritte 3.6–3.7). Beide Probleme können erkannt werden. Die Bibliotheksqualität sollte vor der Auswahl überprüft werden, indem so viele Klone wie möglich sequenziert werden (>15) oder durch direkte Sequenzierung der Bibliothek durch Hohe Durchsatzsequenzierung (Schritt 3.10, Tabelle 3). Wenn die Mehrheit der ausgewählten Klone nicht aktiv ist, ist dies ein klarer Hinweis auf einen Fehler der Streptavidin-Erfassungsauswahl. Ein ähnlicher Effekt wird bei Bibliotheken beobachtet, die viele Auswahlzyklen durchlaufen, da solche Bibliotheken höchstwahrscheinlich von inaktiven Varianten dominiert werden, die dem Auswahlschritt für streptavidin-Erfassungsschritte entkommen sind (Abbildung 8B). Daher ist es ratsam, das Screening nach jedem Auswahlzyklus durchzuführen und manuell ausgewählte vielversprechende Varianten weiterzuentwickeln, anstatt sich auf die Auswahliteration zu verlassen.

Abbildung 1: In-vitro-Auswahl einer neuen Sequenzspezifität auf Der Grundlage des NlaIV-Engineerings. (A) Die Organisation der Ausdrucks-/Auswahlkassette (ESC) umfasst zwei Erkennungsstellen für REase, 1) die ausgewählte Sequenz (GGATCC) nahe dem rechten Ende und 2) die Counter selected Sequence (GGSSCC) nahe dem linken Ende sowie den T7p- und T7t-T7-Promoter und den T7-Terminator. Die Primerbindungsstellen sind unten dargestellt. Cleavage nach Wildtyp und ausgewählten NlaIV-Varianten werden jeweils als rote bzw. grüne Dreiecke dargestellt. (B) Auswahlzyklusschritte: I) Emulgierung von Transkriptions-Übersetzungs-Spaltungsreaktionen mit der ESC-Bibliothek; II) Die gesamte biotinylierte DNA wird auf magnetischen Partikeln erfasst, die mit Streptavidin beschichtet sind, und entfernt, wodurch inaktive Varianten entfernt werden; III) ESCs, die REases mit Wildtypaktivität kodieren (d. h. solche, die die GGSSCC-Sequenz spalten können) werden eliminiert, da die Spaltung der Sequenz die Bindungsstellen für die Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung trennt. Daher findet keine Verstärkung dieser ESCs statt; IV) Die Eingabe für die nächste Auswahlrunde wird durch Zugabe von Biotin am rechten Ende und Wiedereinführung der Variation der gegenden ausgewählten Sequenzen am linken Ende erstellt. Nachdruck von Czapinska et al.⁸ mit Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Vorbereitung des ESC. Fragmente, die aus dem ursprünglichen Konstrukt in einem Expressionsvektor abgeleitet wurden, der NlaIV ORF unter der Kontrolle des T7-Promotors enthielt, wurden modifiziert, um für den Ausdruck/die Auswahl geeignet zu sein. Der NlaIV-Standort flussabwärts vom NlaIV ORF wurde entfernt und einzigartige Standorte (SalI, EcoRI und Eco52I), die zur Mutagenisierung ausgewählter Positionen verwendet wurden, wurden im NlaIV ORF als stille Mutationen eingeführt. Das letzte Konstrukt wurde mit flankierenden Primern verstärkt, die zwei flankierende NlaIV-Standorte einführten: Die Zählerauswahl (GGSSCC) auf der linken Seite und die ausgewählte Sequenz (GGATCC) auf der rechten Seite. Die Umgekehrte Grundierung führte auch Biotin ein. Primer, die bei der Erstellung von mutiertem ECS verwendet werden, werden als blaue Pfeile dargestellt und unten beschriftet (siehe Tabelle 1B,C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Schema der Split- und Mixsynthese. Das Beispiel bezieht sich auf die MutB-Primersynthese, bei der eine NNS-Sequenz mit einer Frequenz von 0,8 an vier Positionen eingeführt wurde (siehe auch Tabelle 3). Beachten Sie, dass die chemische Synthese von 3' bis 5' durchgeführt wird, aber alle Sequenzen in kanonischer 5'-3' Ausrichtung dargestellt werden (d. h. sie verläuft in diesem Schema von rechts nach links). Wildtypsequenzen an mutagenisierten Positionen werden grün dargestellt, während NNS-erbgutverändernde Sequenzen rot sind. Die SalI-Erkennungsseite, die später zur Einführung von Mutationen in ESCs verwendet wird, wird unterstrichen. Misch- und Spaltschritte (2 und 4) sind angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Verwendung einzigartiger Restriktionsenzyme bei der gezielten Mutagenese von Oligonukleotid. Die Strategie der Mutationseinführung wird an einem Beispiel für den Aufbau von Bibliotheken A-C gezeigt (siehe Schritte 3.1–3.7). Nachdruck von Czapinska et al.⁸ mit Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Endonukleolytische Spaltung in in vitro Transkription-Translation. (A) Spaltung eines Prüfsubstrats in optimalem REase-Puffer: 1) Substrat, 612 bp PCR-Produkt mit einer einzigen NlaIV-Erkennungsstelle; 2) Cleavage-Produkte, 355 bp und 257 bp. (B) Cleavage in einer In-vitro-Transkriptions-Translation-Reaktion (mit 0,5 g ESC): 1–2) 15 L Aliquots der In-vitro-Transkriptionstranslation ohne Substrat (Zeile 2: Reaktion ergänzt mit 1,5 mM MgCl₂); 3–4) 15 L Aliquots der In-vitro-Transkriptionstranslation mit 1 g Testsubstrat; (Zeile 4: Reaktion ergänzt durch 1,5 mM MgCl₂). S-DNA-Größenmarker (pBR322 mit MspI verdaut). Die Stichproben wurden in 6% nativer PAGE aufgelöst. Die DNA wurde mit Ethidiumbromid gefärbt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Produkte der ersten PCR im Auswahlzyklus. Siehe Abbildung 1B, Schritt III; Protokollschritt 5.10. Die Spaltensätze 1 und 2 sind Aliquots von zwei verschiedenen Bibliotheken, die in dreifacher Ausfertigung geladen werden. S-DNA-Größenstandard (Lambda-DNA mit HindIII und EcoRI verdaut). Pfeil zeigt position des ESC in voller Länge (1.050 bp) an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: NlaIV-Varianten für weitere Screenings im Mini-Maßstab gereinigt. Siehe Schritt 6.3.11. Jede Linie enthält ein 10-L-Aliquot einer anderen Variante. S-Protein Molekulargewichtsstandard. Die Molekularmasse der Untereinheit NaIV REase beträgt 29,9 kDa. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 8: Beispiele für das Screening von NlaIV-Varianten zur Änderung der Sequenzspezifität. Siehe Schritt 6.4.2. (A) Erfolgreiches Screening mit hoher Frequenz vielversprechender Varianten. S = DNA-Größenmarker, Lambda-DNA mit HindIII und EcoRI verkleben; Wildtyp (wt) = Lambda-DNA mit Wildtyp NlaIV spaltend; • = Lambda-DNA-Substrat, nicht geklammert; andere Spalten=Varianten mit sehr geringer Aktivität. Varianten sind beschriftet ! = vielversprechende Varianten, die ein Spaltmuster erzeugen, das sich vom Wildtyp-Enzym unterscheidet; ? = Varianten, die möglicherweise auch die Sequenzpräferenz geändert haben. (B) Erfolgloses Screening, mit einer Mehrheit von Varianten inaktiv und einer Variante mit scheinbar unverändertem Spaltmuster. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 9: Alternative Auswahl nach Ligation. Diese Alternative kann für alle REases verwendet werden, die klebrige Enden erzeugen. Hier stellen wir ein Beispielprotokoll für ein Selektionsschema für MwoI-Enzym (unveröffentlicht) vor. I) Ausgewählte Sequenz (am rechten Ende des ESC) mit definierten Rückständen in Rot und ausgewählter Variation der in Blau dargestellten Cognate-Sequenz. In Klammern unterhalb der vom Zähler ausgewählten Sequenz, die am linken Ende des ESC platziert werden soll, wird angezeigt; II) Produkt der MwoI-Spaltung; III) Nach Beendigung der In-vitro-Transkription/Übersetzung werden die Produkte gereinigt und die Ligation mit überschüssigem Adapter durchgeführt. Nur die Dekolleté-Produkte, die in der ausgewählten Sequenz gespaltet wurden, können an der Ligation teilnehmen. Daher werden inaktive Varianten eliminiert, und der Pulldownschritt ist nicht erforderlich. Das Spaltprodukt in der gegensätzlich ausgewählten Sequenz (am linken Ende des ESC, nicht dargestellt) kann nicht an dieser Ligation teilnehmen, da das hervorstehende Ende des Adapters nicht komplementär zur ausgewählten Sequenz des Zählers ist; IV) Selektive PCR verwendet die gleiche Strategie wie im Hauptprotokoll, um Varianten mit der wilden Art degenerierte Sequenzspezifität (F1-Primerbindung distal an die gegendienmarkierte ausgewählte Stelle) zu beseitigen, während inaktive Varianten durch die selektive Reverse Primer eliminiert werden, die nicht an das uncleaved (und daher nicht durch Adapterligation geändert) rechte Ende binden kann. Im nächsten Zyklus kann der Prozess iteriert werden, indem ein Adapter verwendet wird, der mit dem Spaltprodukt des vorhergehenden Schritts identisch ist (d. h. die "Spaltenkassette" in Panel III), und eine geeignete selektive Reverseprimer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Primer, die in der NlaIV-Konstruktion verwendet werden. Die Sequenzen der in den Kommentaren genannten Einschränkungsseiten werden unterstrichen. Kleine Buchstaben zeigen Sequenzen an, die keine Ergänzungen in den DNA-Vorlagen haben. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Tabelle 2: Bedingungen der PCR-Reaktionen, die im Protokoll verwendet werden sollen. T_m = Grundschmelztemperatur (wenn T_m für die Primer unterschiedlich ist, sollte das untere T_m verwendet werden). Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Tabelle 3: Ergebnisse der Qualitätsprüfung von zwei mutagenen Primern, die mit Split-and-Mix-Strategie synthetisiert wurden. Mutagenisierte Codons werden mit [XXX] angezeigt. Eine niedrigere Indexzahl gibt die Position einer codierten Aminosäure an. Angepasst von Czapinska et al.⁸ mit Genehmigung von Elsevier. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Tabelle 4: Ergebnisse der EP-PCR. Hauptparameter aus der Sequenzanalyse von 22 Clones von ECS. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

Diskussion

Das hier beschriebene Auswahlprotokoll wurde für NlaIV⁸getestet, eine dimerische PD-(D/E)XK-Falzerkennungssequenz, die eine palindromische Zielstelle mit zentralen NN-Basen erkennt und einen stumpfen Endschnitt zwischen den NN-Basen katalysiert. NlaIV wurde gepflückt, weil die Spaltung zwischen den NN-Basen darauf hindeutet, dass diese Basen in der Nähe des Proteins im Komplex liegen. Prinzipiell könnte das Protokoll für jede sequenzspezifische Restriktionsendonuklease, monomeric oder dimeric, jeder Falzgruppe verwendet werden, wodurch Doppelstrangbrüche von jedem Staffelr katalysiert werden, unabhängig davon, ob katalytische und spezifizistische Domänen übereinstimmen (wie im NlaIV-Beispiel) oder getrennt sind (z. B. FokI). Darüber hinaus ist das Protokoll im Prinzip nicht nur für die Erzeugung neuer, engerer Enzymspezifität nützlich, sondern könnte auch verwendet werden, um Staraktivitäten zu eliminieren oder High-Fidelity-Endonukleasen zu erstellen. All dies wurde jedoch noch nicht getestet. Insbesondere kann die gezielte Eliminierung der Sternaktivität kompliziert sein, da dieselben Aminosäurerückstände an der Bindung an die gewünschten und unerwünschten Basen beteiligt sein könnten. Die in diesem Protokoll beschriebenen In-vitro-Schritte beschränken sich nicht auf die Auswahl eingeengter Spezifitäten, sondern könnten auch zur Auswahl anders veränderter Spezifitäten verwendet werden. Allerdings gibt es dann ein Problem mit variantenenden Endonukleasen: Wenn das Spektrum der Substrate neue Ziele enthält, die nicht durch die elterliche Endonuklease gespaltet werden, gibt es im Allgemeinen keine gute Möglichkeit, Zellen vor den schädlichen Auswirkungen dieser Aktivität zu schützen. Im Gegensatz dazu sind die Ziele, wenn die Endonuklease-Spezifität nur eingeengt wird, eine Teilmenge der Wildtyp-Ziele, und daher sollte die bereits verfügbare Cognate-Methyltransferase vollständig schützend sein.

Unser Protokoll unterscheidet sich in mehrfacher Hinsicht von vielen gerichteten Evolutionsprotokollen. Offene Leserahmenvielfalt wird einmal zu Beginn des Experiments generiert, nicht in jeder Iteration. Darüber hinaus wird es durch Split-and-Mix-Synthese und nicht durch EP-PCR erstellt. Für NNS-Substitutionen von Codons, wie sie in dieser Arbeit verwendet werden, gibt es (4 x 4 x 2)⁶ x 1,07 x 10⁹ Kombinationen für sechs Positionen. Daher ist jede variante im Durchschnitt einmal in 1,7 Fmoles des ESC vorhanden. Diese Kapazität kann auf sieben Positionen erhöht werden, indem eine Synthese mit einer Mischung aus 20 Tridemoactid-Vorläufern verwendet wird, die von Glen Research angeboten wird, oder durch Verringerung der Mutationshäufigkeit in weniger vielversprechenden Positionen mit Split-and-Mix-Oligonukleotid-Synthese. Wenn möglich, wird empfohlen, das Ausmaß der Variation auf sechs Positionen zu begrenzen. Offensichtlich erfordert eine solche Mutagenese-Targeting einige bereits vorhandene Kenntnisse über zumindest die Regionen der REase, die an der Substratbindung beteiligt sind. Das Split-and-Mix-Protokoll zur Erzeugung von Diversität hat gegenüber EP-PCR deutliche Vorteile. Mit EP-PCR erhielten wir unveränderte Varianten und Sequenzen mit acht Substitutionen für NlaIV-ESCs in derselben EP-PCR (Tabelle 4). Die Bibliothek von EP-PCR enthält einen wesentlichen Bruchteil von Klonen, die vermieden werden sollten (wilde Typsequenzen, Mehrfachersetzungen, Frameshift- und Nonsense-Mutationen und Mutationen an Orten, an denen die Sequenzspezifität wahrscheinlich nicht beeinflusst wird).

Unser Protokoll unterscheidet sich auch von vielen anderen gerichteten Evolutionsprotokollen durch zwei sequenzielle Auswahlschritte. Eine positive Auswahl stellt sicher, dass die gewünschte Aktivität beibehalten wird, da sonst das Biotin-Tag nicht entfernt wird und die Codierungssequenz durch Pull-down entfernt werden kann. Es ist technisch möglich, dass die zufällige Entstehung einer neuartigen, nicht überlappenden Spezifität (z.B. GCATGC) auch zur Abtrennung des Biotin-Tags führen könnte, wenn eine geeignete Spaltungsstelle in der Nähe der gewünschten Spaltung vorhanden ist, aber nicht anderswo. Dies dürfte jedoch höchst unwahrscheinlich sein. Negative Auswahl entfernt offene Leserahmen, die für Enzyme kodieren, die noch die unerwünschte Aktivität haben. Dieser Schritt ist nicht zwingend vorgeschrieben, da das Protokoll die Ausgabebibliothek immer noch mit Varianten anreichert, die in der Lage sind, die Auswahlsequenz zu spalten, aber nicht an anderer Stelle im ESC spalten können, wodurch sie für die PCR-Verstärkung ungeeignet ist. Es wird jedoch erwartet, dass die Auswahlwirksamkeit geringer ist, da Enzyme mit der ursprünglichen Sequenzspezifität nicht aus dem Output entfernt werden und vielversprechende Varianten mit veränderter Spezifität, aber auch verminderter enzymatischer Aktivität übertreffen. Beachten Sie, dass auf der Bevölkerungsebene sowohl gewünschte als auch unerwünschte Zielsequenzen degenerieren können, aber nicht sein müssen. Im NlaIV-Beispiel wurde das Antiziel degeneriert und das Ziel nicht degeneriert. Selbst wenn es Eine Degenerierung auf Bevölkerungsebene gibt, ist in einem einzigen Tröpfchen nur ein (nicht degeneriertes) Ziel oder Antiziel vorhanden. In unserem Protokoll werden Ziel- und Antizielsequenzen bei jeder Wiederholung der Selektionsschritte wieder eingeführt. Daher muss ein offener Leserahmen ein Enzym kodieren, das in der Lage ist, alle möglichen Ziele zu spalten, und nicht in der Lage ist, eines der Anti-Ziele zu spalten, um mehrere Auswahlrunden zu überleben. Beachten Sie, dass die Notwendigkeit, das Antiauswahlziel bei jeder Iteration des Protokolls erneut einzuführen, zwei sequenzielle PCRs erzwingt. Die erste PCR verwendet eine Grundierung, die außerhalb des Anti-Ziels anneals, so dass Spaltung des Anti-Ziel verhindert die PCR-Reaktion. Die zweite PCR erfordert eine Grundierung, die über das Anti-Ziel hinausreicht, und führt das Anti-Ziel wieder ein, um sicherzustellen, dass während mehrerer Auswahlrunden jeder offene Leserahmen mit allen Varianten des Anti-Ziels getestet wird.

Für Enzyme, die klebrige Enden erzeugen, kann ein verwandtes Alternativprotokoll verwendet werden, das auf einer zuvor beschriebenen Methode zur Isolierung von REase ORF¹⁰ basiert. Die Erschöpfung inaktiver Varianten durch Biotinerfassung, die in unseren Experimenten verwendet wird, wird im Alternativprotokoll durch Ligation des kompatiblen Adapters durch eine Sequenz ersetzt, die als Primerbindungsstelle in einer selektiven PCR verwendet wird (Abbildung 9). Nur ESCs, die Enzyme mit der ausgewählten Spezifität produzieren, erzeugen ligationsfähige Enden und werden daher ausgewählt. Die Reihenfolge des klebrigen Endes der ausgewählten Zählersequenz muss so gestaltet sein, dass sie nicht an der Ligation mit Adaptern teilnehmen kann. Die Iteration des Auswahlprozesses kann leicht erreicht werden, indem zwischen zwei verschiedenen Adaptern und damit zwei verschiedenen Reverse primern in selektiver PCR gewechselt wird.

Auch mit neuen Protokollen ist die Aufgabe, neue Besonderheiten in vitro zu erarbeiten, immer noch eine große Herausforderung. Bei typischen Typ-II-REases hängen Sequenzspezifität und endonukleolytische Aktivität von denselben Proteinregionen ab. Es ist daher schwierig, das eine zu ändern, ohne das andere zu beeinträchtigen. Der Erfolg wird durch eine Strategie wahrscheinlicher, die den Fußabdruck des Enzyms berücksichtigt, die Symmetrie von Protein-DNA-Wechselwirkungen respektiert und auf bereits bestehenden enzymatischen Präferenzen aufbaut, die im Voraus in biochemischen Experimenten bestimmt werden sollten, wie dies für das NlaIV-Beispiel⁸geschehen ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1000Å CPG Support (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	Anbieter können ebenfalls verwendet werden
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
GeneJET Gel Extraction Kit	Thermo Scientific	K0691	Jedes andere Kit kann verwendet werden
Glen-Pak DNA-Aufreinigungskartusche	Glen Research	60-5200
HIS-Select Nickel Affinity Gel	Sigma	P6611
pET 28a-Vektor			Jeder andere Vektor mit T7-Promotor vor der Plyclonierstelle kann anstelle verwendet werden
Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase	Thermo Scientific	F530S	Jeder andere thermophile Polymearse mit hoher Genauigkeit und hoher Prozessfähigkeit kann anstelle verwendet werden
Poröse Stahlfolie	Biosset	40-063
Rapid Translation System RTS 100, E.coli HY Kit	Roche	3 186 148
Restriktionsendonukleasen	Thermo Scientific		Offensichtlich können auch andere Anbieter, Enzyme verwendet werden
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	Andere Anbieter können ebenfalls verwendet werden. Wir haben Betten von Sigma
Synthesechemikalien einschließlich Phosphoramiden	Carl Roth		Andere Anbieter können ebenfalls verwendet werden
Synthesesäulen (verschiedene Größen)	Biosset
T4 DNA-Ligase	Thermo Scientific	EL0011	Jede andere Ligase kann verwendet werden