Stabiler Knockdown von Genen, die extrazelluläre Matrixproteine in der C2C12 Myoblast-Zelllinie mit Small-Hairpin (sh)RNA kodieren

Nandaraj Taye; Sarah Stanley; Dirk Hubmacher

doi:10.3791/60824

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Methodenartikel

Stabiler Knockdown von Genen, die extrazelluläre Matrixproteine in der C2C12 Myoblast-Zelllinie mit Small-Hairpin (sh)RNA kodieren

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DOI:

10.3791/60824

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12. Februar 2020

Nandaraj Taye¹ , Sarah Stanley¹ , Dirk Hubmacher¹

¹Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir bieten ein Protokoll, um Gene, die extrazelluläre Matrixproteine (ECM) in C2C12-Myoblasten kodieren, mit Small-Hairpin (sh) RNA zu fallig zu senken. Als Beispiel für ADAMTSL2 beschreiben wir die Methoden zur Validierung der Knockdown-Effizienz auf mRNA-, Protein- und Zellebene während der Myotube-Differenzierung von C2C12.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Matrixproteine (ECM) sind entscheidend für die Entwicklung von Skelettmuskeln und Homöostase. Der stabile Knockdown von Genen, die für ECM-Proteine in C2C12-Myoblasten kodieren, kann angewendet werden, um die Rolle dieser Proteine bei der Entwicklung der Skelettmuskeln zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erschöpfung des ECM-Proteins ADAMTSL2 als Beispiel, indem man small-hairpin (sh) RNA in C2C12-Zellen verwendet. Nach der Transfektion von shRNA-Plasmiden wurden stabile Zellen mit Puromycin chargenausgewählt. Wir beschreiben weiter die Aufrechterhaltung dieser Zelllinien und die phänotypische Analyse mittels mRNA-Expression, Proteinexpression und C2C12-Differenzierung. Die Vorteile der Methode sind die relativ schnelle Erzeugung stabiler C2C12-Knockdown-Zellen und die zuverlässige Differenzierung von C2C12-Zellen in mehrkernige Myotuben bei Erschöpfung des Serums im Zellkulturmedium. Die Differenzierung von C2C12-Zellen kann durch Hellfeldmikroskopie und durch Messung der Expressionskonzentrationen kanonischer Markergene wie MyoD, Myogenin oder Myosin-Schwere Kette (MyHC) überwacht werden, was auf das Fortschreiten der C2C12-Myoblastendifferenzierung in Myoröhren hinweist. Im Gegensatz zum vorübergehenden Knockdown von Genen mit small-interfering (si) RNA können Gene, die später bei der C2C12-Differenzierung oder während der Myotube-Reifung exprimiert werden, effizienter gezielter werden, indem C2C12-Zellen erzeugt werden, die shRNA stabil exprimieren. Einschränkungen der Methode sind eine Variabilität der Knockdown-Effizienz, abhängig von der spezifischen shRNA, die durch die Verwendung von Gen-Knockout-Strategien auf der Grundlage von CRISPR/Cas9 überwunden werden kann, sowie potenziellen Off-Target-Effekten der shRNA, die in Betracht gezogen werden sollten.

Einleitung

Extrazelluläre Matrixproteine (ECM) unterstützen strukturell alle Gewebe, vermitteln die Zell-Zell-Kommunikation und bestimmen das Zellschicksal. Die Bildung und dynamische Umgestaltung des ECM ist daher entscheidend für die Erhaltung der Gewebe- und Organhomöostase¹^,². Pathologische Varianten in mehreren Genen, die für ECM-Proteine kodieren, führen zu Muskel-Skelett-Erkrankungen mit Phänotypen, die von Muskeldystrophien bis zum pseudomouscularen Aufbau³^,⁴reichen. Zum Beispiel verursachen pathogene Varianten in ADAMTSL2 die extrem seltene Musk....