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Identifizierung von Neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Feline Arteriellen Thrombi mittels Immunfluoreszenzmikroskopie

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DOI:

10.3791/60834

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29. März 2020

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1Veterinary Medical Teaching Hospital, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Department of Veterinary Medicine and Epidemiology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung neutrophiler extrazellulärer Fallen (NETs) in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten kardiogenen arterieogenen arteriellen Thromben mit wärmeinduziertem Antigen-Retrieval und einem doppelten Immunlabeling-Protokoll.

Zusammenfassung

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs), bestehend aus zellfreier DNA (cfDNA) und Proteinen wie Histonen und neutrophiler Elastase (NE), werden von Neutrophilen als Reaktion auf systemische Entzündungen oder Krankheitserreger freigesetzt. Obwohl NETs bisher gezeigt haben, dass sie die Gerinnselbildung verstärken und die Fibrinolyse bei Menschen und Hunden hemmen, ist die Rolle von NETs bei Katzen mit kardiogener arterieller Thromboembolie (CATE), einer lebensbedrohlichen Komplikation, die zur hypertrophen Kardiomyopathie sekundär ist. , ist unbekannt. Eine standardisierte Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von NETs in kardiogenen arteriellen Thromben bei Katzen wird unser Verständnis ihrer pathologischen Rolle in CATE fördern. Hier beschreiben wir eine Technik zur Identifizierung von NETs in formaldehydfixierten und paraffin-eingebetteten Thromben innerhalb der Aortenverzweigung, die während der Nekropsie extrahiert wird. Nach der Deparaffinierung mit Xylol wurden Aortenschnitte indirekt wärmeinduzierte Antigenabrufungen unterzogen. Abschnitte wurden dann blockiert, permeabilisiert, und ex vivo NETs wurden durch Kolokalisierung von zellfreier DNA (cfDNA), citrulliniertem Histon H3 (citH3) und neutrophiler Elastase (NE) mittels Immunfluoreszenzmikroskopie identifiziert. Um die Immundetektion von NETs in Thromben zu optimieren, wurde die Autofluoreszenz von Gewebeelementen durch die Verwendung eines Autofluoreszenz-Quenching-Verfahrens vor der Mikroskopie eingeschränkt. Diese Technik könnte ein nützliches Werkzeug sein, um NETs und Thrombose bei anderen Arten zu studieren und bietet neue Einblicke in die Pathophysiologie dieses komplexen Zustandes.

Einleitung

Katzen mit hypertropher Kardiomyopathie sind dem Risiko lebensbedrohlicher thromboembolischer Komplikationen1,2ausgesetzt. Trotz der hohen Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit fein kardiogener arterieller Thromboembolie (CATE) ist die zugrunde liegende Pathophysiologie von CATE bei Katzen schlecht verstanden. Es gibt auch begrenzte diagnostische und therapeutische Instrumente zur Behandlung und Identifizierung von Katzen, die von diesem verheerenden Zustand bedroht sind3.

Zusätzlich zu seiner Rolle bei der angeborenen Immunität haben Neutrophilen gezeigt, dass sie eine Rolle bei der Thrombose spielen, indem sie neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) freisetzen, die webartige Netzwerke zellfreier DNA (cfDNA) sind, die mit Histonen und granulären Proteinen wie Neutrophilenase (NE) und Myeloperoxidase verkrustet sind. Neutrophile durchlaufen NETs Bildung als Reaktion auf systemische Entzündung, direkte Begegnung mit Krankheitserregern, und Interaktion mit aktivierten Blutplättchen4,5,6,7. Bei Hunden, neutrophil-abgeleitete DNA hat sich gezeigt, dass GerinnselLyse hemmen, während NET-Proteine die Gerinnselbildung beschleunigen. Die Fähigkeit von NETs, zirkulierende Zellen und Gerinnungskomponenten zu fangen, ist auch der Schlüssel zu ihren thrombogenen Eigenschaften8,9,10,11,12.

NETs werden durch Kolokalisierung von extrazellulären neutrophilen Proteinen, Histonen und cfDNA nachgewiesen. Aus diesem Grund ist die Identifizierung und Quantifizierung von NETs in festen Geweben durch Immunfluoreszenz von deparaffiniertem Gewebe dem traditionellen Hämatoxylin- und Eosinfleck (H&E) mit Hellfeldmikroskopie4,5überlegen. Mehrere Studien am Menschen mit Immunfluoreszenzmikroskopie identifizierten NETs als strukturelle Komponenten von koronaren arteriellen Thromben, zerebralen Schlaganfall-Thromben, Atherothrombose und venösem Thrombi13,14,15,16,17. Bis heute wurde eine standardisierte Methode zur Erkennung und Quantifizierung von NETs in Katzenthromben nicht beschrieben. Da die Identifizierung von NETs in transinenkardiinen arterienförmigen Thromben zukünftige translationale Forschung entolieren kann, beschreiben wir Techniken der NET-Identifikation und -Bewertung in paraffin-eingebetteten arteriellen Thromben bei Katzen.

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Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of California, Davis, durchgeführt. Nekropsien und Biopsien von Geweben wurden mit Zustimmung der Eigentümer durchgeführt.

1. Gewebefixierung, Einbettung und Schnitt

  1. Dissect out der aortenbifurkation, einschließlich der absteigenden Aorta, Femoralarterie, und die gemeinsamen Iliasarterien (Abbildung 1A), kurz nach humaner Euthanasie oder Tod. Blunt sezieren die Faszie (Abbildung 1B), bevor sie vollständig in 10% neutral gepuffertes Formalin für mindestens 24 h und nicht länger als 48 h getaucht wird.
  2. Um die Probe zu dehydrieren, tauchen Sie zuerst in 10% neutral gepuffertes Formalin ein, das 1 h auf 37 °C erhitzt wird. Dann tauchen Sie in steigenden Konzentrationen von Ethanol erhitzt auf 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x für je 1 h. Schließlich, ohne Spülung, tauchen Sie 2x in 100% Toluin erhitzt auf 37 °C für 1 h jeder.
  3. Paraffin auf 62 °C erhitzt hinzufügen und das Paraffin vollständig über Nacht erstarren lassen.
  4. Abschnitt 2–3 m des paraffineingebetteten Gewebes mit einem Mikrotome und auf positiv geladenen Glasdias platzieren. Schnittgewebe bis zu einer weiteren Analyse bei -80 °C lagern.

2. Deparaffinierung, Rehydratation und wärmeinduzierte Antigenabruf

  1. Um die Deparaffinierung und Rehydrierung von Abschnitten auf Glasgleitern durchzuführen, legen Sie Glasschlitten in Regale und verarbeiten Sie in der folgenden Reihenfolge:
    1. Vollständig in 100% Xylol für 3 min untertauchen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x. Spülen Sie nicht zwischen den Schritten.
    2. Vollständig in abnehmenden Ethanolkonzentrationen untertauchen (100%, 95%, 70%) bei Raumtemperatur (RT), 3x für je 3 min. Spülen Sie nicht zwischen den Schritten.
    3. Vollständig in entionisiertes Wasser für 2 min untertauchen. Wiederholen.
  2. Legen Sie Abschnitte in Tris-gepufferte Salin mit 0,1 % Tween (TBST, pH = 7,6) für 2–3 min.
  3. Füllen Sie das Reservoir mit entionisiertem Wasser, das auf 100 °C erhitzt wird. Lassen Sie die Dampfkammer für 20 min ausdemieren.
    HINWEIS: Die wärmeinduzierte Antigenabrufung wird am besten mit indirekter Erwärmung durchgeführt, die von einem Dampfer mit einer voreingestellten Temperatureinstellung erzeugt wird, z. B. einem Lebensmitteldampfer.
  4. Erhitzen Sie die handelsübliche Antigen-Retrievallösung, die Tris und EDTA (pH = 9) enthält, auf einer temperaturgeregelten Kochplatte unter ständigem Rühren auf 95–97 °C. Stellen Sie sicher, dass es nicht kocht.
    HINWEIS: Die Lösung sollte trüb werden, sobald sie erwärmt ist.
  5. Gießen Sie die beheizte Antigen-Retrieval-Lösung in einen Schiebebehälter und legen Sie den Behälter in die Kammer des Dampfers. Lassen Sie die Antigen-Retrieval-Lösung auf die Temperatur des Dampfers für 3–4 min ausdemaieren. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur der Kammer 95 °C beträgt.
  6. Untertauchen Sie die Dias vollständig in die beheizte Antigen-Retrieval-Lösung und setzen Sie den Einsatz der externen Erwärmung über den Dampfer für 20 min fort.
  7. Entfernen Sie den Schieberbehälter aus dem Dampfer und lassen Sie die Dias und die Antigen-Retrieval-Lösung auf RT abkühlen. Bewahren Sie die verdünnte Antigen-Retrieval-Lösung bei 4 °C auf und verwenden Sie bei Bedarf bis zu 2x.
  8. Waschen Sie die Dias 3x mit TBST für 5 min.

3. Immunkennzeichnung und Autofluoreszenzabschreckung

HINWEIS: In Tabelle 1 ist die Zusammensetzung der blockierenden Puffer aufgeführt, die in den folgenden Schritten verwendet werden.

  1. Inkubieren Sie Abschnitte in Blocking Buffer 1 für 2 h bei RT unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min). Versiegeln Sie mit Paraffinfolie, um ein Trocknen zu vermeiden.
  2. Ohne Waschen sofort 100 l polyklonalen antihumanen citrullinierten Histon-H3-Antikörper (0,03 mg/ml im Sperrpuffer 1) direkt auf das Dia auftragen.
  3. Legen Sie einen Abdeckzettel (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) auf jeden Abschnitt, um eine gleichmäßige Verteilung des Antikörpergemischs zu ermöglichen.
  4. 12–16 h bei 4 °C mit sanftem Schaukeln (30–50 Umdrehungen von 15:0 00 Uhr) bebrüten. Versiegeln Sie mit Parafilmfolie, um ein Trocknen zu vermeiden.
  5. 3x mit TBST für 5 min waschen.
  6. Tragen Sie 100 l Ziegenanti-Kaninchen-Antikörper auf, die mit Alexa Fluor 488 konjugiert sind (verdünnt auf eine Endkonzentration von 0,04 mg/ml oder 1:50 in Blocking Buffer 1), wie in Schritt 3.3 beschrieben. 1 h bei RT unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min) inkubieren. Schützen Sie Dias vor Licht.
  7. Waschen Sie mit TBST 3x für 5 min.
  8. Inkubieren Sie Abschnitte in Blocking Buffer 2 über Nacht bei 4 °C unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min). Vor Licht schützen.
  9. Waschen Sie mit TBST 3x für 5 min.
  10. Blockabschnitte in Blocking Buffer 3, wie in Schritt 3.3 bei RT beschrieben, für 2 h unter sanftem Schaukeln (30–50 U/min).
  11. Inkubieren Abschnitte mit biotinylierten polyklonalen Kaninchen antihumanen NE-Antikörper (Endkonzentration = 0,2 g/ml in Blocking Buffer 3) bei 4 °C für 12–16 h, wie in den Schritten 3.2–3.4 beschrieben.
  12. Waschen Sie mit TBST 3x für 5 min.
  13. Inkubieren Sie mit Alexa Fluor 594 Streptavidin-Konjugat (verdünnt auf 1:100 oder 0,02 mg/ml in Blocking Buffer 3), wie in den Schritten 3.2–3.3 für 1 h bei RT beschrieben.
  14. Waschen Sie mit TBST 1x für 5 min.
  15. Tragen Sie 100 l Autofluoreszenz-Abschrecklösungsmischung direkt auf die Abschnitte für 1 min auf, wie vom Hersteller angewiesen.
  16. Waschen Sie die Dias sofort mit TBST 6x für 10 min.
  17. Bedecken Sie jede Folie mit 100 l von 300 nM DAPI für 5 min im Dunkeln.
  18. Waschen Sie mit TBST für 3 min. Wiederholen Sie dies für insgesamt 5x.
  19. Tragen Sie einen Tropfen (ca. 50 l) Antifade-Montagemedium, Teil des Autofluoreszenz-Abschreckkits, direkt auf die Glasrutsche auf, die den Abschnitt umgibt. Legen Sie einen Abdeckzettel (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) vorsichtig auf den Abschnitt, ohne Blasen zu erzeugen.
  20. Proben bei 4 °C über Nacht im Dunkeln aushärten lassen, bis sich das Montagemedium für die mikroskopische Analyse mit Tauchlinsen gehärtet hat.

4. Neutrophile extrazelluläre Trap-Identifikation

HINWEIS: Das folgende Protokoll verwendet ein invertiertes Epifluoreszenzmikroskop mit einer 1.280 x 960 digitalen CCD-Kamera (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Um Thrombi zu lokalisieren, scannen Sie kranially zu kauarisch entlang der Länge der Aorta, Aortenbifurkation, und jede Femoralarterie mit Phasenkontrastmikroskopie mit einem 10-fachen Objektiv. Ein Thrombus ist ein Konglomerat von Geweben, die rote Blutkörperchen, weiße Blutkörperchen und Blutplättchen neben dem Endothel auf Phasenkontrast und Hellfeldmikroskopie enthalten (Abbildung 2A, Abbildung 2B).
  2. Erste Untersuchung von Abschnitten für NETs mit dem DAPI-Kanal (Erregung = 357/44 nm) mit 10x- und 20-fach-Objektiven (Abbildung 2C). Beachten Sie, dass cfDNA als dekondensierte DNA erscheint, die nicht innerhalb der Grenzen des Zytoplasmas einer Zelle liegt, wenn sie auf Phasenkontrast oder Hellfeldmikroskopie gesehen wird.
  3. Identifizieren Sie extrazelluläres NE und CitH3 auf den Texas Red Kanälen (Erregung = 585/29 nm, Emission = 628/32 nm) und grünen fluoreszierenden Proteinkanal (Erregung = 470/22 nm, Emission = 525/50 nm) bzw. mit 10, 20 und 40x Objektiven.
  4. Bewerten und analysieren Sie NETs innerhalb eines Thrombus mit verfügbarer Software, z. B. Image J (NIH). Die NET-Bildung wird anhand der Kolokalisierung von cfDNA, extrazellulärem CitH3 und NE wie zuvor beschrieben18identifiziert. Halten Sie konsistente Belichtungszeit und Gewinne jedes Kanals während der gesamten Aufnahme von Bildern aufrecht, um eine Sättigung der Pixelintensität zu vermeiden.
  5. Ordnen Sie jeden Thrombus basierend auf seiner Nähe zur absteigenden Aorta zu, indem Sie ihn in drei gleiche Zonen unterteilen, wobei Zone 1 der Aorta, Zone 3 am weitesten von der Aorta und Zone 2 zwischen Zonen 1 und 3 am nächsten liegt. Wenn der Bediener für den Gesundheitszustand jedes Subjekts geblendet ist, nehmen Sie mindestens zehn zufällige Felder in jeder Zone ein. Charakterisieren Sie die Verteilung von NETs in Thrombi, indem Sie die Anzahl der Felder mit NETs in jeder Zone durchschnittlichisieren oder die durchschnittliche NET-Belegungsfläche pro Zone berechnen.

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Ergebnisse

Mit diesem Protokoll zur Deparaffinierung, wärmeinduzierten Antigenabruf ungegnet und doppelte Immunkennzeichnung von Paraffin-eingebettetem Thromben identifizierten wir neTs zum ersten Mal in feline CATE. Thrombi innerhalb der aortenigen Bifurkation wurden durch Fluoreszenzmikroskopie und Hellfeldmikroskopie mittels Standard-H&E-Färbung und Phasenkontrastmikroskopie lokalisiert. Bei der Hellfeldmikroskopie bestand der transinale arterielle Thrombi aus roten Blutkörperchen, Leukozyten, Fibrin und Blutplättchen (

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Diskussion

Wir beschreiben ein Protokoll zur Identifizierung von NETs in festen kardiogenen arteriellen Thromben mit einem Doppel-Immunolabeling-Protokoll und einer Immunfluoreszenzmikroskopie. Obwohl nur kardiogene arterielle Thromben gefärbt wurden, konnte dieses Protokoll theoretisch für andere Thrombentypen und andere Tierarten verwendet werden. Die Identifizierung von NETs innerhalb des felinen arteriellen Thrombens deutet darauf hin, dass NETs bei Derene bei Katzen eine Rolle spielen können.

Der Na...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Studie wurde von Mitteln der University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F) unterstützt. Die Autoren möchten Dr. Kevin Woolard für den Einsatz des Fluoreszenzmikroskops würdigen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI)Life Technologies CorporationD1306
Alexa Fluor 594 Streptavidin-KonjugatThermoFisher ScientificKatalog # S11227
Anti-citrullinierter Histon-H3-AntikörperAbcamAb5103
EVOS FL ZellbildgebungssystemThermoFisher ScientificAMEFC4300
EVOS Imaging System Objektiv 10xThermoFisher ScientificAMEP4681NA 0,25, WD 6,9/7,45 mm
EVOS Imaging System Objektiv 20xThermoFisher ScientificAMEP4682NA 0,40, WD 6,8 mm
EVOS Imaging System Objektiv 40xThermoFisher ScientificAMEP4699NA 0,75, WD 0,72 mm
Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 AntikörperThermoFisher ScientificKatalog # A32723
ZiegenserumJackson Immuno Research LabsKatalog # NC9660079. Herstellerteil # 005-000-121
Neutrophiler Elastase AntikörperBioss AntikörperBs-6982R-BiotinKaninchen polyklonaler Antikörper, Biotin konjugiert
NP40PierceProdukt # 28324. Los # EJ64292
Positiv geladene ObjektträgerThomas ScientificHersteller-Nr. 1354W-72
KaninchenserumLife TechnologyKatalog # 10510
Target Retrieval SolutionAgilent DakoS2367TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Autofluoreszenz-Quenching KitVector LaboratoriesSP-8400

Referenzen

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