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Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen

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DOI:

10.3791/60843

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24. Mai 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir eine stabile, hocheffiziente Differenzierungsstrategie für die Erzeugung postganglionischer sympathischer Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Dieses Modell wird Neuronen für die Verwendung von Studien zu multiplen autonomen Störungen zur Verfügung stellen.

Zusammenfassung

Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) sind zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung und die Untersuchung der menschlichen embryonalen Entwicklung in vitro geworden. Zuvor haben wir ein Differenzierungsprotokoll zur Ableitung autonomer Neuronen mit sympathischem Charakter vorgelegt, das auf Patienten mit autonomer Neuropathie angewendet wurde. Das Protokoll wurde jedoch auf Knock Out Serum Replacement (KSR) und Feeder-basierten Kulturbedingungen aufgebaut, und um eine hohe Differenzierungseffizienz zu gewährleisten, war eine Zellsortierung erforderlich. Diese Faktoren verursachen eine hohe Variabilität, hohe Kosten und geringe Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus wurden reife sympathische Eigenschaften, einschließlich elektrischer Aktivität, nicht überprüft. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll, in dem PSC-Kultur und Differenzierung unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen durchgeführt werden. Genetische Marker, die den neuronalen Kamm des Stammes identifizieren, werden identifiziert. Eine weitere Differenzierung in postganglionische sympathische Neuronen wird nach 20 Tagen ohne Zellsortierung erreicht. Die elektrophysiologische Aufzeichnung zeigt die funktionelle Neuronenidentität weiter. Das aus unseren differenzierten Neuronen nachgewiesene Feuer kann durch Nikotin verstärkt und durch den adrenergen Rezeptor-Antagonisten Propranolol unterdrückt werden. Zwischensympathische neuronale Vorläufer in diesem Protokoll können als neuronale Sphäroide für bis zu 2 Wochen aufrechterhalten werden, was eine Erweiterung der Kulturen ermöglicht. Zusammenfassend zeigt unser aktualisiertes sympathisches Neuronendifferenzierungsprotokoll eine hohe Differenzierungseffizienz, eine bessere Reproduzierbarkeit, mehr Flexibilität und eine bessere neuronale Reifung im Vergleich zur vorherigen Version. Dieses Protokoll wird Forschern die Zellen zur Verfügung stellen, die notwendig sind, um menschliche Störungen zu untersuchen, die das autonome Nervensystem beeinflussen.

Einleitung

Postganglionische sympathische Neuronen (SymNs) gehören zum autonomen Nervensystem (ANS) und haben mehrere wichtige Rollen bei der Reaktion und Regulierung der Homöostase des Körpers unabhängig vom Bewusstsein. Zum Beispiel stimuliert Stress SymNs und ruft die Kampf-oder-Flug-Reaktion hervor, die zu einer Erhöhung der Herzfrequenz, des Blutdrucks und des Schwitzens führt. SymNs sind bei mehreren menschlichen Störungen aufgrund von Genetik, Toxizität/Verletzung oder als Begleiter zu anderen Krankheiten betroffen. Ein Beispiel für eine genetische Neuropathie ist die Kindheitsstörung Familiäre Dysautonomie (FD), bei der eine schwere Dysregulation von SymNs eine dysautonome Krise verursacht, die durch Schwitzen, Ausblasen der Haut, Erbrechen, Bluthochdruck und Angst1offensichtlich wird. Ein Beispiel für Toxizität ist die Chemotherapie, die toxische Nebenwirkungen auf autonome2Neuronen 2 haben soll. Es ist bekannt, dass autonome Denervation und Hyper-Innervation sowohl zu Krankheiten wie Parkinson oder hypertensiveNierenerkrankung,4führen können, als auch zu begleiten. Daher ist es für die Suche nach neuartigen und wirksamen Behandlungen von Vorteil, die Mechanismen der SymN-Biologie und Defekte im Zusammenhang mit Krankheiten zu erforschen und zu verstehen.

Anatomie
Das periphere Nervensystem verzweigt sich in sensorische und autonome Divisionen. Die affevollen Nerven des sensorischen Nervensystems sind für das Gefühl von Schmerz und Berührung verantwortlich, während das ANS für die Weitergabe von Informationen von allen Organen an das Gehirn verantwortlich ist. Das ANS ist in das enterische Nervensystem unterteilt, das den Magen-Darm-Trakt, das parasympathische Nervensystem, das für die Entspannung wichtig ist, und das sympathische Nervensystem (SNS), das für die Aktivierung/Regulierung von Organen wichtig ist. Das SNS passt ein Zwei-Neuron-System5an. Präganglionische sympathische neuronale Axone im Rückenmark projizieren zunächst auf die sympathischen Ganglien, wo sich postganglionische SymN-Zellkörper befinden. Diese Neuronen senden dann lange Projektionen, um das Zielgewebe jedes Organs im Körper zu innervieren. Signale, die von präganglionischen Neuronen übertragen werden, sind cholinerge, während postganglionische SymNs adrenerge sind und somit Noradrenalin (NE) als ihren wichtigsten Neurotransmitter ausdrücken. Es gibt nur wenige bemerkenswerte Ausnahmen von postganglionischen, sympathischen Neuronen, die cholinergisch sind, einschließlich derer, die die Blutgefäße innervierend bilden. Adrenergetische postganglonische Neuronen drücken die Enzyme Tyrosinhydroxylase (TH), aromatische L-Aminosäure-Decarboxylase (AAAD), Dopamin-Hydroxylase (DBH) und Monoaminoxidase (MAO-A) aus, die alle für die Erzeugung und Metabolisierung von NE verantwortlich sind. Darüber hinaus exprimieren sie die NE-Recycling-Transporter und/oder Rezeptoren a-adrenergen Rezeptor (ADRA2), den adrenergen Rezeptor (ADR2B), den Noradrenalin-Transporter (NET1) und den vesikulären Monoamin-Transporter (VMAT1/2).

Entwicklung
Während der embryonalen Entwicklung werden SymNs aus dem Neuralkamm (NC) abgeleitet, der zwischen dem Neuralrohr und dem überlagernden Ektoderm6entsteht und sich in mehrere Zelllinien differenzieren kann, einschließlich Melanozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Glia, enterischen Neuronen, sensorischen Neuronen und autonomen Neuronen7. Neurale Kammzellen (NCCs) sind hochwandernde Zellen, die mehrere Wege durch den Embryo nehmen. In diesem frühen Stadium der NC-Entwicklung exprimieren die Zellen die Marker SNAIL1'2, FOXD3 und SOX108,9,10,11. Die Migrationsroute zusammen mit der axialen Position, die sie annehmen, bestimmt den NC-Subtyp, zu dem sie sich entwickeln werden. Diese NC-Subtypen lassen sich durch ihre spezifische HOX-Genexpression unterscheiden: Cranial NCCs exprimieren keine HOX-Gene, vagal-NCCs drücken HOX 1–5 aus, Trunk-NCCs drücken HOX 6–9 aus und sakrale NCCs drücken HOX 10–1112aus. Unter ihnen werden Trunk-NCCs als Hauptquelle von SymNs anerkannt. SymN-Vorläufer drücken den Transkriptionsfaktor MASH1/ASCL113aus, der die Expression von PHOX2B14 und INSM115fördert. Die GATA-Familie von Transkriptionsfaktoren kommt während der späten sympathischen Entwicklung zum Ausdruck. GATA2 und GATA3 werden in den SymNs ausgedrückt, was wiederum DBH16aktiviert. Der Transkriptionsfaktor HAND2 ist auch wichtig für die Expression und Wartung von DBH und TH17.

HPSCs (z. B. embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen) sind ein leistungsfähiges Werkzeug18, um Entwicklungsparadigmen zu rekapitulieren und SymNs zu erzeugen, die dann zur Krankheitsmodellierung verschiedener menschlicher Störungen eingesetzt werden können. Daher ist es bei der Generierung von SymNs aus hPSCs von entscheidender Bedeutung, Entwicklungsrichtlinien zu befolgen und die Ausprägung geeigneter Marker entlang des Differenzierungsprozesses zu bewerten.

Vorheriges symN-Protokoll
Nur wenige Forschungsgruppen haben bisher über die Generierung von SymNs aus hPSCs19,20,21berichtet. Der direkte Vergleich dieser Protokolle untereinander und unserer wurde vor kurzem22überprüft. Im Jahr 201623haben wir ein Differenzierungsprotokoll für die Erzeugung autonomer Neuronen mit SymN-Charakter veröffentlicht (Abbildung 1A). Dieses Protokoll verwendete KSR-basiertes Medium, das sowohl bei der Aufrechterhaltung undifferenzierter hPSCs als auch bei der Zelldifferenzierung verwendet wurde. Darüber hinaus wurden hPSCs auf embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF-Feederzellen) aufrechterhalten. Wir verwendeten dieses Protokoll und PSCs von Patienten mit FD, um die Störung23zu modellieren. Im Jahr 2019 haben wir eine detailliertere Version dieses älteren Protokolls24beschrieben. Zusammenfassend wurde das neuronale Schicksal durch die doppelte SMAD-Hemmung25 induziert, um die TGF-- und BMP-Signalisierung in den ersten 2 Tagen zu blockieren. Die WNT-Aktivierung mit CHIR99021 förderte neuronale Vorläufer zu NC-Zellen. Am 11. Tag wurden die Zellen nach FACS für CD49D+ oder SOX10+ Populationen26,23sortiert, was zu einer Effizienz von etwa 40 % NC-Erzeugung führte. Daher war eine Sortierung erforderlich, um die Effizienz und Reinheit für die nächsten Differenzierungsschritte zu gewährleisten. Die NCCs wurden mit der kombinierten Behandlung von FGF2 und CHIR als Sphäroide aufrechterhalten und verstärkt. Nach 4 Tagen wurden die NC-Sphäroide der Wartung plattiert und mit BDNF, GDNF und NGF versorgt, um die SymN-Reifung zu beenden. Obwohl diese SymNs starke SymN-Marker wie ASCL1, TH, DBH und PHOX2A exprimierten, waren Marker für reifere SymNs, einschließlich der Expression des Nicotinacetylcholin-Rezeptors (CHRNA3/CHRNB4) und des Vesikeltransporters (VMAT1/2), auch nach 70 Tagen Differenzierung niedrig. HOX-Gene in diesem Protokoll wurden nicht formal getestet, und reife neuronale Eigenschaften, einschließlich der elektrophysiologischen Aktivität der Zellen, wurden nicht überprüft.

Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll zur Generierung von SymNs vor (Abbildung 1B). HPSCs werden unter feederfreien Bedingungen auf vitronectin (VTN)-beschichteten Gerichten mit Essential 8 (E8) Medien27gehalten. Die Formel der Differenzierungsmedien wurde in jeder Phase geändert, wodurch der Prozentsatz der NC-Bevölkerungum 28erhöht wurde. Die SymN-Reifung kann auf CD49D+/SOX10+ sortierten oder unsortierten Massen-NCC-Populationen durchgeführt werden. Beide zeigen eine hohe SymN-Marker-Expression am 30. Tag. Darüber hinaus reagieren die mit diesem Protokoll erzeugten SymNs auf elektrophysiologische Aufzeichnungen und Auflagen mit SymN-Aktivator- und Inhibitorverbindungen.

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Protokoll

HINWEIS: Die H9 PHOX2B:GFP Reporterlinie wurde von Oh et al.19zur Verfügung gestellt. Einige qPCR Primer, die in diesem Papier verwendet werden, wurden von OriGene Technologies bezogen, während einige Sequenzen von Frith et al.20,30erhalten werden.

1. Aufbau für Schalenbeschichtung, Medienaufbereitung und hPSC-Wartung

  1. Tellerbeschichtung
    1. Vitronectin (VTN) Beschichtung
      1. Fläschchen VTN in ein 37 °C-Wasserbad geben, bis es vollständig aufgetaut ist, dann gründlich mischen.
      2. Für eine 100 mm Petrischale 7 ml 1x Phosphat gepufferte Saline (PBS) mit 0,5 mg/ml VTN mischen, VTN-Lösung in die Schale geben und bei Raumtemperatur (RT) 1 h brüten.
    2. Kellermembran-Matrixbeschichtung
      1. Durchstechflaschen der Kellermembranmatrix (siehe Materialtabelle)über Nacht bei 4 °C auf Eis auftauen.
      2. Für einen Brunnen einer 6-Well-Platte 2 ml DMEM/F12 mit 20 l 100x Kellermembranmatrix mischen, Kellermembran-Matrixlösung in die Schale geben, die Schale mit Paraffinfolie umwickeln und über Nacht in einem sauberen Behälter bei 4 °C aufbewahren. Arbeiten Sie so schnell wie möglich. Beschichtete Gerichte können in 4 °C für bis zu 2 Wochen gelagert werden.
    3. Polyornithin (PO)/Laminin (LM)/Fibronectin (FN) Beschichtung
      1. Am ersten Tag, für einen Brunnen einer 24-Well-Platte, mischen Sie 15 g/ml PO mit 1 ml 1x PBS, inkubieren bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht. Sowohl LM als auch FN über Nacht bei -20 °C auftauen und bei 4 °C lagern, bis sie vollständig aufgetaut sind.
      2. Am zweiten Tag, Aspirat-PO-Lösung, waschen Sie die Brunnen 2x mit 1x PBS, fügen Sie 1 ml 1x PBS mit 2 g/ml LM und 2 g/ml FN hinzu und inkubieren bei 37 °C in 5%CO2 über Nacht. An dieser Stelle kann die Schale mit der LM/FN-Lösung monatelang im Inkubator aufbewahrt werden, solange sie nicht austrocknet. Fügen Sie weitere 1x PBS hinzu, um zu verhindern, dass die Schale austrocknet.
  2. Medienvorbereitung
    1. Bereiten Sie das Essential 8 Medium (E8) vor, indem Sie eine Flasche E8-Ergänzung bei 4 °C über Nacht auftauen. Mischen Sie die Ergänzung mit 500 ml E8 Medium und Antibiotika, wenn nötig.
      HINWEIS: Die E8-Lösung sollte innerhalb von 2 Wochen aufgebraucht sein.
    2. Bereiten Sie das hPSC Gefriermedium vor, indem Sie 90 ml komplettes E8-Medium mit 10 ml DMSO für ein Gesamtvolumen von 100 ml mischen. Filter sterilisieren.
    3. Bereiten Sie den Tag 0 bis Tag 1 Differenzierungsmedium durch Mischen von 100 ml essentielles 6 (E6) Medium mit 10 m SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 und 10 'M Y27632 bei einem Gesamtvolumen von 100 ml vor.
    4. Bereiten Sie den Tag 2 bis Tag 10 Differenzierungsmedium durch Mischen von 100 ml E6 Medium mit 10 m SB und 0,75 m CHIR99021 für ein Gesamtvolumen von 100 ml vor.
    5. Bereiten Sie den Tag 10 bis Tag 14 Sphäroid Medium durch Mischen neurobasalen Medium mit 2 ml B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-Glutamat, 3 M CHIR99021 und 10 ng/mL FGF2 für ein Gesamtvolumen von 100 ml.
    6. Bereiten Sie den Tag 14 bis Tag 28 Medium für Sphäroid langfristige Wartung durch Hinzufügen von 0,5 M frische RA auf den Tag 10 bis Tag 14 Sphäroid Medium für jede Fütterung.
      HINWEIS: RA immer bei -80 °C halten.
    7. Bereiten Sie das SymN-Reifungsmedium vor, indem Sie neurobasales Medium mit 2 ml B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-Glutamat, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 mM Ascorbinsäure und 0,2 mM dbcAMP bei einem Gesamtvolumen von 100 ml mischen. Die Lösung sollte innerhalb von 2 Wochen verwendet werden. Vor jeder Fütterung 0,125 m frische RA hinzufügen. Diese Lösung wird ab Tag 14 (Option 1) oder Tag 28 (Option 2) verwendet.
    8. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, indem Sie DMEM mit 2% FBS, 2 mM L-Glutamat und Antibiotika bei Bedarf für ein Gesamtvolumen von 100 ml mischen.
  3. hPSC Wartung
    1. Auftauen und Halten von hPSCs
      1. Bereiten Sie eine VTN beschichtete 100 mm Schale vor.
      2. Um eine Durchstechflasche mit hPSCs direkt aus flüssigem Stickstoff aufzutauen, legen Sie die Durchstechflasche in ein 37 °C-Wasserbad und schwingen Sie das Rohr vorsichtig im Wasser, bis es auftaut. Übertragen Sie die aufgetauten hPSCs in ein 15 ml-Rohr mit 10 ml 1x PBS und Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
      3. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml E8 Medium in das Rohr. Pipetten Sie ein paar Mal, um das Pellet vollständig wieder aufzuhängen und dann fügen Sie weitere 9 ml E8 Medium, um 10 ml insgesamt zu erreichen.
      4. Aspirieren Sie die VTN-Lösung aus der 100 mm Schale.
      5. Übertragen Sie die hPSCs auf eine 100-mm-Schale, schütteln Sie sanft (nach oben und links rechts, nicht im Kreis), um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig in der Schale verteilt sind
      6. Inkubieren bei 37 °C, in 5%CO2.
      7. Am folgenden Tag alle Medien aspirieren und mit 10 ml E8 füttern.
      8. Füttern Sie diesen Weg jeden Tag für die nächsten 3 bis 4 Tage und bereiten Sie sich dann auf die Trennung vor.
    2. Aufteilen von hPSCs
      HINWEIS: hPSCs am Punkt der Spaltung sollten 80% –90% konfluent sein. Große Kolonien mit glatten und hellen Rändern sollten beobachtet werden. Der Kontakt zwischen den einzelnen Kolonien sollte jedoch vermieden werden(Abbildung 2B, Tag 0 und Abbildung 6B).
      1. Bereiten Sie VTN-beschichtete 100-mm-Gerichte nach Bedarf zu.
      2. Aspirieren Sie den E8 und waschen Sie die Schale, die 1x mit 1x PBS geteilt werden muss.
      3. Aspirieren Sie die 1x PBS und fügen Sie 4 ml von 0,25 M EDTA hinzu. 2 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
        HINWEIS: Die hPSCs sollten als kleine Kolonien geteilt/neu plattiert werden. Behandeln Sie mit EDTA nicht länger als 2 min, um eine Trennung in einzelne Zellen zu verhindern. Die Zellen sollten nach der 2-min-Behandlung noch an der Telleroberfläche befestigt werden.
      4. Aspirieren Sie die EDTA, lösen Sie die Kolonien, indem Sie 10 ml E8-Medium stark auf die Telleroberfläche pfeifen, und sammeln Sie alle Mittel und Zellen in einem 15 ml Rohr.
      5. Mit hPSCs bei 80%–90% Konfluenz, teilen Kolonien um 1:15-1:20. Um z. B. hPSCs um 1:20 in eine 100-mm-Schale aufzuteilen, nehmen Sie 500 L E8/hPSCs Lösung und mischen Sie mit 9,5 ml frischem E8-Medium.
      6. Platte hPSCs in VTN-beschichteten 100 mm Geschirr.
        HINWEIS: Es wird empfohlen, das ideale Split-Verhältnis für jeden Forscher und jede Zelllinie unabhängig zu bestimmen.
    3. Einfrieren von hPSCs
      1. Für eine 100-mm-Schale von hPSCs, die zum Split enden bereit ist, bereiten Sie drei Kryovials und 3,5 ml Gefriermedium vor.
        HINWEIS: Medien und Fläschchen sollten bis zur Verwendung in 4 °C oder auf Eis gehalten werden.
      2. E8 aspirieren und 2x mit 1x PBS waschen.
      3. Aspirieren 1x PBS und fügen Sie 4 ml 0,25 M EDTA, inkubieren für 2 min bei 37 °C, in 5%CO2.
        HINWEIS: hPSCs sollten als kleine Kolonien eingefroren werden, wenn sie geteilt würden. Behandeln Sie die Zellen mit EDTA nicht länger als 2 min, um eine Trennung in einzelne Zellen zu verhindern. Die Zellen sollten nach der 2-min-Behandlung noch auf der Telleroberfläche befestigt werden.
      4. Aspirieren Sie die EDTA, lösen Sie die Kolonien, indem Sie 10 ml 1x PBS stark auf die Oberfläche der Schale pfeifen, und sammeln Sie alle Mittel und Zellen in einem 50 ml Rohr.
      5. Fügen Sie 20 ml 1x PBS und Zentrifuge bei 200 x g für 4 min, um die verbleibende EDTA auszuwaschen.
      6. Den Überstand entsorgen und das Pellet in 3 ml Gefriermedium wieder aufhängen.
      7. Verteilen Sie hPSCs gleichmäßig in die drei Kryovials, jeweils 1 ml.
      8. Bei -80 °C über Nacht in einer kontrollierten Gefrierbox oder einem Styropor-Sandwich aufbewahren, um einen langsamen Temperaturabfall zu gewährleisten, und dann zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank geben.

2. Seeding hPSCs, um die Differenzierung zu starten (Tag 0)

HINWEIS: hPSCs sollten nach der Stabilisierung (d. h. 2–3x nach dem Auftauen) zur Differenzierung bereit sein. Achten Sie darauf, dass die Kolonien gesund sind, mit glatten, glänzenden Kanten und minimaler Differenzierung (Abbildung 2B).

  1. Bereiten Sie Kellermembran Matrix-beschichtete Gerichte (24 gut oder 6 brunnen Gerichte) einen Tag vor Tag 0 nach Bedarf. Bringen Sie die Gerichte zu Beginn der Differenzierung zu RT.
  2. Machen Sie den Tag 0-1 Differenzierung Mittel wie nötig.
  3. Aspirieren Sie den E8 aus dem Konfluent, bereit, hPCSs zu teilen, und waschen Sie die Schale 2x mit 1x PBS.
  4. 7 ml 0,25 M EDTA pro 100 mm Schale hinzufügen, bei 37 °C, 5%CO2für 15 min brüten.
    HINWEIS: An diesem Punkt wird die EDTA-Behandlung verlängert, um sich in einzelne Zellen zu dispergieren.
  5. Pipetten Sie alle hPSCs (sie sollten schwebend sein) und übertragen Sie auf ein 50 ml Rohr. Fügen Sie die gleiche Menge oder mehr von 1x PBS wie EDTA-Lösung hinzu, um die EDTA zu verwässern.
  6. Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
  7. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml des Tages 0:1 Differenzierungsmedium und Pipetten hinzu, um die Zellen zu homogenisieren. Folgen Sie durch Hinzufügen von mehr Medium und dann mischen, um die Zelllösung zu einer Konzentration ideal zu verdünnen, um die Zellen zu zählen.
    HINWEIS: Verdünnen Sie die Zelllösung nicht. Zellen aus einer vollen 100 mm Schale sollten in 5 ml Medium verdünnt werden, um zu beginnen.
  8. Zählen Sie die Zellennummer mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer.
  9. Verdünnen Sie die Zelllösung nach Bedarf, um 125.000Zellen/cm2 in einem geringen Endvolumen zu erreichen (z. B. 2 ml pro Brunnen für eine 6-Well-Schale oder 500 l pro Brunnen für eine 24-Well-Schale).
    HINWEIS: Ein niedriges Volumen hilft den Zellen, sich schneller zu verbinden.
  10. Die gesamte Kellermembranmatrixlösung aus den beschichteten Schalen aspirieren und die Zelllösung in die Brunnen verdecken.
  11. Inkubieren bei 37 °C, in 5%CO2.

3. Neurale Kammzellinduktion (Tag 1 bis Tag 10, Abbildung 2A)

  1. Füttern Sie die Zellen am ersten Tag mit dem Tag 0-1 Differenzierungsmedium (3 ml pro Brunnen für 6 Brunnengerichte und 1 ml pro Brunnen für 24 Brunnengerichte).
  2. Füttern Sie die Zellen am 2. Tag mit dem Tag 2-Tag 10 Differenzierungsmedium (3 ml pro Brunnen für 6 Brunnengerichte und 1 ml pro Brunnen für 24 Brunnengerichte).
  3. Von nun an sollten die Zellen jeden zweiten Tag bis zum 10. Tag gefüttert werden (d.h. der nächste Fütterungstag ist Tag 4).
    ANMERKUNG: Ab Tag 6 sollten NC-Rippen erkannt werden (Abbildung 2B). Um zu überprüfen, ob eine Differenzierung stattfindet, wird empfohlen, eine parallele Differenzierungskultur in kleineren Brunnen (d.h. 24 Brunnen) zu tragen, die für SOX10/AP2a gebeizt und zur Markergenexpression während der Differenzierungszeit verwendet werden können (Abbildung 2B,C).
  4. Wenn Sie Zellen sortieren, fahren Sie mit Abschnitt 4 fort. Fahren Sie andernfalls mit Abschnitt 5 fort.

4. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für neuralen Kammmarker CD49D und Aggregieren von NC-Zellen in Sphäroiden

HINWEIS: Bei der FACS-Sortierung sollten die Proben auf Eis gehalten werden und nach der Färbung bis zur Sortierung nicht dem Licht ausgesetzt werden.

  1. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, wenn die Zellen sortiert sind.
  2. Bereiten Sie Tag 10-14 Sphäroid Medium.
  3. Am 10. Tag das Medium entfernen und 1x mit 1x PBS waschen.
  4. Fügen Sie Dissoziationslösung (siehe Materialtabelle) bei 2 ml pro Brunnen für eine 6 Brunnenschale oder 1 ml pro Brunnen für eine 24-Well-Schale hinzu und bei 37 °C, 5%CO2 für 20 min inkubieren.
  5. Pipetten Sie alle hPSCs ab und übertragen Sie sie in ein 50 ml Rohr.
  6. Füllen Sie den Rest des Rohres mit FACS-Puffer und Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
    HINWEIS: Jedes 50 ml Rohr kann bis zu 20 ml oder weniger Zelllösung aufnehmen. Das Volumen des FACS-Puffers sollte hoch genug sein, um die Dissoziationslösung zu neutralisieren.
  7. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen mit der entsprechenden Menge an FACS-Puffer (ca. 2 ml pro Bohrkörper einer 6-Well-Platte) wieder aus und zählen Sie, um die Zellzahl zu bestimmen.
  8. Bereiten Sie die folgenden Beispiele vor.
    1. Probe 1 (unbefleckte Kontrolle): 1 x 106 Zellen in 400 l FACS-Puffer. Filtern Sie die Zellen durch eine 20-m-Siebkappe und halten Sie die Röhre auf Eis.
    2. Probe 2 (nur DAPI-Steuerung): 1 x 106 Zellen in 400 l FACS-Puffer mit 0,5 ug/ml DAPI. Filtern Sie die Zellen durch ein FACS-Rohr mit einer Siebkappe und halten Sie die Röhre auf Eis.
    3. Probe 3 (CD49d-markiert): Den Rest der Zellen mit FACS-Puffer, der PE/Cy7-konjugierte CD49D-Antikörper enthält (5 x 106 Zellen pro 100 l FACS-Puffer) in einem 15 ml-Rohr aussetzen und 20 min auf Eis brüten.
  9. Füllen Sie die Rohre mit FACS-Puffer und Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
  10. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie alle 5–10 x 106 Zellen in 1 ml FACS-Puffer mit 0,5 ug/ml DAPI gemäß den Anweisungen des Herstellers wieder ab.
  11. Filtern Sie die Zellen mit der Siebkappe durch das FACS-Rohr und halten Sie die Röhre auf Eis.
  12. Bereiten Sie Sammlung FACS Rohre mit 2 ml FACS Puffer.
  13. Sortieren Sie die FACS-Maschine mit Lasern, die DAPI und PE-Cy7 erkennen können, um die CD49D+ Population zu isolieren.
  14. Zählen Sie nach dem Sortieren die sortierten Zellen.
  15. Zentrifugieren Sie alle sortierten Zellen und setzen Sie sich in Tag 10-14 Sphäroidmedium auf eine Endkonzentration von 0,5 x 106 Zellen pro 500 l Medium aus.
  16. Platte 0,5 x 106 Zellen pro Brunnen in ultra-niedrige Befestigung 24 Wellplatten.
  17. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, in 5%CO2.

5. Aggregieren von NC-Zellen in Sphäroiden

  1. Wenn Sie FACS nicht verwenden, um die NC-Zellen zu isolieren und sie stattdessen direkt in Sphäroide zu aggregieren, bereiten Sie zunächst Zellen vor, wie in den Schritten 4.2–4.5 beschrieben.
  2. Füllen Sie den Rest des Rohres mit 1x PBS und Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
  3. Entsorgen Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen mit einer entsprechenden Menge an Tag 10-14 Sphäroidmedium (z. B. 2 ml Medium pro Brunnen für eine 6-Well-Platte) und zählen Sie, um die Zellzahl zu bestimmen.
  4. Verdünnen Sie die Zellen in Tag 10–14 Sphäroid Medium auf 0,5 x 106 Zellen pro 500 l Medium.
  5. Platte 500 l der Zellsuspension pro Brunnen in ultraniedriger Befestigung 24 Wellplatten.
  6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, in 5%CO2.

6. NC-Sphäroid-Wartung und sympathische Vorläuferinduktion (Tag 10 bis Tag 14, Abbildung 4A)

  1. Option 1: Minimale Sphäroidkultur
    1. Fügen Sie am 11. Tag 500 L des Sphäroidmediums 10–14 zu den NC-Sphäroiden hinzu, ohne das vorhandene Medium ab dem 10. Tag zu ansischen. Inkubieren bei 37 °C, in 5%CO2.
    2. Neigen Sie am 12. Tag die Platte, um die NC-Sphäroide auf einer Seite der Brunnen anzusammeln. Sorgfältig aspirieren und entsorgen Sie so viel Medium wie möglich, und füttern Sie mit 1 ml Tag 10-14 Sphäroid Medium.
    3. Füttern Sie die Zellen täglich bis zum 14. Tag.
    4. Optional: Wenn die Sphäroide aggregieren und einen großen Klumpen erzeugen, verwenden Sie eine Pipette, um die Sphäroidklumpen aufzubrechen. Dadurch wird auch sichergestellt, dass einzelne Sphäroide nicht zu groß werden.
      HINWEIS: Der ideale Sphäroid-Größenbereich sollte etwa 100–500 m betragen. Innerhalb dieses Bereichs ist die Größe der einzelnen Sphäroide nicht entscheidend. Die Morphologie, z. B. glatte und klare Kanten (Abbildung 3 und Abbildung 6), ist jedoch wichtig für den weiteren Erfolg. An Tag 14 enthält jede 24-Well-Platte idealerweise etwa 50–60 Sphäroide unterschiedlicher Größe innerhalb des oben genannten Größenbereichs.
  2. Option 2: Erweiterte Sphäroidkultur
    1. Am 15. Tag, um NC-Sphäroide zu halten, füttern Sie mit 1,5 ml Tag 10–14 Sphäroid Medium mit 0,5 M RA. Inkubieren bei 37 °C, 5%CO2.
      HINWEIS: RA sollte für jede Fütterung frisch zugegeben und immer bei -80 °C gelagert werden.
    2. Von nun an jeden zweiten Tag bis zum 28. Tag füttern und dann mit der Beschichtung der Sphäroide fortfahren (Abschnitt 7.1).
      HINWEIS: Die wachsenden Sphäroide werden etwa 1x pro Woche geteilt, indem sie mit einer 1 ml Pipette pipetiert werden, um sie aufzubrechen. Sie werden mit einem ungefähren Verhältnis von 1:2-1:4 aufgeteilt. Innerhalb der zweiwöchigen Expansionsphase sollten sich die Zellen in etwa vervierfachen.

7. SymN-Differenzierung und -Reifung (Option 1: nach Tag 14; Option 2: nach Tag 28)

  1. Plating Sphäroide in regulären Gerichten
    1. Bereiten Sie PO/LM/FM-beschichtete 24 Wellplatten vor.
    2. Bereiten Sie symN-Medium mit 0,125 M RA (frisches Futter hinzufügen) und 10 M Y27632 (nur Tag 14) vor.
    3. Neigen Sie die Platte am 14. Tag, um NC-Sphäroide auf einer Seite der Brunnen anzusammeln. Sorgfältig aspirieren und entsorgen Sie so viel Medium wie möglich, und füttern Sie mit 1 ml symN Medium.
    4. Entfernen Sie LM/FN von den beschichteten Platten.
    5. Jeweils gut aus der 24 Brunnenplatte in 4 separate Brunnen der neuen, beschichteten 24-Well-Platte aufteilen und verschichten. Jeder Originalbrunnen hat 1 ml, der 50 bis 60 Sphäroide enthält. Daraus ergeben sich 250 L, die ca. 10–15 Sphäroide für jeden Brunnen auf der neuen Platte enthalten.
    6. Fügen Sie 250 l zusätzliches Medium pro Brunnen hinzu.
      HINWEIS: Dies ist eine Aufteilung von 1:4; Stellen Sie sicher, dass die Sphäroide innerhalb der Lösung richtig verteilt sind, sodass die Teilung relativ gleichmäßig ist. Die Anzahl der Sphäroide wird nicht gezählt, da die endgültige Zahl den Erfolg der Generierung von SymNs nicht beeinflusst.
    7. Inkubieren bei 37 °C, 5%CO2.
    8. Am 15. Tag (oder Tag 29 für Option 2) wird das gesamte Medium durch 1 ml SymN-Medium ersetzt, das 0,125 M RA enthält. Von nun an sollten die Neuronen alle 2 Tage bis zum Tag 20 (oder Tag 35 für Option 2) gefüttert werden.
    9. Nach Tag 20 (oder Tag 35 für Option 2) sollten die Neuronen gefüttert werden, indem nur die Hälfte des vorhandenen Mediums (500 l) sorgfältig ersetzt wird. Von nun an jede Woche füttern, es sei denn, das Medium wird schnell gelb.
    10. Füttern Sie wöchentlich bis zum gewünschten Zeitpunkt.
      HINWEIS: SymNs neigen dazu, sich in ganglia-ähnlichen Strukturen zu aggregieren und neigen dazu, sich von den Kulturgerichten zu lösen. Um dies zu verhindern, wird eine Halbfütterung und minimale Handhabung empfohlen.
  2. Beschichtungszellen für elektrophysiologische Aufzeichnung
    1. Bereiten Po/LM/FM-beschichtete 96 Brunnenelektrophysiologieplatten vor.
    2. Bereiten Sie symN-Medium mit 0,125 M RA (frisches Futter hinzufügen) und 10 M Y27632 (nur Tag 14) vor.
    3. Sammeln Sie am 14. Tag alle Sphäroide, zentrieren Sie sie dann bei 200 x g für 4 min.
    4. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml Dissoziationslösung hinzu und übertragen Sie das Gemisch zurück in einen der Brunnen der ultra-niedrigen Befestigungsplatte. Bei 37 °C inkubieren, in 5% CO2 für 20–45 min.
      HINWEIS: Abhängig von der Größe der Sphäroide kann die Dissoziationsdauer länger als 20 min sein. Überprüfen Sie die Trennung der Zelle alle 10 min bis zu 45 min. Optional können 0,1 mg/ml DNase mit Dissoziationslösung hinzugefügt werden, um freie DNA von abgestorbenen Zellen zu verhindern, die die Lösung klebrig machen. Dies ist in diesem Protokoll optional, da die Sphäroide nicht aggregiert werden, sobald sie vollständig getrennt sind.
    5. Pipette, um die Sphäroide vollständig zu dissoziieren, dann Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
    6. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen mit der entsprechenden Menge an symN-Medium wieder aus, und zählen Sie die Zellenzahl.
    7. Die Zellen mit 100.000/cm2 in PO/LM/FN-beschichteten Elektrophysiologiebrunnen in 200 l Gesamtvolumen pro Brunnen verschichten.
    8. Folgen Sie am 15. Tag (oder Tag 29 für Option 2) den gleichen Fütterungsprozessen wie in Abschnitt 7.1. Das Gesamtvolumen nach Tag 15 (oder Tag 29 für Option 2) sollte 300 l pro Brunnen betragen.
    9. Messen Sie die elektrischen Signale mit einer Multielektroden-Array-Maschine nach Tag 20 (oder Tag 35 für Option 2).
      HINWEIS: In Option 2 können Sphäroide jederzeit zwischen dem 14. Tag 28 plattiert werden. Die ersten elektrischen Signalmessungen können 1 Woche nach der Beschichtung der Sphäroide durchgeführt werden.

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Ergebnisse

In diesem Protokoll geben wir Anweisungen, wie man SymNs von hPSCs generiert. Die hier gezeigten Kulturbedingungen wurden von einem früheren veröffentlichten Protokoll23,24 (Abbildung 1A) zu feederfreien und chemisch definierten Bedingungen ( Abbildung1B) verbessert. Es werden zwei Optionen angeboten, eine, bei der SymNs innerhalb von 20 Tagen hergestellt werden, und eine andere, in der die NCCs für 2 Wo...

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Diskussion

Wir haben vor kurzem zwei Rezensionen veröffentlicht, eine, die die Verwendung von hPSC-abgeleiteten SymNs für die Krankheitsmodellierung31 sowie einen eingehenden Vergleich der verfügbaren Differenzierungsprotokolle22diskutiert. Daher konzentrieren wir uns hier auf die Fehlerbehebung des aktuellen Protokolls, um dem interessierten Forscher zu helfen, SymNs zu erstellen. Während des gesamten Differenzierungsprozesses sollte die Kontamination in allen Stadien sorgfältig kont...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Heidi Ulrichs für die kritische Lektüre und Bearbeitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
100 mm ZellkulturschalenFalcon353003
15 mL konische GewebekulturröhrchenVWR/Corning89039-664
24-Well-GewebekulturplattenFalcon353047
24-Well-Platten mit extrem niedrigem AufsatzCorning07 200 601 und 07 200 602
5 % CO2/20 % O2 Gewebekultur-InkubatorThermo Fisher/Life TechnologienHeracell VIOS 160i
50 ml konische GewebekulturröhrchenVWR/Corning89039-656
6-Well-GewebekulturplattenCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500Zelldissoziationslösung
Anti-AP2a-AntikörperAbcamab108311Wirt: Kaninchen; Verdünnung
1:400Anti-Ascl1-AntikörperBD Pharmingen556604Wirt: Maus IgG1; 1:200 Verdünnung
Anti-CD49D AntikörperBioLegend304313Wirt: Maus IgG1; 5 μ l/Mio. Zellen in 100 μm; l Volumen
Anti-CD49D-Antikörper (Isotyp)BioLegend400125Wirt: Maus IgG1; 5 μ l/Mio. Zellen in 100 μm; l Volumen
DAPI-FarbstoffSigmaD95421:1000 Verdünnung
Anti-DBH AntikörperImmunostar22806Wirt: Kaninchen; 1:500 Verdünnung
Anti-GFP AntikörperAbcamab13970Wirt: Huhn; 1:1000 Verdünnung
Anti-HOXC9 AntikörperAbcamab50839Wirt: Maus; 1:100 Verdünnung
Anti-NET1 AntikörperMabNET17-1Wirt: Maus; 1:1000 Verdünnung
Anti-PRPH AntikörperSanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Wirt: Maus IgG2a; 1:200 Verdünnung
Anti-SOX10 AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-365692Wirt: Maus IgG1; 1:100 Verdünnung
Anti-TH AntikörperPel-FreezP40101-150Wirt: Kaninchen; 1:500 Verdünnung
AscorbinsäureSigmaA8960-5GBestandskonzentration: 100 mM
B27 ErgänzungThermo Fisher/Life Technologies12587-010Lagerkonzentration: 50x
BDNFR& D Systems248-BDBestandskonzentration: 10 μ g/mL
BMP4R& D Systems314-BPStammkonzentration: 6 mM
ZellzählerThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
ZellzählkammerObjektträger InvitrogenC10312
ZentrifugeEppendorf57021& 5424R
CHIR99021R& D Systems4423Stammkonzentration: 6 mM
Kryo-FläschchenThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Stammkonzentration: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Stammkonzentration: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Stammkonzentration: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 mediumgibcoA15165-01
E8 mediumgibcoA15169-01Bestandskonzentration: 1x
E8 ErgänzunggibcoA15171-01Stammkonzentration: 50x
EDTASigmaED2SSStammkonzentration: 0,5 M
Elektrophysiologische Platten (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS-MaschineBeckman CoulterCytoFLEX (für FACS)
FACS-MaschineBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (zum Sortieren)
FACS-Röhrchen (blaue Filterkappe)Falcon352235
FACS-Röhrchen (weiße Kappe)Falcon352063
Fötales Rinderserum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Bestandskonzentration: 10 μ g/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Basalmembran-Matrix; Stammkonzentration: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Humanes Fibronektin (FN)VWR/Corning47743-654Stammkonzentration: 1 mg/mL
L-GlutaminThermo Fisher/Gibco25030-081Stammkonzentration: 200 mM
LN-TankKundenspezifische biogene SystemeV-1500AB
MEA LesegerätAxion BioSystemsMaestro Pro
Maus Laminin I (LM)R& D Systems3400-010-01Stammkonzentration: 1 mg/mL
N2-ZusatzThermo Fisher/Life Technologies17502-048Stammkonzentration: 100x
Neurobasales Mediumgibco21103-049Stammkonzentration: 1x
NGFPeproTech450-01Stammkonzentration: 25 μ g/mL
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco14190-136Stammkonzentration: 1x
Poly-L-Ornithinhydrobromid (PO)SigmaP3655Stammkonzentration: 15 mg/mL
Primocin (Antibiotika)InvivoGenANTPM1Stammkonzentration: 50 mg/mL
qPCR-GerätBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR-PlattenBio-Rad LaboratoriesHSP9601
rekombinante FGF2R& D Systems233-FB/CFBestandskonzentration: 10 μ g/mL
RetinsäureSigmaR2625Stammkonzentration: 1 mM
SB431542Tocris/R& D Systems1614Stammkonzentration: 10 mM
TrypanblauCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Stammkonzentration: 0,5 mg/mL
WasserbadVWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254Bestandskonzentration: 10 mM

Referenzen

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Differenzierung sympathischer NeuronenFeederfreie Kulturchemisch definierte BedingungenNeuralleistenmarkerelektrophysiologische AbleitungRetins urebehandlungExpansion der Spheroid Kulturautonomes Nervensystem

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