Method Article

Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Protokoll beschreiben wir eine stabile, hocheffiziente Differenzierungsstrategie für die Erzeugung postganglionischer sympathischer Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Dieses Modell wird Neuronen für die Verwendung von Studien zu multiplen autonomen Störungen zur Verfügung stellen.

Abstract

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Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) sind zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung und die Untersuchung der menschlichen embryonalen Entwicklung in vitro geworden. Zuvor haben wir ein Differenzierungsprotokoll zur Ableitung autonomer Neuronen mit sympathischem Charakter vorgelegt, das auf Patienten mit autonomer Neuropathie angewendet wurde. Das Protokoll wurde jedoch auf Knock Out Serum Replacement (KSR) und Feeder-basierten Kulturbedingungen aufgebaut, und um eine hohe Differenzierungseffizienz zu gewährleisten, war eine Zellsortierung erforderlich. Diese Faktoren verursachen eine hohe Variabilität, hohe Kosten und geringe Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus wurden reife sympathische Eigenschaften, einschließlich elektrischer Aktivität, nicht überprüft. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll, in dem PSC-Kultur und Differenzierung unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen durchgeführt werden. Genetische Marker, die den neuronalen Kamm des Stammes identifizieren, werden identifiziert. Eine weitere Differenzierung in postganglionische sympathische Neuronen wird nach 20 Tagen ohne Zellsortierung erreicht. Die elektrophysiologische Aufzeichnung zeigt die funktionelle Neuronenidentität weiter. Das aus unseren differenzierten Neuronen nachgewiesene Feuer kann durch Nikotin verstärkt und durch den adrenergen Rezeptor-Antagonisten Propranolol unterdrückt werden. Zwischensympathische neuronale Vorläufer in diesem Protokoll können als neuronale Sphäroide für bis zu 2 Wochen aufrechterhalten werden, was eine Erweiterung der Kulturen ermöglicht. Zusammenfassend zeigt unser aktualisiertes sympathisches Neuronendifferenzierungsprotokoll eine hohe Differenzierungseffizienz, eine bessere Reproduzierbarkeit, mehr Flexibilität und eine bessere neuronale Reifung im Vergleich zur vorherigen Version. Dieses Protokoll wird Forschern die Zellen zur Verfügung stellen, die notwendig sind, um menschliche Störungen zu untersuchen, die das autonome Nervensystem beeinflussen.

Introduction

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Postganglionische sympathische Neuronen (SymNs) gehören zum autonomen Nervensystem (ANS) und haben mehrere wichtige Rollen bei der Reaktion und Regulierung der Homöostase des Körpers unabhängig vom Bewusstsein. Zum Beispiel stimuliert Stress SymNs und ruft die Kampf-oder-Flug-Reaktion hervor, die zu einer Erhöhung der Herzfrequenz, des Blutdrucks und des Schwitzens führt. SymNs sind bei mehreren menschlichen Störungen aufgrund von Genetik, Toxizität/Verletzung oder als Begleiter zu anderen Krankheiten betroffen. Ein Beispiel für eine genetische Neuropathie ist die Kindheitsstörung Familiäre Dysautonomie (FD), bei der eine schwere Dysregulation von SymNs eine dysautono....

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Protocol

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HINWEIS: Die H9 PHOX2B:GFP Reporterlinie wurde von Oh et al.19zur Verfügung gestellt. Einige qPCR Primer, die in diesem Papier verwendet werden, wurden von OriGene Technologies bezogen, während einige Sequenzen von Frith et al.20,30erhalten werden.

1. Aufbau für Schalenbeschichtung, Medienaufbereitung und hPSC-Wartung

  1. Tellerbeschichtung
    1. Vitronectin (VTN) Beschichtung
      1. Fläschchen VTN in ein 37 °C-Wasserbad geben, bis es vollständig aufgetaut ist, dann gründlich mischen.
      2. Für eine 100 mm Petrischale 7 ml ....

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Results

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In diesem Protokoll geben wir Anweisungen, wie man SymNs von hPSCs generiert. Die hier gezeigten Kulturbedingungen wurden von einem früheren veröffentlichten Protokoll23,24 (Abbildung 1A) zu feederfreien und chemisch definierten Bedingungen ( Abbildung1B) verbessert. Es werden zwei Optionen angeboten, eine, bei der SymNs innerhalb von 20 Tagen hergestellt werden, und eine andere, in der die NCCs für 2 Wo.......

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Discussion

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Wir haben vor kurzem zwei Rezensionen veröffentlicht, eine, die die Verwendung von hPSC-abgeleiteten SymNs für die Krankheitsmodellierung31 sowie einen eingehenden Vergleich der verfügbaren Differenzierungsprotokolle22diskutiert. Daher konzentrieren wir uns hier auf die Fehlerbehebung des aktuellen Protokolls, um dem interessierten Forscher zu helfen, SymNs zu erstellen. Während des gesamten Differenzierungsprozesses sollte die Kontamination in allen Stadien sorgfältig kont.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgements

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Wir danken Heidi Ulrichs für die kritische Lektüre und Bearbeitung des Manuskripts.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm ZellkulturschalenFalcon353003
15 mL konische GewebekulturröhrchenVWR/Corning89039-664
24-Well-GewebekulturplattenFalcon353047
24-Well-Platten mit extrem niedrigem AufsatzCorning07 200 601 und 07 200 602
5 % CO2/20 % O2 Gewebekultur-InkubatorThermo Fisher/Life TechnologienHeracell VIOS 160i
50 ml konische GewebekulturröhrchenVWR/Corning89039-656
6-Well-GewebekulturplattenCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500Zelldissoziationslösung
Anti-AP2a-AntikörperAbcamab108311Wirt: Kaninchen; Verdünnung
1:400Anti-Ascl1-AntikörperBD Pharmingen556604Wirt: Maus IgG1; 1:200 Verdünnung
Anti-CD49D AntikörperBioLegend304313Wirt: Maus IgG1; 5 μ l/Mio. Zellen in 100 μm; l Volumen
Anti-CD49D-Antikörper (Isotyp)BioLegend400125Wirt: Maus IgG1; 5 μ l/Mio. Zellen in 100 μm; l Volumen
DAPI-FarbstoffSigmaD95421:1000 Verdünnung
Anti-DBH AntikörperImmunostar22806Wirt: Kaninchen; 1:500 Verdünnung
Anti-GFP AntikörperAbcamab13970Wirt: Huhn; 1:1000 Verdünnung
Anti-HOXC9 AntikörperAbcamab50839Wirt: Maus; 1:100 Verdünnung
Anti-NET1 AntikörperMabNET17-1Wirt: Maus; 1:1000 Verdünnung
Anti-PRPH AntikörperSanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Wirt: Maus IgG2a; 1:200 Verdünnung
Anti-SOX10 AntikörperSanta Cruz Biotechnologysc-365692Wirt: Maus IgG1; 1:100 Verdünnung
Anti-TH AntikörperPel-FreezP40101-150Wirt: Kaninchen; 1:500 Verdünnung
AscorbinsäureSigmaA8960-5GBestandskonzentration: 100 mM
B27 ErgänzungThermo Fisher/Life Technologies12587-010Lagerkonzentration: 50x
BDNFR& D Systems248-BDBestandskonzentration: 10 μ g/mL
BMP4R& D Systems314-BPStammkonzentration: 6 mM
ZellzählerThermo Fisher/Life TechnologiesCountess II
ZellzählkammerObjektträger InvitrogenC10312
ZentrifugeEppendorf57021& 5424R
CHIR99021R& D Systems4423Stammkonzentration: 6 mM
Kryo-FläschchenThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Stammkonzentration: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Stammkonzentration: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Stammkonzentration: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 mediumgibcoA15165-01
E8 mediumgibcoA15169-01Bestandskonzentration: 1x
E8 ErgänzunggibcoA15171-01Stammkonzentration: 50x
EDTASigmaED2SSStammkonzentration: 0,5 M
Elektrophysiologische Platten (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACS-MaschineBeckman CoulterCytoFLEX (für FACS)
FACS-MaschineBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (zum Sortieren)
FACS-Röhrchen (blaue Filterkappe)Falcon352235
FACS-Röhrchen (weiße Kappe)Falcon352063
Fötales Rinderserum (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Bestandskonzentration: 10 μ g/mL
GeltrexInvitrogenA1413202Basalmembran-Matrix; Stammkonzentration: 100x
hPSCsThomson et al., (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Humanes Fibronektin (FN)VWR/Corning47743-654Stammkonzentration: 1 mg/mL
L-GlutaminThermo Fisher/Gibco25030-081Stammkonzentration: 200 mM
LN-TankKundenspezifische biogene SystemeV-1500AB
MEA LesegerätAxion BioSystemsMaestro Pro
Maus Laminin I (LM)R& D Systems3400-010-01Stammkonzentration: 1 mg/mL
N2-ZusatzThermo Fisher/Life Technologies17502-048Stammkonzentration: 100x
Neurobasales Mediumgibco21103-049Stammkonzentration: 1x
NGFPeproTech450-01Stammkonzentration: 25 μ g/mL
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco14190-136Stammkonzentration: 1x
Poly-L-Ornithinhydrobromid (PO)SigmaP3655Stammkonzentration: 15 mg/mL
Primocin (Antibiotika)InvivoGenANTPM1Stammkonzentration: 50 mg/mL
qPCR-GerätBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCR-PlattenBio-Rad LaboratoriesHSP9601
rekombinante FGF2R& D Systems233-FB/CFBestandskonzentration: 10 μ g/mL
RetinsäureSigmaR2625Stammkonzentration: 1 mM
SB431542Tocris/R& D Systems1614Stammkonzentration: 10 mM
TrypanblauCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Stammkonzentration: 0,5 mg/mL
WasserbadVWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254Bestandskonzentration: 10 mM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-ind....

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Human Pluripotent Stem CellsSympathetic Neuron DifferentiationFeeder free CultureChemically Defined ConditionsNeural Crest MarkersElectrophysiological RecordingRetinoic Acid TreatmentSpheroid Culture ExpansionPostganglionic Sympathetic NeuronsAutonomic Nervous System

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