Das Ziel dieses Artikels ist es, eine verfeinerte Methode der Intubation der Labormaus zu beschreiben. Die Methode ist nichtinvasiv und daher ideal für Studien, die eine serielle Überwachung der Atemfunktion und/oder die Instillation von Behandlungen in die Lunge erfordern.
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Methodenartikel
Wiederholte orotracheale Intubation bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Literatur beschreibt mehrere Methoden zur Mausintubation, die entweder eine Visualisierung der Glottis durch die Mundhöhle oder einen Schnitt im Ventralhals zur direkten Bestätigung der Kanülenplatzierung in der Luftröhre erfordern. Die relative Schwierigkeit oder das Gewebetrauma, das durch solche Verfahren zum Thema induziert wird, kann ein Hindernis für die Fähigkeit eines Prüfers sein, Längsschnittstudien durchzuführen. Dieser Artikel veranschaulicht eine Technik, bei der die physische Manipulation der Maus nach der Verwendung eines Enthaarungsmittels, um Haare aus dem ventralen Hals zu entfernen, eine transkutane Visualisierung der Luftröhre für orotracheale Intubation unabhängig vom Grad der Haut ermöglicht Pigmentierung. Diese Methode ist harmlos für das Thema und leicht mit einem begrenzten Verständnis der murinen Anatomie erreicht. Dieser verfeinerte Ansatz erleichtert die wiederholte Intubation, die für die Überwachung des Fortschreitens der Krankheit oder die Instillation von Behandlungen erforderlich sein kann. Die Verwendung dieser Methode kann zu einer Verringerung der Anzahl der Tiere und der technischen Fähigkeiten führen, die erforderlich sind, um die Lungenfunktion in Mausmodellen von Atemwegserkrankungen zu messen.
Einleitung
Die Labormaus ist ein gängiges Tiermodell für menschliche Atemwegserkrankungen. So gibt es mehrere veröffentlichte Methoden für die Mausintubation zum Zwecke der Instillation von Behandlungen und Messung der Atemmechanik. Die meisten der beschriebenen Verfahren erfordern die Visualisierung der Glottis durch die Mundhöhle mit speziellen Geräten wie einem Laryngoskop oder einer lichtoptischen Lichtquelle1,2,3,4,5,6,7., Dies kann jedoch schwierig sein, wenn eine relativ große Kanüle benötigt wird, da sie die Sicht des Forschers verschleiern kann. Limjunyawong et al.8 haben dieses Anliegen mit einer Intubationsmethode angesprochen, bei der ein kleiner hautförmiger Schnitt entlang der Mittellinie des ventralen Halses gemacht wird, der eine Visualisierung der Luftröhre ermöglicht. Nach dem Eingriff wird der Schnitt mit Gewebekleber geschlossen.
Für Studien, die häufige wiederholte Intubationen erfordern, erfordert das sukzessive Einschneiden und Schließen dieser Stelle eine Debridementierung der Hautränder und gewebetrauma am ventralen Hals. Der Zweck des transkutanen Trachealvisualisierungsansatzes zur oralen Intubation ist es, eine raffinierte, nichtinvasive Technik zu liefern, die speziell für wiederholte Intubationsstudien sowie einzelne Intubationsereignisse bei Mäusen geeignet ist.
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Protokoll
Alle hier beschriebenen tierischen Aktivitäten wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Ohio State University genehmigt und in AAALAC-akkreditierten Einrichtungen durchgeführt.
1. Verfahrensvorbereitung
- Konstruieren Sie die Intubationsplattform. Um die entsprechende Plattformneigung zu erreichen, verwenden Sie einen 3-Ring-Binder (7,6 cm). Falten Sie eine 15 x 20 cm Länge von 3-0 Seide oder anderen Fadenmaterial in der Hälfte und halten Sie die Enden des Gewindes an der Oberseite der geneigten Plattform mit Klebeband, um eine Suspensionsschleife zu erstellen (Abbildung 1).
- Wählen Sie eine Kanüle der entsprechenden Größe und Länge aus.
HINWEIS: Für eine 20-30 g-Maus kann ein 2,5-zoll-3,8 cm langer Katheter bis 18 G verwendet werden. Für diese Studie wurden 18 Wochen alte weibliche BALB/c- und 10-wöchige C57BL/6-Mäuse (n = 3 von jedem Stamm) verwendet. Eine undurchsichtige weiße Katheterhülle bietet die beste transkutane Visualisierung. - Schneiden Sie eine Abschrägung an der distalen Spitze des Katheters und glätten Sie die schnittoberfläche mit Schleifpapier, um eine abgerundete Abschrägungsspitze zu schaffen. Erstellen Sie vorsichtig eine leichte Biegung in der Kanüle ca. 1 cm von der Abschrägung (Abbildung 2).
HINWEIS: Für jede Maus sollte ein neuer Katheter verwendet werden. - Anästhetisieren Sie die Maus mit Ketamin (5,4 mg/g Körpergewicht) und Xylazin (16 g/g Körpergewicht) intraperitoneal verabreicht. Tragen Sie sterile ophthalimische Salbe auf die Augen auf.
HINWEIS: Die richtige Anästhesietiefe wird durch mangelnde Reaktion der Maus auf eine feste Zehenklemme erreicht. - Halten Sie die Maus in einer Supine-Position auf der Intubationsplattform auf, indem Sie die oberen Schneidezähne um das Seidenfaden an der Oberseite der abgewinkelten Oberfläche hängen (Abbildung 3). Sobald die Maus quadratisch in dorsaler Rekonnkrüsung positioniert ist, greifen Sie vorsichtig die Basis des Schwanzes und ziehen Sie den Schwanz in Richtung des Tisches zurück. Legen Sie ein Stück Klebeband über die Basis des Schwanzes, um die Maus zu sichern.
- Tragen Sie enthaarte Creme (Tabelle der Materialien) auf die ventrale Zervixregion für 30-45 s dann entfernen Sie alle Enthaarungscreme aus dem Zervixbereich mit einer trockenen Gaze. Wiederholen Sie den Bewerbungsprozess bei Bedarf. Spülen Sie die Haut gründlich mit Salzoder destilliertem Wasser ab, um Rückstände zu entfernen und dann trocken zu wischen.
2. Intubationsverfahren
- Verwenden Sie gerade, flache Zangen in der nicht dominanten Hand, um die Zunge sanft in einer Weise zurückzuziehen, die den Mund für die Einführung der Kanüle ausreichend öffnet.
HINWEIS: Rattenzahnzange sollte nicht verwendet werden, da dies die Zunge schädigt. - Mit der dominanten Hand, die Kanüle in den Mund so vorrücken, dass das Ende, das distal zur leichten Biegung ist, gegen das Dach des Mundes des Subjekts ist.
- Lösen Sie die Zunge und schieben Sie die flache Kante der geschlossenen Zange kauend entlang des ventralen Halses, bis das Manubrium erreicht ist. Diese Bewegung verdrängt seitlich die Speicheldrüsen und flacht den Muskel, der die Luftröhre bedeckt. Die Luftröhre erscheint transkutan als weiße Linie (Abbildung 3A). Drehen Sie bei Bedarf die Zange in craniodorsal-Richtung, während Sie die Spannung auf der Haut in kaudaler Richtung aufrechterhalten, um die seitlich verschobenen Speicheldrüsen zum Höhepunkt zu bringen. Dieses Manöver erzeugt mehr Kontrast um die Luftröhre (Abbildung 3B).
HINWEIS: Vermeiden Sie übermäßige Kraft auf den ventralen Hals, da es die Luftröhre kollabieren und die Atmung beeinträchtigen kann. - Fördern Sie die Kanüle und angeln Sie gleichzeitig die distale Spitze der Kanüle durch Supination der dominanten Hand bei gleichzeitiger Beugung des Handgelenks.
- Die richtige Platzierung der Kanüle wird durch Visualisierung der opaken Kanüle in der Luftröhre angezeigt (Abbildung 4B,D). Wenn die Kanüle über das Niveau des Ursprungs des Masseermuskels hinaus fortgeschritten ist und die Visualisierung der Kanüle in der Luftröhre nicht bestätigt wurde, ziehen Sie die Kanüle zurück und versuchen Sie es erneut.
- Bestätigen Sie die richtige Kanülenplatzierung, indem Sie eine Lungeninflationslampe an die Kanüle anschließen und die Brustvergrößerung mit gleichzeitiger Depression des Geräts beobachten.
- Ohne die Kanüle zu verdrängen, die Schneidezähne der Maus vorsichtig von der Intubationsplattform zu lösen. Bewegen Sie die Maus auf eine horizontale Plattform (Materialtabelle) und legen Sie die Kanüle an den Adapter am Beatmungsgerät ein. Nach der tiefen Inflation, belüften Sie die Maus für 60 s dann Atemwiderstand messen.
3. Wiederherstellung
- Sobald der Vorgang abgeschlossen ist, bewegen Sie die Maus auf eine erwärmte Plattform. Bieten Sie eine konstante Stimulation durch leichte Zehen- oder Schwanzkneifen, um die spontane Atmung zu fördern.
- Extubation kann auftreten, wenn die Maus gerade beginnt zu kauen. Greifen Sie die Kanüle auf Höhe der Nabe und ziehen Sie die Röhre vorsichtig kranially und weg von der Maus, bis die Kanüle vollständig aus dem Mund des Subjekts entfernt ist.
HINWEIS: Es ist vorzuziehen, die Atemwegsunterstützung mit der starren Kanüle so lange wie möglich während des Rückgewinnungsprozesses zu gewährleisten. - Einmal extubiert, übertragen Sie die Maus in einen sauberen Rückgewinnungskäfig mit Wärmeunterstützung. Überwachen Sie die Maus kontinuierlich, bis sie vollständig ambulant ist und die Wiederherstellung abgeschlossen ist.
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Ergebnisse
Serielle Überwachung der Basispulmonalenfunktion
Achtzehn Wochen alte weibliche BALB/c- und 10-wochen-alte C57BL/6-Mäuse (n = 3 von jedem Stamm) wurden mit der beschriebenen Methode am Tag 0, 3, 10 und 17 intubiert. Nach der Intubation an jedem Tag wurde das Motiv mit einem mechanischen Ventilator verbunden, der mit 100% Sauerstoff versorgt wurde (Materialtabelle). Der Atemwiderstand (Rrs) wurde mit der erzwungenen Schwingungstechnik für 60 s gemessen, nachdem eine tiefe Aufwinde auf ...
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Diskussion
Die Intubation mit der transkutanen Trachealvisualisierungstechnik bietet einen raffinierten Ansatz zur Standardmethode des Hautschnitts. Mit besonderer Aufmerksamkeit auf mehrere wichtige Schritte kann die Intubation einfach und schnell erreicht werden. Das Tier muss direkt in dorsaler Regung auf der Intubationsplattform platziert werden, wobei die Maus in sanftem Rückzug gesichert ist. Dadurch wird das Tier in vertikale Ausrichtung und richtige Positionierung für die Intubation erweitert. Darüber hinaus sollte die Enth...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren danken Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph und Lindsey Ferguson für ihre technische Unterstützung und den University Laboratory Animal Resources für ihre Tierpflegeunterstützung. Diese Arbeit wird von NIH T35OD010977 und R01-HL102469 finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 18 G x 1 1/4" intravenöser Katheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Kanüle für die Intubation |
| 70% Ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Reinigungskanüle |
| Schleifpapier (Schleifpapier) | Porter-Cable | 74001201 | Kanülenvorbereitung |
| AnaSed (sterile Xylazinlösung) Injektion (100 mg/ml) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anästhesieblaues |
| Beschriftungsband (0,5 Zoll x 14 Meter) | Fisher Scientific | 15966 | Fixierung auf der Intubationsplattform |
| Geflochtene Seidennaht ohne Nadel, unsteril, (3-0) | Henry Schein | Artikel #1007842 | Intubationsplattform |
| Isothermes Deltaphasen-Pad | Braintree Scientific | 39DP | Thermoregulierung und -wiederherstellung der Maus |
| Deltaphase Betrieb Board | Braintree Scientific | 39OP | Wiederherstellung der Maus (vor der Extubation) |
| Destilliertes Wasser | ThermoFisher | 15230253 | Reinigung der Maus nach der Enthaarung |
| Augenschere, abgewinkelt, scharf/scharf | Harvard Gerät | 72-8437 | Kanülenvorbereitung |
| FlexiVent (FX Modul 2) | Scireq | N/A | Aufzeichnung von Lungenfunktionsdaten (für die Durchführung des Eingriffs nicht erforderlich, in dieser Studie zur Validierung des Verfahrens verwendet) |
| Mullschwämme | Fisher scientific | 13-761-52 | Haarentfernung |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring Ansicht Binder | Heftklammern | 24690CT | Intubationsplattform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistische Analysesoftware |
| Insulinspritze (0,5 cc, U100) | Fisher Wissenschaftliche | 329461 | Anästhesieverabreichung |
| Ketamin HCl Injektion, USP (100 mg/ml) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anästhesie |
| Lunge Aufblasbirne | Harvard Apparatus | 72-9083 | Kanülenplatzierung bestätigen |
| Mikrozange, gebogen, glatt | Harvard Apparat | 72-0445 | Zunge zurückziehen und Spannung am Hals erzeugen, um die Kanüle sichtbar zu machen |
| Nair (Haarentfernungslotion), 9 oz Flasche | Kirche & Dwight | 42010440 | Haarentfernung |
| Sterile Kochsalzlösung (0,9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anästhesie, Reinigung der Haut nach der Haarentfernung |
Referenzen
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179(1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107(2013).
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Nachdrucke und Genehmigungen
