Ein Protokoll wird für die In-situ-Perfusion des Unterkörpers der Maus beschrieben, einschließlich der Blase, der Prostata, der Geschlechtsorgane, des Knochens, des Muskels und der Fußhaut.
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Methodenartikel
Etablierung von In Situ Closed Circuit Perfusion von unteren Bauchorganen und Hinterbeinen bei Mäusen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ex-vivo-Perfusion ist ein wichtiges physiologisches Werkzeug, um die Funktion isolierter Organe (z. B. Leber, Nieren) zu untersuchen. Gleichzeitig ist die Ex-vivo-Perfusion von Knochen, Blase, Haut, Prostata und Fortpflanzungsorganen aufgrund der geringen Größe der Mausorgane eine Herausforderung oder nicht machbar. Hier berichten wir zum ersten Mal von einem In-situ-Unterkörper-Perfusionskreislauf bei Mäusen, der die oben genannten Gewebe umfasst, aber die wichtigsten Clearance-Organe (Niere, Leber und Milz) umgeht. Der Kreislauf wird durch Konserven der Abdominalaorta und der unteren Vena cava über der Iliasarterie und Vene und kauterisierenden peripheren Blutgefäßen hergestellt. Die Perfusion erfolgt über eine peristaltische Pumpe mit Perfusatenstrom, der bis zu 2 h gehalten wird. Die In-situ-Färbung mit fluoreszierendem Lektin und der Hoechst-Lösung bestätigte, dass die Mikrovaskulatur erfolgreich durchdrungen wurde. Dieses Mausmodell kann ein sehr nützliches Werkzeug für die Untersuchung pathologischer Prozesse sowie Mechanismen der Medikamentenabgabe, Migration/Metastasierung zirkulierender Tumorzellen in/aus dem Tumor und Wechselwirkungen des Immunsystems mit durchsetzten Organen und Geweben sein.
Einleitung
Isolierte Organperfusion wurde ursprünglich entwickelt, um Organphysiologie für Transplantation1,2,3zu studieren und ermöglichte das Verständnis der Funktionen der Organe ohne Störungen durch andere Körpersysteme. Zum Beispiel, isolierte Nieren- und Herzperfusion war immens nützlich für das Verständnis der Grundprinzipien der Hämodynamik und Der Wirkung von vasoaktiven Wirkstoffen, während Leberperfusion war wichtig, um die metabolische Funktion zu verstehen, einschließlich Desarzneimittelstoffwechsel in gesundem und krankem Gewebe4,5,6,7. Darüber hinaus waren Perfusionsstudien entscheidend für das Verständnis der Lebensfähigkeit und Funktion von Organen, die für die Transplantation bestimmt sind. In Cancer Researchearch wurde die isolierte Tumorperfusion von mehreren Gruppen mit Maus, Ratte und frisch resektierten menschlichen Gewebenbeschrieben 8,9. Bei einer isolierten Tumorperfusion wurde der Tumor in das Eierstockfettpad implantiert, um das Wachstum von Tumoren zu erzwingen, die Blutgefäße aus der mesentery arterienden10versorgen. Die Jain-Gruppe führte bahnbrechende Studien mit isolierter Perfusion von Darmadenokarzinomen durch, um Tumorhämodynamik und Metastasen8,11,12,13zu verstehen. Weitere innovative Ex-vivo-Setups sind ein 96-Well-Platten-basiertes Perfusionsgerät zur Kultur der primären menschlichen Multiple-Myelom-Zellen14 und eine modulare Durchflusskammer für die technische Knochenmarkarchitektur und Funktionsforschung15.
Neben Physiologie- und Pathologiestudien wurde die Organperfusion verwendet, um die Grundprinzipien der Medikamentenabgabe zu untersuchen. So beschrieb eine Gruppe die isolierte Rattengliederperfusion und untersuchte die Anhäufung von Liposomen bei implantierten Sarkomen16, während eine andere Gruppe eine sezierte menschliche Nierenperfusion durchführte, um die endotheliale Ausrichtung von Nanopartikeln zu untersuchen17. Ternullo et al. verwendeten eine isolierte perfundierte menschliche Hautklappe als nah in vivoHautarzneimittelPenetrationsmodell 18.
Trotz dieser Fortschritte bei der Durchblutung großer Organe und Gewebe, gab es keine Berichte über In-situ-Perfusionsmodelle bei Mäusen, die: a) Bypass-Clearance-Organe wie Leber, Milz und Nieren; b) Beckenorgane, Haut, Muskel, Fortpflanzungsorgane (männlich), Blase, Prostata und Knochenmark. Aufgrund der geringen Größe dieser Organe und der zuliefernden Vaskulatur war eine Ex-vivo-Kanülierung und der Aufbau eines Perfusionskreislaufs nicht möglich. Die Maus ist das wichtigste Tiermodell in der Krebs- und Immunologieforschung und der Medikamentenabgabe. Die Fähigkeit, kleine Mausorgane zu durchdringen, würde es ermöglichen, interessante Fragen bezüglich der Medikamentenabgabe an diese Organe zu beantworten, einschließlich zu Tumoren, die in das Becken implantiert wurden (Blase, Prostata, Eierstock, Knochenmark), sowie Studien über grundlegende Physiologie und Immunologie von Erkrankungen dieser Organe. Um diesen Mangel zu beheben, haben wir bei Mäusen einen In-situ-Perfusionskreislauf entwickelt, der möglicherweise Gewebeverletzungen vermeiden kann und sich viel besser für die funktionelle Forschung eignet als isolierte Organperfusion.
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Protokoll
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Colorado genehmigt.
1. Vorheizen des Perfusionssystems
- Bereiten Sie das Perfusionssystem vor der Operation vor, indem Sie ein 37 °C zirkulierendes Wasserbad für alle wasserummantelten Komponenten (Perfusatenreservoir, feuchte Kammer und Deckel) starten, wie in einer benutzerdefinierten Konfiguration in Abbildung 1Adargestellt. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch sauber ist und ersetzen Sie ihn bei Bedarf. Um das Perfusatenvolumen zu begrenzen, verwenden Sie eine Blasenfalle in einer feuchten Kammer als Perfusatenreservoir (Abbildung 1B-6).
2. Gefäßkatheterisierung
- Induzieren Sie anästhesie in einer 8-10 Wochen alten BALB/c-Maus mit einer Isofluran-Veterinäranästhesiemaschine mit 3-5% Isofluran und Sauerstoffdurchfluss rate bei 0,3 l/min. Als Alternative verwenden Sie Ketamin/Xylazin oder jede andere Art der intraperitonealen Anästhesie. Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie mit 2 Methoden: Zehen-Pinch und Hornhautreflex.
- Eine 4-0 Seidennaht mit Nadel in doppelt destilliertem Wasser vorbefeuchten.
- Legen Sie die anästhesierte Maus in eine Supine-Position auf einem Styropor-Brett mit dem Kopf zum Chirurgen und immobilisieren Forelimbs und Hinterbeine mit Klebeband. Wischen Sie den Bauch mit Isopropylalkohol ab und schneiden Sie den Bauch entlang der Mittellinie mit einer Schere in eine "T"-Form. Stoppen Sie das Bluten um den Rand des Schnittes durch Elektrokoagulation (kauterisierend).
- Drücken Sie den Magen, Jejunum und Dickdarm auf die rechte Seite des Bauches, um die Bauchaorta, Vena cava, und gemeinsame Ilias und Iliolumbar Arterien und Venen zu offenbaren.
- Unter einem Dissektionsmikroskop finden und ligagen Sie die Iliolumbar-Arterie/Vene im Männchen, und Eierstockarterie/Vene und die Iliolumbar-Arterie/Vene beim Weibchen mit 4-0 Seidennähten(Abbildung 2 gelbe Linien).
- Unter einem Seziermikroskop zwei 4-0 Seidennähte unter der Bauchaorta und der unteren Vena cava (ca. 1 cm über Iliasarterie und Vene, 1 mm auseinander, Abbildung 2) schleifen und einen lockeren Knoten in der Naht machen, die den Iliasgefäßen am nächsten ist (Abbildung 2, weiß gepunktete Linie). Alternativ kann für diesen Knoten eine 6-0 Seidennaht verwendet werden.
- Unter einem Seziermikroskop, horizontal ausrichten und dehnen sowohl die untere Vena cava und die Bauchaorta mit Porte-Aiguille. Verwenden Sie einen 24 G geflügelten geschirmten I.V. Katheter, um die Bauchaorta zu durchstechen, drücken Sie die Taste, um den Nadelkern zurückzuziehen und setzen Sie den Katheter etwa 5 mm in das Gefäß ein.
- Wiederholen Sie das gleiche Verfahren mit dem unteren Vena cava und binden Sie Knoten beider Nähte um die katheterisierten Gefäße.
HINWEIS: Die Nadel kann leicht durch das Blutgefäß punktieren; halten Sie daher die Gefäße gestreckt und Nadel parallel zum Gefäß. Ziehen Sie den Nadelkern zurück, sobald die Nadel etwa 1 mm in das Gefäß eindringt. Die Bauchaorta ist unter der unteren Vena cava und viel dünner und elastischer, da sie in Bindegewebe eingehüllt ist. Daher kann die Aorta am Katheter "festhalten" und sollte daher vor der Vena cava katheterisiert werden, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass der Katheter ausrutscht.
- Wiederholen Sie das gleiche Verfahren mit dem unteren Vena cava und binden Sie Knoten beider Nähte um die katheterisierten Gefäße.
- Tragen Sie Sofortkleber auf, um die Katheter auf die Erector Spinae zu immobilisieren, ersetzen Sie die Bauchorgane, und beenden Sie die Operation unter Beibehaltung der Anästhesie.
HINWEIS: Organe, die nicht vollständig in die Bauchhöhle ersetzt werden können, müssen während des Perfusionsprozesses regelmäßig mit Perfusionsmedium befeuchtet werden.
3. Einrichten des Perfusionssystems
- Übertragen Sie die Maus in die wasserummantelte Feuchtkammer, die auf einem Siliziumpad auf 37 °C vorgewärmt ist, und schimbaren Sie die Katheterflügel mit 19 G Nadeln auf das Pad.
- Füllen Sie das Ende des arteriellen Katheters (Einlass) mit einem vorgewärmten Perfusionspuffer (Ringers Laktatlösung ergänzt durch 5% BSA), und verbinden Sie dann das Katheterende mit dem Einlassperfusionsschlauch über einen Schraubverbinder(Abbildung 1B, roter Pfeil).
HINWEIS: Halten Sie den Stecker mit hämostatischen Zangen und immobilisieren Sie die Schläuche mit Klebeband, um eine Verschiebung der Katheter zu vermeiden. - Stellen Sie den peristaltischen Durchfluss auf 0,6 ml/min ein und halten Sie den Perfusionsabfluss(Abbildung 1B, blauer Pfeil) für 5-10 min offen, um das Blut durch den Venenkatheter auszuwaschen. Es wird einige Gerinnsel im Auslasskatheter geben; Spülen Sie die Gerinnsel mit Perfusatenpuffer, bevor Sie den Perfusionskreislauf schließen.
- Schließen Sie das Ende des Venenkatheters mit dem Auslassschlauch über einen Schraubanschluss an, um die Schaltung zu schließen (Abbildung 1B). Führen Sie an2 dieser Stelle CO2-Gas-Euthanasie durch und überprüfen Sie durch Brustpunktion oder eine andere Methode.
- Bedecken Sie die feuchte Kammer mit dem erwärmten Deckel. Überprüfen Sie regelmäßig den Perfusate-Pegel, und fügen Sie bei Bedarf weitere hinzu. Die Perfusion kann bis zu 2 Stunden lang durchgeführt werden.
HINWEIS: 5 ml Perfusat werden benötigt, um das geschlossene Perfusionssystem einzurichten. Wenn es keine Leckaden oder Ödeme gibt, verringert sich das Volumen von Perfusate um weniger als 1 ml und ein zusätzlicher Puffer wird nicht benötigt. Um Ödeme zu vermeiden, die durch peripheren zirkulierenden Thrombus induziert werden, kann der Perfusionspuffer, der 0,002% Heparin enthält, in den ersten 10 Minuten der Perfusion verwendet werden, sollte jedoch in Puffer ohne Heparin geändert werden, um das Auslaufen am Rand der Einschnitte zu vermeiden. - Falls erforderlich, fügen Sie jederzeit ein Reagenz der Wahl in das Perfusionsreservoir oder den Injektionsanschluss ein (Abbildung 1B-5). Zum Beispiel können 10 l von 10 mg/ml Hoechst33342 in die Perfusate aufgenommen werden, um die Zellkerne 2 h vor dem Ende der Perfusion zu färben, oder 50 l von 1 mg/ml DyLight 649-lectin, um die vaskulären Endothelzellen 30 min vor dem Ende der Perfusion zu färben.
HINWEIS: Wenn Sie versuchen, Knochenmark mit Hoechst-Lösung zu färben, müssen Mäuse 30 Minuten vor der Operation vorinjiziert werden. - Nach perfusion mit fluoreszierenden Reagenzien weitere 10 Minuten mit Perfusionspuffer auswaschen, um die Hintergrundfluoreszenz zu minimieren.
4. Analyse von durchgeflossenen Organen
- Sammeln Sie Organe wie Hoden, Prostata, Blase, Oberschenkelknochen, Muskel und Haut (z. B. Füße). Ein Stück Orgel ca. 1 mm3 verbrauchen und zwischen zwei Glasrutschen abflachen.
- Studie unter invertiertem fluoreszierendem Konfokalmikroskop mit DAPI/Cy5-Anregungs- und Emissionsfiltern (Anregungslaser : DAPI, 405 nm; Cy5.640 nm). Verwenden Sie mindestens 200x Vergrößerungsobjektiv mit einer 0,45 numerischen Blende.
- Alternativ können Sie die Organe mit 4% Formaldehydlösung für 24 h fixieren und Hämatoxylin-Eosin-Färbung19durchführen.
- Um ein Knochenfenster für intakte Knochenmarkbeobachtung zu erstellen, immobilisieren Sie beide Enden des Oberschenkelknochens oder Tibia und kratzen Sie den kortikalen Knochen mit der seitlichen Kante einer 19 G Nadel weg, um das Periost freizulegen; achten Sie darauf, eine dünne Schicht Restknochen zu halten. Legen Sie den Knochen auf einen Deckelzettel mit dem Fenster zum Glas und das Bild mit invertiertem fluoreszierendem konfokaren Mikroskop mit DAPI- und Cy5-Kanälen, wie oben beschrieben. Die Zellen und das Gefäßnetz in der Knochenmarkhöhle können leicht beobachtet werden.
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Ergebnisse
Wir richten ein geschlossenes Leitungsperfusionssystem durch Konkavulation der Bauchaorta und der unteren Vena cava von 8-10 Wochen alten Mäusen ein, während das Volumen des Perfusionspuffers weniger als 10 ml bleibt. Abbildung 3A zeigt konfokale Bilder nach dem Durchdringenden von Geweben mit Ringer-Lösung, die Hoechst 33342 und DyLight 649-lectin enthält. Muskel-, Knochenmark-, Hoden-, Blasen-, Prostata- und Fußhaut zeigen eine effiziente Kern- und Gefäßfärbung. Abbild...
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Diskussion
Der beschriebene Kreislauf kann verwendet werden, um verschiedene Forschungsfragen zu untersuchen, zum Beispiel die Rolle verschiedener Serumkomponenten und Gewebebarrieren bei der Medikamentenabgabe oder Immun- und Stammzellhandel. Verschiedene Arzneimittelabgabesysteme (z.B. Liposomen und Nanopartikel) können dem Perfusate hinzugefügt werden, um die Rolle physiologischer und biochemischer Faktoren bei der Abgabe zu verstehen. Die Dauer der Perfusion kann variieren, abhängig von dem untersuchten Gewebe, wissenschaftlich...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Studie wurde durch das NIH-Stipendium CA194058 an DS, Skaggs School of Pharmacy ADR Seed Grant Program (DS) unterstützt; National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771093), das Project of International Collaboration of Jilin Province (No.201180414085GH), die Fundamental Research Funds for the Central Universities, das Program for JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| 3,5x-90x Stereo-Zoom-Mikroskop auf Galgenstativ mit LED-Licht | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Kohlendioxid, USP | Airgas Gesundheitswesen | 19087-5283 | |
| Konfokalmikroskop | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Steriler Einweg-Kauterstift mit | Hochtemperatur-FIAB | F7244 | |
| Feuchtkammer-Blasenfalle (Teil 6 in Abbildung 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Kundenspezifisch als Perfisatbehälter; ermöglichte auch die Perfusion mit konstantem Druck |
| Feuchte Kammerabdeckung mit Quarzfenster (Teil 3 in Abbildung 1) | Harvard-Gerät | 733524 | Halten der Temperatur der Kammer |
| Feuchte Kammer mit Metallrohr-Wärmetauscher | Harvard Apparatus | 732901 | Wasserummantelte Feuchtkammer mit Deckel zur Aufrechterhaltung der Perfusat- und Maustemperatur |
| Olsen-Hegar-Nadelhalter mit Nahtschneidern | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Sauerstoffkomprimiert, USP | Airgas Healthcare | C2649150AE06 | |
| Rollenpumpe (Teil 4 in Abbildung 1) | Harvard-Gerät | 730113 | Abgabe von Perfusat an die Kanüle in der Feuchtkammer |
| SCP plugsys Servosteuerung F/Perfusion (Teil 1 in Abbildung 1) | Harvard Apparat | 732806 | Steuerung der Purfusionsgeschwindigkeit |
| Silikonpad | Harvard Apparatus | ||
| Silikonschlauchsatz (Pfeile in Abbildung 1) | Harvard Apparat (TYGON) | 733456 | |
| Student Standard Pattern Pinzette | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Chirurgische | SchereFine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Tisch für Feuchtkammer | Harvard Apparat | 734198 | |
| Thermozirkulator (Teil 2 in Abbildung 1) | Harvard Apparat | 724927 | zirkulierendes Wasserbad für alle wasserummantelten Komponenten |
| Dreiwegehahn (Teil 5 in Abbildung 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Anästhesiegerät für Veterinärmedizin | Highland | HME109< | |
| strong>Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide Nadel | BD | 305186 | Zum Immobilisieren der Insyte Autoguard Winged Nadel und zum Kratzen des kortikalen Knochens |
| 4-0 Seidennähte | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 Seidennähte | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter ( 0,2 &Mikro; m) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter für 5% BSA-RINGER" S |
| Permanentmarker | Staedtler | 342-9 | |
| Spritze (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Spritze (60 mL) | BD | 309653 | Filter für 5% BSA-RINGER" S |
| Reagenzien | |||
| 1% Evansblau ( w/v ) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% gepuffertes Formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c Mäuse ( 8-10 Wochen alt ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex Laktat Ringer's Lösung | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Rinderserumalbumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanacrylatkleber | Krazy Kleber | ||
| DyLight-649-lektin | Vector Laboratories, Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isofluran | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Gibco | 10010023 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
