Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen vor, das es dem Anwender ermöglichen würde, die medikamentöse Störung der komplexen EIF4F-Dynamik in Screening-Formaten zu bewerten.

Abstract

Die Bildung des eIF4F-Komplexes hat sich als der wichtigste nachgeschaltete Knoten für die Konvergenz von Signalsignalen erwiesen, die häufig beim Menschen onkoogene Aktivierung erfahren. eIF4F ist ein Cap-Bindungskomplex, der an der mRNA-ribossomeRekrutierungsphase der TranslationInitiation beteiligt ist. In vielen zellulären und präklinischen Krebsarten führt die Deregulierung von eIF4F zu einer verstärkten Übersetzung spezifischer mRNA-Teilmengen, die an der Proliferation und dem Überleben von Krebs beteiligt sind. eIF4F ist ein heterotrimerkomplex, der aus der Kappenbindungs-Untereinheit eIF4E, dem Helicase eIF4A und der Gerüstuntereinheit eIF4G gebaut wurde. Entscheidend für die Montage aktiver eIF4F-Komplexe ist die Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen eIF4E- und eIF4G-Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der eIF4F-Assembly, das den Status der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen überwacht. Der eIF4e:4G zellbasierte Protein-Protein-Interaktionstest ermöglicht auch eine genaue und zuverlässige Bewertung medikamentös induzierter Veränderungen in der komplexen Integrität von eIF4F. Wir stellen uns vor, dass diese Methode zur Überprüfung der Aktivität kommerziell erhältlicher Verbindungen oder zum weiteren Screening neuartiger Verbindungen oder Modalitäten angewendet werden kann, die die Bildung des eIF4F-Komplexes effizient stören.

Introduction

Die Kontrolle der Genexpression spielt eine zentrale Rolle bei der korrekten Ausführung zellulärer Programme wie Wachstumsproliferation und Differenzierung. Ein regulatorischer Kontrollmechanismus kann entweder auf der Ebene der Gentranskription oder auf der Ebene der mRNA-Translation ausgeübt werden. In den letzten zehn Jahren ist es immer offensichtlicher geworden, dass die translationale Kontrolle durch Modulation des Initiationsprozesses und nicht durch die späteren Schritte der Dehnung und Beendigung die Synthese bestimmter Teilmengen von Proteinen, die eine breite Palette biologischer Funktionen spielen, fein regulieren kann.

Erhöhte ....

Protocol

HEK293 Zelllinie wurde für das Protokoll verwendet und wurde in Dulbecco modifizierte Adler Medium ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum, 2 mM L-Glutamin, und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5%_CO2 in einer befeuchteten Umgebung kultiviert.

1. Quantitative Bewertung der komplexen Störung des eIF4F über eIF4E:eIF4G^604-646 Complementation Assay

1. Zellkultur und transiente Transfektion von eIF4E:eIF4G^604-646 Komplementierungstest
   1. Verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen mit weniger als 20 Passagen für alle Experimente. Bestimmen Sie am ersten Tag die Zellen....

Results

Um die Empfindlichkeit des Komplementierungssystems eIF4E:eIF4G^604-646 zu validieren, wurde die 4EBP1-vermittelte Hemmung der eIF4F-Komplexbaugruppe mit mTOR-Inhibitoren bewertet. Durch hemmende mTORC1-Kinase-abhängige Phosphorylierung der 4EBP-Proteinfamilie verbessert die mTOR-Hemmung die 4EBP1-Assoziation mit eIF4E und damit eIF4F-Demontage¹⁵. Es wurden zwei Klassen mechanistisch unterschiedlicher MTOR-Kinasen getestet: Rapalogs (z.B. Rapamycin), die .......

Discussion

Die in diesem Artikel beschriebene Methode nutzt einen luziferase-basierten Komplementierungstest zur quantitativen Überwachung der komplexen EIF4F-Montage durch direkte Messung der eIF4G-eIF4E-Interaktion in lebenden Zellen. Wir haben Einzelheiten für die Verwendung des eIF4E-eIF4G-Komplementierungssystems zur Verfügung gestellt und auch gezeigt, dass das System bei der Messung der medikamentös induzierten 4EBP1-vermittelten Dissoziation der eIF4E-eIF4G-Interaktion¹⁶extrem genau ist. Um den Durch.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
293FT Zellen	Thermo Fisher Scientific	R70007
Zellkultur Mikroplatte 96 Well, F-Bottom	Greiner bio-one	655083
Zelltiter Glo 2.0	PROMEGA	G9241
Envision Multilabel Reader	PerkinElmer	nicht anwendbar
Finnpipette F2 Mehrkanalpipetten 12-Kanäle 30-300 ml	Thermo Fisher Scientific	4662070
Finnpipette F2 Mehrkanalpipetten 12 Kanäle 5-50 ml	Thermo Fisher Scientific	4662050
FUGENE6	PROMEGA	E2692
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems	PROMEGA	N2014
Optimem I Reduced Serum Mediun, kein Phenolrot	Thermo Fisher Scientific	11058021
Orbital Shaker	Eppendorf	nicht anwendbar
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose	Jena Bioscience	AC-155S