Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

9K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/60851

⸱

13. März 2020

 ,  ,  , 
1Research and Innovation, Murdoch University, 2Centre for Digital Agriculture, Curtin University, 3Centre for Integrative Metabolomics and Computational Biology, School of Science, Edith Cowan University, 4Centre for Computational and System Medicine, Health Futures Institute, Murdoch University, 5Department of Primary Industries and Regional Development, 6State Agricultural Biotechnology Centre, Murdoch University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Eine Methode zur ungezielten Analyse von Weizenkornmetaboliten und Lipiden wird vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine Acetonit-Metabolit-Extraktionsmethode und eine umgekehrte Phase-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Methodik mit Erfassung in positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodi.

Zusammenfassung

Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Genen, der Umwelt und dem Management in der landwirtschaftlichen Praxis könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung von Produktertrag und -qualität ermöglichen. Metabolomics-Daten liefern ein Auslesen dieser Wechselwirkungen zu einem bestimmten Zeitpunkt und sind informativ über den biochemischen Status eines Organismus. Darüber hinaus können einzelne Metaboliten oder Metaboliten-Panels als präzise Biomarker für ertrags- und Qualitätsvorhersage und -management verwendet werden. Das pflanzliche Metabolom wird voraussichtlich Tausende von kleinen Molekülen mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten, die eine Chance für einen biochemischen Einblick in physiologische Eigenschaften und Biomarker-Entdeckung bieten. Um dies zu nutzen, besteht ein zentrales Ziel für Die Forscher der Metabolomik darin, so viel wie möglich von der physikalisch-chemischen Vielfalt in einer einzigen Analyse zu erfassen. Hier stellen wir eine flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie-basierte ungezielte Metabolomik-Methode zur Analyse von Feldweizenkorn vor. Das Verfahren nutzt den quaternären Lösungsmittelmanager des Flüssigchromatographen, um eine dritte mobile Phase einzuführen und kombiniert einen traditionellen umgedrehten Phasengradienten mit einem lipidfreundlichen Gradienten. Getreideaufbereitung, Metabolitenextraktion, instrumentelle Analyse und Datenverarbeitungs-Workflows werden ausführlich beschrieben. Es wurden eine gute Massengenauigkeit und Signalreproduzierbarkeit beobachtet, und die Methode ergab etwa 500 biologisch relevante Merkmale pro Ionisationsmodus. Darüber hinaus wurden signifikant unterschiedliche Metaboliten- und Lipid-Feature-Signale zwischen Weizensorten bestimmt.

Einleitung

Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Genen, Umwelt und Managementpraktiken in der Landwirtschaft könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung von Produktertrag und -qualität ermöglichen. Pflanzenmetaboliten werden durch Faktoren wie Genom, Umwelt (Klima, Niederschlag usw.) und in einer landwirtschaftlichen Umgebung beeinflusst, wie Pflanzen bewirtschaftet werden (d. h. Die Anwendung von Düngemitteln, Fungizid usw.). Im Gegensatz zum Genom wird das Metabolom durch all diese Faktoren beeinflusst und daher liefern Metabolomik-Daten einen biochemischen Fingerabdruck dieser Wechselwirkungen zu einem bestimmten Zeitpunkt. Es gibt in der Regel eines von zwei Zielen für eine Metabolomik-basierte Studie: erstens, um ein tieferes Verständnis der Biochemie des Organismus zu erreichen und helfen, den Mechanismus der Reaktion auf Störungen (abiotischen oder biotischen Stress) in Bezug auf die Physiologie zu erklären; und zweitens, Biomarker mit der untersuchten Störung in Verbindung zu bringen. In beiden Fällen ist das Ergebnis dieses Wissens eine präzisere Managementstrategie, um das Ziel einer verbesserten Ertragsgröße und -qualität zu erreichen.

Das Pflanzenmetabolom wird voraussichtlich Tausende von1 kleinen Molekülen mit verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten. Derzeit können keine Metabolomik-Plattformen (vorwiegend Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie) das gesamte Metabolom in einer einzigen Analyse erfassen. Die Entwicklung solcher Techniken (Probenvorbereitung, Metabolitenextraktion und -analyse), die eine möglichst große Abdeckung des Metaboloms innerhalb eines einzigen analytischen Laufs bieten, ist ein zentrales Ziel für Forscher der Metabolomik. Frühere ungezielte Metabolomik-Analysen von Weizengetreide haben Daten aus mehreren chromatographischen Trennungen und Erfassungspolaritäten und/oder Instrumenten für eine größere Metabolomabdeckung kombiniert. Dies erforderte jedoch, dass Proben für jede Modalität einzeln vorbereitet und erworben wurden. So erstellten Beleggia et al.2. 2 zusätzlich zur GC-MS-Analyse der unpolaren Analyten eine derivatisierte Probe für die GC-MS-Analyse von Polaranalyten. Das et al.3 verwendete sowohl GC- als auch LC-MS-Methoden, um die Abdeckung in ihren Analysen zu verbessern; Dieser Ansatz würde jedoch in der Regel getrennte Probenvorbereitungen wie oben beschrieben sowie zwei unabhängige Analyseplattformen erfordern. Frühere Analysen von Weizengetreide mit GC-MS2,3,4 und LC-MS3,5 Plattformen haben 50 bis 412 (55 identifizierte) Funktionen für GC-MS, 409 für kombinierte GC-MS und LC-MS und mehrere tausend für eine LC-MS Lipidomik-Analyse5ergeben. Durch die Kombination von mindestens zwei Modi in einer einzigen Analyse kann eine erweiterte Metabolomabdeckung aufrechterhalten werden, wodurch der Reichtum der biologischen Interpretation erhöht wird und gleichzeitig Zeit- und Kosteneinsparungen erzielt werden.

Um eine effiziente Trennung einer Vielzahl von Lipidarten durch umgekehrte Phasenchromatographie zu ermöglichen, verwenden moderne Lipidomik-Methoden häufig einen hohen Anteil an Isopropanol im Elutionslösungsmittel6, um Lipidklassen, die sonst durch die Chromatographie ungelöst sein könnten, eine Aenbarkeit zu bieten. Für eine effiziente Lipidtrennung ist die startende mobile Phase auch in der organischen Zusammensetzung7 viel höher als die typischen chromatographischen Methoden der umgekehrten Phase, die andere Klassen von Molekülen berücksichtigen. Die hohe organische Zusammensetzung zu Beginn des Gradienten macht diese Methoden weniger geeignet für viele andere Klassen von Molekülen. Vor allem die umgekehrte Phasenflüssigkeitschromatographie verwendet einen binären Lösungsmittelgradienten, beginnend mit einer meist wässrigen Zusammensetzung und einer Erhöhung des organischen Gehalts, da die Elutionsfestigkeit der Chromatographie erhöht wird. Zu diesem Zweck haben wir versucht, die beiden Ansätze zu kombinieren, um die Trennung von Lipid- und Nicht-Lipid-Klassen von Metaboliten in einer einzigen Analyse zu erreichen.

Hier stellen wir eine chromatographische Methode vor, die eine dritte mobile Phase verwendet und eine kombinierte traditionelle umgekehrte Phase und lipidomics-geeignete Chromatographiemethode mit einer einzigen Probenvorbereitung und einer analytischen Spalte ermöglicht. Wir haben viele der Qualitätskontrollmaßnahmen und Datenfilterschritte übernommen, die bisher in überwiegend klinischen Metabolomik-Studien umgesetzt wurden. Diese Ansätze sind nützlich, um robuste Merkmale mit hoher technischer Reproduzierbarkeit und biologischer Relevanz zu bestimmen, und schließen diejenigen aus, die diese Kriterien nicht erfüllen. Zum Beispiel beschreiben wir die Wiederholungsanalyse der gepoolten QC-Probe8, QC-Korrektur9, Datenfilterung9,10 und Imputation fehlender Features11.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Diese Methode eignet sich für 30 Proben (ca. 150 Samen pro Probe). Hier wurden drei biologische Nachbildungen von zehn verschiedenen Weizensorten verwendet.

1. Herstellung von Körnern

  1. Abrufen von Proben (Ganze Körner) aus -80 °C Lagerung.
    HINWEIS: Die Gefriertrocknung von Samen wird kurz nach der Ernte empfohlen, wenn Proben aus mehreren Jahreszeiten entnommen werden. Dadurch werden Änderungen der Metabolitenkonzentration minimiert, die nach unterschiedlichen Lagerzeiten auftreten können. Dazu samen auf ein 15 ml Kunststoffzentrifugenrohr (ca. 300 Samen füllen das Rohr) übertragen und mit Aluminiumfolie abdecken. Die Folie zwei-dreimal mit einem Stift durchstechen und die ganzen Körner über Nacht (ca. 24 h) trocknen. Proben können in dieser Phase entweder an den -80 °C-Gefrierschrank zurückgegeben werden oder der nächste Schritt kann durchgeführt werden.
  2. Schleifen Sie die Samen mit einem Labormixer für zwei Durchläufe im High-Modus für 20 s.
    HINWEIS: Der für dieses Protokoll verwendete Mixer benötigt mindestens 150 Samen, um den Mixer bis zur Klingenhöhe zu füllen und eine relativ homogen gemahlene Kornprobe zu geben.
  3. Entfernen Sie den Mixer von der Basis und tippen Sie auf die Seite des Mixers, um grobe geschliffene Körner an die Oberfläche der Probe zu bringen. Grobes Material kann entsorgt oder gelagert werden.
  4. Pulverähnliches fein gemahlenes Material aus dem Mixer auf ein 2 ml Kunststoff-Mikrozentrifugenrohr übertragen.
    HINWEIS: Waschen Sie den Mixer mit entionisiertem Wasser und spülen Sie ihn mit DEM LC-MS-Grade MeOH zwischen den Proben. Stellen Sie sicher, dass der Mixer vollständig trocken ist, bevor Sie mit der nächsten Probe fortfahren.
  5. Geben Sie fein gemahlene Getreideproben in den Gefrierschrank zurück oder fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort (Metabolitenextraktion).

2. Herstellung von Extraktionslösungsmittel

HINWEIS: Bereiten Sie Extraktionslösungsmittel am selben Tag wie die Durchführung der Extraktionen vor.

  1. Bereiten Sie mindestens 2 ml von 1 mg/ml jeder Norm vor. Verwenden Sie Acetonitril (ACN), um 2-Aminoanthracen,6Miconazol und d 6-Transcinnamsäure vorzubereiten. Verwenden Sie Wasser, um 13C6-Sorbitol vorzubereiten.
  2. Nehmen Sie 2 ml von jedem 1 mg/ml Standard und fügen Sie zu einem 100 ml Volumetruhe.
  3. Füllen Sie den Volumetkolben bis zur Linie mit Acetonitril. Stellen Sie sicher, dass 100 ml Acetonitril 20 g/ml jeder internen Norm enthält: 2-Aminoanthracen, Miconazol, 13C6-Sorbitol, d66-Transcinnamsäure.

3. Metabolitenextraktion

  1. Wiegen Sie 200 mg fein gemahlenes Korn in ein 2 ml Mikrozentrifugenrohr.
  2. Fügen Sie 500 l Extraktionslösungsmittel zu 200 mg fein gemahlener Getreideprobe hinzu.
  3. Mischen Sie mit einem Homogenisator für 2 Auflagen von 20 s bei 6.500 Rpm.
  4. Zentrifuge bei 4 °C für 5 min bei 16.100 x g.
  5. Übertragen Sie den Überstand auf ein 2 ml Kunststoffrohr.
  6. Wiederholen Sie diesen Vorgang von den Schritten 3.1 bis 3.5 zweimal, um ein Gesamtüberstandvolumen von ca. 1,5 ml zu erhalten.
  7. Wirbel, um den Überstand zu mischen.
  8. Übertragen Sie ein gleiches Volumen (55 l) jedes Extrakts in ein separates 2 ml-Rohr, um eine gepoolte Kornextraktprobe zu bilden.
  9. Übertragen Sie einen 50 L Aliquot des Extrakts in eine Glasdurchstechflasche.
    HINWEIS: Extrakte können an dieser Stelle eingefroren werden (-80 °C) oder mit dem nächsten Schritt fortfahren und der LC-MS-Analyse folgen.

4. Vorbereitung von Lösungen für die LC-MS-Analyse

VORSICHT: Für konzentrierte Säure immer Säure zu Wasser/Lösungsmittel hinzufügen.

  1. Bereiten Sie 50 ml von 1 M Ammonium Formate Lagerlösung. Wiegen Sie 3,153 g Ammoniumformat und übertragen Sie ihn in einen 50 ml Volumetkolben. Füllen Sie volumetrischen Kolben mit LC-MS GradH2O.
  2. Bereiten Sie 1 L der mobilen Phase A bestehend aus 10 mM Ammoniumformat, 0,1% Ameisensäure vor. Dazu fügen Sie ca. 500 ml WASSER der LC-MS-Klasse zu einem 1 L-Volumenkolben hinzu. 10 ml 1 M Ammoniumformatbestand und 1 ml Ameisensäure hinzufügen. Volumetrischen Kolben mit LC-MS GradH2O. In eine 1 L-Flasche geben und 15 min zum Entgasen beschallen.
  3. Bereiten Sie 1 L der mobilen Phase B bestehend aus 10 mM Ammoniumformat in 79:20:1 Acetonitril: Isopropylalkohol: Wasser, 0,1% Ameisensäureverhältnis vor. Fügen Sie 200 ml Isopropanol zu einem 1 L Volumetkolben hinzu. 10 ml 1 M Ammoniumformatbestand und 1 ml Ameisensäure hinzufügen. Füllen Sie den Volumetkolben bis zur Linie mit Acetonitril. In eine 1 L-Flasche geben und 15 min beschallen, um zu entgasen.
    HINWEIS: Verdünnen Sie das 1 M Ammoniumformat in den Isopropylalkohol (IPA), bevor Sie das ACN hinzufügen. Ammoniumformat ist in CAN unlöslich.
  4. Bereiten Sie 1 L der mobilen Phase C bestehend aus 10 mM Ammoniumformat im Verhältnis 89:10:1 Isopropylalkohol:Acetonitrile:Wasser vor. Dazu ca. 500 ml Isopropanol, 10 ml 1 M Ammoniumformatbestand und 100 ml Acetonitril zu einem 1 L Volumetkolben hinzufügen. Füllen Sie die Linie mit Isopropanol. In eine 1 L-Flasche geben und 15 min beschallen, um zu entgasen.
  5. Herstellung von LC-MS-Systemwaschlösungsmitteln
    1. Ersetzen Sie die Pumpenkopf-Waschlösung durch eine frische Lösung. Verwenden Sie 50% Methanol, 10% Isopropylalkohol oder andere, wie vom Hersteller empfohlen.
    2. Bereiten Sie starke und schwache Nadelwaschlösungen zum Waschen der Injektionsflüssigkeiten vor und nach der Probeninjektion vor. Für die starke Wäsche, fügen Sie gleiche Mengen an ACN und IPA. Für die schwache Wäsche eine Lösung von 10% ACN (die ca. 500 ml und 1 L jeder der starken und schwachen Waschungen für dieses Protokoll und die Anzahl der Proben) in separaten Flaschen vorbereiten.
    3. Stellen Sie die Nadelwaschvolumen für die starken bzw. schwachen Waschungen auf 600 l bzw. 1800 l ein.

5. Vorbereitung von Proben für die LC-MS-Analyse

  1. Gemäß den Herstellern Standard-Betriebsverfahren für die Herstellung von 400 ng /l Leucin Enkephalin, Pipette 7,5 ml Wasser in die 12 ml Leucin-Enkephalin-Durchstechflasche mit 3 mg Leucin-Enkephalin. Bei -80 °C in 50 L Aliquots einfrieren.
  2. Bereiten Sie 100 ml 5% ACN mit 200 ng/ml Leucin-Enkephalin (50 l von 400 ng/l Leucin Enkephalin) vor. Bereiten Sie sich am selben Tag wie die LC-MS-Analyse vor.
  3. Fügen Sie der 50-L-Probe aliquot, die aus Schritt 3 hergestellt wurde, 950 l 5% Acetonitril mit dem Injektionsstandard Leucin-Enkephalin hinzu.
  4. Wirbel, um die vorbereitete Probe zu mischen.

6. LC-MS-Setup

HINWEIS: Eine detaillierte Beschreibung der Einrichtung von Instrumenten und Erfassungsmethoden finden Sie im Benutzerhandbuch des Herstellers. Ein allgemeiner Leitfaden und die Einzelheiten zu diesem Protokoll sind unten aufgeführt. Die folgenden Schritte können jederzeit vor dem Erfassen der Daten ausgeführt werden.

  1. Öffnen Sie ein LC-MS-Hardwareprofil.
  2. Richten Sie die chromatographische Methode wie in Tabelle 1beschrieben ein. Stellen Sie sicher, dass das LC-System mit einem quaternären Lösungsmittelmanager ausgestattet ist, um diesen Gradienten einzurichten.
    HINWEIS: IPA ist ein viskoses Lösungsmittel. Es sollte mit einer niedrigen Durchflussrate eingeführt werden, und es sollte eine ausreichende Ausgleichszeit verwendet werden, bevor die Zusammensetzung auf 98,0 % erhöht wird. Durch diese Schritte wird verhindert, dass das LC-System überdruckt und angehalten wird.
  3. Richten Sie die Massenspektrometererfassungsmethoden für jeden positiven und negativen ToF-MS-Modus über den m/z-Bereich 50-1.300 ein.
    ANMERKUNG: Das hier vorgestellte Instrument erfordert, dass positive und negative Methoden kalibriert und einzeln ausgeführt werden (d. h. Polaritätswechsel innerhalb einer Methode ist nicht möglich).
  4. Wenn die LC-Spalte neu ist, konditionieren Sie die Spalte entsprechend der Empfehlung des Herstellers.
    HINWEIS: Die folgenden Schritte sollten direkt vor der Datenerfassung abgeschlossen werden.
  5. Kalibrieren Sie in einem "nur MS"-Hardwareprofil das Massenspektrometer gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Führen Sie diesen Schritt vor jedem Erfassungsmodus aus, um sicherzustellen, dass sich das System vor der Kalibrierung in jeder bestimmten Modalität stabilisiert hat.
  6. Reinigen und spülen Sie das LC-Fluidiksystem mit LC-MS-Lösungsmitteln, einschließlich mobiler Phasen- und Waschlösungsmittel.
  7. Gleichgewichten Sie das LC-System unter Verwendung der Startbedingungen der LC-Methode, um sicherzustellen, dass sich der Säulendruck stabilisiert hat.
  8. Natriumformat (0,5 mM in 90% IPA) zu Beginn der Probensequenz (siehe unten) injizieren, um die Gerätekalibrierung zu überprüfen.
  9. Richten Sie die Instrumentensequenztabelle so ein, dass lösemittelhaltige und präparative (Extraktions-)Rohlinge zuerst analysiert werden; gefolgt von gepoolten QC-Proben (6-10) für die Systemkonditionierung; dann läuft die randomisierte Stichprobenliste mit QC-Proben in regelmäßigen Abständen (z.B. jede fünfte Injektion) als technische Replikationen. Führen Sie zwei QC-Beispiele am Ende der Sequenz aus.
    HINWEIS: Es ist hilfreich, das Datum und die Injektions-/Erfassungsreihenfolge in den Beispieldateinamen sowie die Beispiel-ID aufzunehmen. Beispiel: YYYY MMDD_Injection number_Variety_Biological replizieren. Stellen Sie vor dem Drücken des Starts sicher, dass der LC-Säulendruck stabil ist und dass der LC mit dem MS verbunden ist.

7. Datenverarbeitung

HINWEIS: Abbildung 1ist ein allgemeiner Datenverarbeitungsworkflow dargestellt.

  1. Überprüfen Sie die Datenqualität (interne Standardmassengenauigkeit (Berechnung unten) und Signalreproduzierbarkeit), während die Sequenz läuft. Zur Überprüfung der Signalreproduzierbarkeit sollte eine Sichtprüfung von überlagerten Spektren ausreichen.
    ANMERKUNG: Massenfehler (ppm) = ((Theoretische Masse – gemessene Masse) / theoretische Masse) x 106
  2. Generieren Sie eine ausgerichtete Peak-Intensity-Matrix mit Samples x internen Standards (ausgerichtet nach Aufbewahrungszeit und m/z-Werten).
    1. Öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien). Klicken Sie unter Startseite > Öffnenauf Daten. Navigieren Sie zum entsprechenden Dateispeicherort, und öffnen Sie alle Datendateien.
    2. Wählen Sie unter Startseite > Sequenz > Verarbeitungstyp Quantitation aus dem Dropdown-Menü aus.
    3. Klicken Sie unter Startseite > Methode > Quanauf Kalibrierungskomponenten. Füllen Sie jedes Feld mit den in Tabelle 2angegebenen Details aus. Klicken Sie auf OK.
    4. Füllen Sie im linken Bereich in den Spalten neben den Datendateien den Beispieltyp aus, indem Sie mit der rechten Maustaste auf die Zelle klicken und Unbekanntauswählen. Füllen Sie die Ebene als n/aaus.
    5. Wählen Sie unter Startseite > Verarbeitungdie Option Sequenzaus. Wählen Sie einen Speicherort aus, um die Sequenz zu speichern, und klicken Sie dann auf Verarbeiten.
    6. Wählen Sie unter Startseite > Ergebnisse Quanaus. Wählen Sie im Quan-Viewer Exportläufe in den Matrixanalysatoraus.
    7. Klicken Sie im Matrix-Analyzer-Ergebnisbetrachter auf Exportieren nach csv. Speichern Sie die Datei als Tabellenkalkulationsdatei.
    8. Berechnen Sie in der Tabellenkalkulationssoftware den Durchschnitt, die Standardabweichung und die relative Standardabweichung der Intensität (Spitzenfläche) jedes internen Standards.
  3. Generieren Sie eine ausgerichtete Peak-Intensity-Matrix mit Samples x ungezielten Features (ausgerichtet nach Aufbewahrungszeit und m/z-Werten).
    1. Öffnen Sie die Software zur Analyse der Analyse kleiner Moleküle (siehe Tabelle der Materialien), und wählen Sie Datei > Neu aus, um ein neues Experiment zu erstellen. Benennen Sie das Experiment, und wählen Sie den Speicherort zum Speichern und Speichern von Experimentdateien aus. Klicken Sie auf Weiter.
    2. Wählen Sie den Typ des verwendeten Instruments (hochauflösendes Massenspektrometer), das Datenformat (Profil) und die Polarität (positiv oder negativ) aus. Klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie alle in der Bibliothek verfügbaren Addukte aus, und bearbeiten Sie die Adduktionsbibliothek nach Bedarf. Klicken Sie auf Experiment erstellen. Eine neue Seite wird geladen, auf der der Rest der Datenverarbeitung fortgesetzt wird.
    3. Importieren von Datendateien. Wählen Sie das Dateiformat aus, und wählen Sie dann Import aus. Navigieren Sie zum Speicherort der Daten, und wählen Sie die zu importierenden Datendateien aus. Der Fortschritt wird für jede Datei im linken Bereich der Seite angezeigt.
    4. Nachdem Datendateien importiert wurden, wählen Sie Automatische Verarbeitung startenaus. Wählen Sie eine Methode zum Auswählen einer Ausrichtungsreferenz aus. Lassen Sie die Software entweder alle Runs auf Ihre Eignung bewerten, geben Sie eine Liste geeigneter Samples (d. h. QC-Beispiele) oder wählen Sie die referenzamte, d.h. eine QC-Probe in der Mitte. Wählen Sie Ja, richten Sie meine Ausführungen automatisch aus > Weiter.
    5. Wählen Sie Weiter auf der Versuchsentwurfsseite (dies kann später eingerichtet werden).
    6. Wählen Sie Peak Picking durchführen aus, und legen Sie dann Parameter fest. Wählen Sie unter der Registerkarte "Spitzenauswahllimits" absolute Ionenintensität aus, und geben Sie 100ein. Wählen Sie eine minimale Spitzenbreite anwenden und geben Sie 0.01 min ein. Wählen Sie OK > Fertigstellen . Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist, wählen Sie Schließenaus.
      HINWEIS: Peak Picking Limits können bei Bedarf für andere Datendateitypen optimiert werden.
    7. Wählen Sie unten rechts auf dem Bildschirm Abschnitt Abgeschlossenaus. Überprüfen Sie ausgerichtete Ausführungen, und stellen Sie sicher, dass jedes Beispiel an der Referenz ausgerichtet ist. Die Ausrichtungswerte betrugen >90% für die hier vorgestellten Daten. Wählen Sie Abschnitt Abgeschlossenaus .
    8. Wählen Sie auf der nächsten Seite zwischen dem Betreffentwurf aus. Benennen Sie das Design. Wählen Sie Die Ausführung manuell gruppieren aus, und erstellen Sie Entwurf. Bedingung hinzufügen, auf Bedingung 1 klicken und die Gruppe entsprechend benennen. Klicken Sie auf Abschnitt Abgeschlossen.
      HINWEIS: Fügen Sie weiterhin Bedingungen hinzu, die geeignet sind, Statistiken innerhalb der Software zu verwenden. Da wir die Software nur verwendet haben, um eine ungezielte Matrix zu generieren, haben wir eine einzelne Bedingung mit der Bezeichnung "alle" verwendet.
    9. Wählen Sie auf der nächsten Seite Abschnitt Abgeschlossenaus. Wiederholen Sie die Spitzenauswahl nicht.
    10. Überprüfen Sie die Dekonvolution, und klicken Sie dann auf Abschnitt Abgeschlossen.
    11. Gehen Sie zu Datei > Zusammengesetzte Messungen exportieren. Deaktivieren Sie alle Eigenschaften, die in der Ausgabe nicht gewünscht werden. Klicken Sie auf OK. Wählen Sie einen Speicherort aus, um die CSV-Datei zu speichern. Klicken Sie auf Speichern > Datei öffnen > Ordner öffnen oder Schließen.
  4. Filtern Sie die Daten mithilfe der Extraktionsrohlinge, um Artefakte (Spreadsheet-Software) zu entfernen.
    1. Berechnen Sie für jedes RT x m/z-Feature in einer neuen Spalte die durchschnittliche Antwortvariablen in Extraktionsrohlingen.
    2. Berechnen Sie für jedes RT x m/z-Feature die durchschnittliche Antwortinin in allen anderen Stichproben (einschließlich QC-Samples).
    3. Berechnen Sie die % Spitzenintensität von Rohlingen in Stichproben (durchschnittliche Antwort in Leer/Durchschnitt-Antwort in Stichproben x 100).
    4. Sortieren Sie die Prozentuale Beitragsspalte von den niedrigsten auf die höchsten Werte.
    5. Entfernen Sie Features, die >5% Intensitätsbeitrag aus Leerzeichen haben.
  5. Filtern Sie fehlende Werte und korrigieren Sie die Funktionssignale auf Signale in gepoolten QC-Samples.
    1. Öffnen Sie die Datenverarbeitungssoftware (Tabelle der Materialien). Klicken Sie auf die Schaltfläche MatrixAnalyzer anzeigen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Datendatei öffnen.
    2. Navigieren Sie zum Speicherort der Csv-Datei, der die Spitzenintensität von RT x m/z-Features für jedes Beispiel enthält (ungezielte Matrix). Wählen Sie Öffnen.
    3. Füllen Sie unter der Registerkarte QC-Beispiele jeden Parameter nach Bedarf aus. Verwenden Sie für den hier beschriebenen Datensatz QC category=QC, ignore categories=empty, impute type=none, coverage threshold=80, scale using=no scaling, uncheck log transform, correct using=smoothing spline, smoothing=0.25.
    4. Oben rechts im Matrix-Panel klicken Sie auf die Wiedergabeschaltfläche QC-Korrektur.
    5. Nachdem die Korrektur oben rechts im Matrixbedienfeld durchgeführt wurde, klicken Sie auf Ergebnisse speichern. Navigieren Sie zu einem geeigneten Speicherort, und speichern Sie die CSV-Ergebnisdatei.
  6. Filtern Sie die Daten, um Features zu entfernen, die >20% RSD in QC-Beispielen aufweisen.
    1. Ordnen Sie die Daten so an, dass sich Beispiele in Zeilen befinden und Features in Spalten.
    2. Berechnen Sie in einer neuen Spalte die durchschnittliche Spitzenintensität für QC-Samples.
    3. Berechnen Sie in einer neuen Spalte die Standardabweichung der Spitzenintensität für QC-Samples.
    4. Berechnen Sie die relative Standardabweichung der Spitzenintensität für QC-Proben: (QC-Standardabweichung/QC-Durchschnitt) x 100.
    5. Sortieren Sie die Features von der niedrigsten zur höchsten %RSD, und entfernen Sie Features mit einer QC-RSD >20%.
  7. Filtern Sie die Daten, umsampleFeatures mit niedrigen RSD-Beispiel-/RSD-QC-Verhältnissen (z. B. <1) zu entfernen.QC
    1. Berechnen Sie in einer neuen Spalte die durchschnittliche Spitzenintensität für Stichproben.
    2. Berechnen Sie in einer neuen Spalte die Standardabweichung der Spitzenintensität für Stichproben.
    3. Berechnen Sie die relative Standardabweichung der Spitzenintensität der Proben: (Probestandardabweichung/Probendurchschnitt) x 100.
    4. Teilen Sie in einer neuen Spalte die Samples RSD durch die QC-RSD.
    5. Sortieren Sie diesampleWerte (RSD-Beispiel/RSD-QC-Verhältnisse) von den höchsten zu den niedrigsten und entfernen Sie Features mit einem Verhältnis <1.QC
  8. Fehlende Werte imputieren (mehrere Online-Methoden verfügbar).
    1. Formatieren Sie die Kalkulationstabelle so, dass sich Beispiele in Zeilen befinden und Features in Spalten. Die erste Spalte sollte der Dateiname der Beispiele sein. Erstellen Sie eine zusätzliche Spalte neben den Dateinamen, und geben Sie die Beispielgruppierungen ein. In diesem Fall wurden die Proben nach Sorte gruppiert.
    2. Speichern Sie die Kalkulationstabelle als CSV-Datei.
    3. Gehen Sie auf die Homepage für die webbasierte analytische Pipeline für Hochdurchsatz-Metabolomik (siehe Tabelle der Materialien) und klicken Sie auf Klicken Sie hier, um zu starten.
    4. Klicken Sie auf Statistische Analyse. Wählen Sie unter Daten hochladenaus, wählen Sie Datentyp: Spitzenintensitätstabelle, Format: Samples in Zeilen (ungepaart) und wählen Sie dann Datei aus.
    5. Navigieren Sie zur .csv-Datei, wählen Sie Öffnen und dann Sendenaus.
    6. Wählen Sie auf der nächsten Seite die Option Schätzung des fehlenden Wertesaus. Deaktivieren Sie Schritt 1 (dies wurde in AnalyzerPro XD durchgeführt). Wählen Sie in Schritt 2 eine Methode aus, um fehlende Werte zu schätzen.
      HINWEIS: Für die hier vorgestellten Daten wurde "fehlende Werte schätzen" mit 'KNN' ausgewählt.
    7. In dieser Phase kann die Datenmatrix heruntergeladen werden (wählen Sie Download aus dem linken Bereich der Webseite) oder weitere statistische Analysen durchführen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Das Pflanzenmetabolom wird durch eine Kombination seines Genoms und seiner Umwelt beeinflusst, und zusätzlich in einer landwirtschaftlichen Umgebung, dem Pflanzenmanagementregime. Wir zeigen, dass hier genetische Unterschiede zwischen Weizensorten auf Metabolitenebene beobachtet werden können, wobei über 500 gemessene Verbindungen signifikant unterschiedliche Konzentrationen zwischen den Sorten allein im Getreide aufweisen. Eine gute Massengenauigkeit (<10 ppm-Fehler) und die Signalrep...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Hier stellen wir eine LC-MS-basierte ungezielte Metabolomik-Methode zur Analyse von Weizengetreide vor. Die Methode kombiniert vier Erfassungsmodi (umgekehrte Phase und lipid-amenable reversed phase mit positiver und negativer Ionisation) in zwei Modi, indem eine dritte mobile Phase in den umgekehrten Phasenverlauf eingeführt wird. Der kombinierte Ansatz ergab etwa 500 biologisch relevante Merkmale pro Ionenpolarität, wobei etwa die Hälfte dieser signifikant unterschiedlichen Intensitäten zwischen Weizensorten aufweist. ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren möchten das Landwirtschafts- und Ernährungsstipendium des West australian Premier (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) und den Premier es Fellow, Professor Simon Cook (Centre for Digitale Landwirtschaft, Curtin University und Murdoch University). Feldversuche und Getreideprobenentnahme wurden von der Regierung des Programms Royalties for Regions in Westaustralien unterstützt. Wir würdigen Grantley Stainer und Robert French für ihre Beiträge zu Feldversuchen. Die von NCRIS finanzierten Bioplattformen Australien sind für die Finanzierung von Ausrüstungen anerkannt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
13C6-SorbitMerck Sigma-Aldrich605514
2-AminoanthracenMerck Sigma-AldrichA38800-1 g
AcetonitrilThermoFisher ScientificFSBA955-4Optima LC-MS
Grade AmmoniumformiatMerck Sigma-Aldrich516961-100 mL>99.995%
Analyst TFSciexVersion 1.7
AnalyzerPro SoftwareSpectralWorks Ltd.Datenverarbeitungssoftware, die für Schritt 7.2 verwendet wird. Version 5.7
AnalyzerPro XD SortierwareSpectralWorks Ltd.Datenverarbeitungssoftware, die für Schritt 7.5 verwendet wird. Version 1.4
SaldoSartorius. Präzisionswaagen Pty. Ltd.
d6-TranszinnsäureIsotec513962-250 mg
AmeisensäureAjax Finechem Pty. Ltd.A2471-500 mL99%
Gefriertrockner (Freezone 2.5 Plus)Labconco7670031
Glass Schott Flaschen (100 mL, 500 mL, 1 L)
Glasfläschchen (2 mL) und Deckel mit Schraubverschluss (vorgeschlitzt)Velocity Scientific SolutionsVSS-913 (Fläschchen), VSS-SC91191 (Deckel)
Einbausatz für Sciex TripleToFSciexp/n 4456736
IsopropanolThermoFisher ScientificFSBA464-4Optima LC-MS
LabormixerWaring kommerziellesModell HGBTWTS3
Leucin-enkephalinWasserp/n 700008842Tuning-Lösung
Metaboanalysthttps://www.metaboanalyst.ca/ MetaboAnalyst/faces/home.xhtmlWebbasierte analytische Pipeline für Hochdurchsatz-Metabolomik. Kostenloses, webbasiertes Tool. Version 4.0.
MethanolThermoFisher ScientificFSBA456-4Optima LC-MS Klasse
MiconazolMerck Sigma-AldrichM3512-1 g
Mikrozentrifuge (Eppendorf 5415R)Eppendorf (Vertrieb durch Crown Scientific Pty. Ltd.)5426 Nr. 0021716
Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL)SSIbio1310-S0
Microsoft Office ExcelMicrosoft
Peak View SoftwareSciexVersion 1.2 (64 Bit)
Pipettenspitzen (200 μl, 100 μl)ThermoFisher ScientificMBP2069-05-HR (200 μl), MBP2179-05-HR (1000 μl)
Pipetten (200 μl, 1000 μl)ThermoFisher Scientific
Zentrifugenröhrchen aus Kunststoff (15 mL)ThermoFisher ScientificNUN339650
Progenesis QINonlinear DynamicsSoftware zur Analyse von Molekülen. Version 2.3 (64 Bit)
Sciex 5600 Triple-ToF-MassenspektrometerSciex
Analyseröhrchen mit Schraubverschluss (2 mL) mit KeramikkügelchenBertin Technologies
NatriumformiatMerck Sigma-Aldrich456020-25 g
Gewebelyser/HomogenisatorBertin TechnologiesSerial 0001620
Messkolben (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)
Vortex-MischerIKA Works Inc. (Vertrieb durch Crown Scientific Pty. Ltd.)001722
WasserThermoFisher ScientificFSBW6-4Optima LC-MS Qualität
Water's Acquity LC System ausgestattet mit QuartärpumpenWaters
Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 SäuleWasserp/n 186005614

Referenzen

  1. Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
  2. Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
  3. Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
  4. Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
  5. Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
  6. Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
  7. Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
  8. Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
  9. Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
  10. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72(2018).
  11. Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
  12. Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
  13. Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
  14. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  15. Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423(2016).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Unzielgerichtete MetabolomikWeizenkornanalyseMetabolitextraktioninstrumentelle AnalyseDatenverarbeitungSignalreproduzierbarkeitMassengenauigkeitbiologische Merkmale
Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.