Methodenartikel

Microwaving und Fluorophor-Tyramid für Multiplex-Immunostainierung auf Maus-Adrenals – Verwendung von unkonjugierten Primärantikörpern aus den gleichen Wirtsarten

DOI:

10.3791/60868

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21. Februar 2020

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1College of Animal Science & Technology, Henan University of Science and Technology, 2Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine, Auburn University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Für multipleX-Immunostaining mit primärer Antikörper aus der gleichen Wirtsart wurden verschiedene Methoden etabliert. Hier beschreiben wir die Verwendung von Mikrowellen-vermittelten Antikörper-Stripping und von Fluorophor-Tyramid, um Antikörper-Kreuzreaktivität während multiplex-immunostaining auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Mausnebennierenabschnitten zu blockieren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunostaining ist weit verbreitet in der biomedizinischen Forschung verwendet, um die zelluläre Expression Muster eines bestimmten Proteins zu zeigen. Multiplex-Immunostainierung ermöglicht die Etikettierung mit mehreren primären Antikörpern. Um die Antikörper-Kreuzreaktivität zu minimieren, erfordert multiplexe Immunfärbung mit indirekter Färbung unbeschriftete Primärantikörper verschiedener Wirtsarten. Die geeignete Kombination verschiedener Artenantikörper ist jedoch nicht immer verfügbar. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verwendung unbeschrifteter Primärantikörper derselben Wirtsart (z.B. in diesem Fall stammen beide Antikörper von Kaninchen) zur Multiplex-Immunfluoreszenz auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Mausnebennierenabschnitten. Bei dieser Methode wird das gleiche Verfahren und die gleichen Reagenzien verwendet, die im Antigen-Retrieval-Schritt verwendet werden, um die Aktivität des zuvor gebeizten Primärantikörperkomplexes zu entfernen. Die Dias wurden mit dem ersten primären Antikörper mit einem allgemeinen Immunfleckenprotokoll befleckt, gefolgt von einem Bindungsschritt mit einem biotinylierten Sekundärantikörper. Dann wurde eine Avidin-Biotin-Peroxidase-Signalentwicklungsmethode mit Fluorophor-Tyramid als Substrat verwendet. Die Immunaktivität des ersten primären Antikörperkomplexes wurde durch Eintauchen in eine Mikrowellen-Koch-Natriumcitratlösung für 8 min abgestreift. Die unlösliche Fluorophor-Tyramid-Ablagerung blieb auf der Probe, wodurch der Schlitten mit anderen primären Antikörpern gefärbt werden konnte. Obwohl diese Methode die meisten falsch positiven Signale eliminiert, kann ein gewisser Hintergrund von Antikörper-Cross-Reaktivität bleiben. Wenn die Proben mit endogenem Biotin angereichert sind, kann ein peroxidasekonjugierter Sekundärantikörper verwendet werden, um den biotinylierten Sekundärantikörper zu ersetzen, um das falsche Positiv aus wiedergewonnenem endogenem Biotin zu vermeiden.

Einleitung

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Bei multipleximmunostaining kann die direkte Färbung mit konjugierten Primärantikörpern informative Ergebnisse liefern. Ohne sekundäre Antikörper hat die direkte Färbemethode ein geringes Risiko für falsche Kolokalisierungssignale durch Antikörper-Kreuzreaktivität. Die konjugierten Reporter (Fluorophor, Enzyme) oder Biotin auf dem primären Antikörper begrenzen jedoch seine zukünftige Verwendung. Alternativ liefert die indirekte Immunfärbung in der Regel stärkere Signale, indem ein nicht konjugierter Primärantikörper mit einem markierten sekundären Antikörper verwendet wird. Idealerweise sollten nicht konjugierte primäre Antikörper, die in Multiplex-Immunostainierung verwendet werden, von verschiedenen Wirtsarten stammen, um Antikörper-Kreuzreaktivität zu vermeiden. Die geeignete Kombination von Primärantikörpern verschiedener Wirtsarten ist jedoch nicht immer verfügbar.

Es wurden mehrere Methoden eingeführt, um das Risiko zu beseitigen, dass der sekundäre Antikörper mit einem unerwünschten primärantikörper reagiert. Eine gängige Methode ist die Verwendung eines monomeren F(ab) Antikörpers, um alle verbleibenden Bindungsepitope auf dem ersten primären Antikörperkomplex zu blockieren, bevor der zweite primäre Antikörper1gefärbt wird. Das Abisolieren von Antikörpern, das dem Streifen und der Reprobe eines westlichen Fleckenblattes ähnelt, entfernt den zuvor gebeizten Antikörperkomplex, ohne die Ablagerung nachweisbarer Reportermoleküle wie 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)2 und die fluoreszierende Tyramidabscheidung3zu entfernen. Mit dieser Methode können Reportermoleküle in verschiedenen Farben ein Multiplex-Ergebnis auf derselben Folie anzeigen. Die Multiplexfärbung ist auch durch die vollständige Entfernung der zuvor abgelagerten Antikörperschichten und die Ausrichtung nachträglich aufgenommener Bilder von anderen Antikörpernerreichbar 4,5. Diese Methoden liefern alle zuverlässige Ergebnisse, obwohl jede Methode ihre Grenzen hat und entweder komplizierte Verfahren oder ein spezielles Bildgebungssystem erfordert.

Das vorliegende Protokoll zeigt die Anwendung einer Antikörper-Stripping-Methode unter Verwendung allgemein verfügbarer Puffer. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Mausnebennierenabschnitten mit zwei nicht beschrifteten primär antikörpern den gleichen Wirtsarten durchzuführen.

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Protokoll

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1. Färbung mit dem ersten Antikörper

  1. FFPE-Dias mit 5 min auf jede der folgenden Schritte zuteilen: Xylol oder gleichwertige Reagenzien 3x, 100% Ethanol 2x, 95% Ethanol 1x, 70% Ethanol 1x, 50% Ethanol 1x und destilliertes Wasser 2x.
    HINWEIS: Folien sollten von diesem Rehydrierungsschritt bis zur Montage im letzten Schritt feucht bleiben.
  2. Für den optionalen Antigen-Abruf die Dias in 275 ml kochende Natriumcitratlösung (10 mM, pH = 6,0) für 8 min legen. Um die Lösung am Kochen zu halten, legen Sie die Dias flach auf die Unterseite einer 14 x 9,5 x 9 cm3 (B x L x H) Pipettenkippdose mit Deckel und Mikrowelle die Lösung auf 70% Leistung in einem 700 W Mikrowellenherd für 8 min. Dann entfernen Sie die Pipettenkippdose aus dem Mikrowellenherd, öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Lösung bei Raumtemperatur (RT) mindestens 20 min abkühlen.
  3. Übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas, das PBST enthält (phosphatgepufferte Saline mit 0,1% Polysorbat 20/80). Mit PBST für 5 min 3x waschen. Wenn Sie nicht sofort zum nächsten Schritt wechseln, lagern Sie die Dias in diesem Schritt mit PBST in einem Coplin-Glas bei RT für ein paar Stunden oder bei 4 °C für 1-2 Tage, wenn Sie nicht sofort zum nächsten Schritt übergehen.
  4. Um die Blockierlösung vorzubereiten, verwenden Sie das normale Serum der Wirtsart des sekundären Antikörpers als blockierendes Reagenz. Es können auch andere kommerzielle Blockierreagenzien verwendet werden. Wenn Sie normales Serum für die in dieser Studie vorgestellte Studie verwenden, fügen Sie 100 l normales Eselsserum zu 4,9 ml PBST hinzu. Die Sperrlösung kann bis zu 3 Tage bei 4 °C gelagert werden.
  5. Zum Blockieren den PBST von den Dias abschütteln und schnell mit einer ausreichenden Blockierlösung abdecken. Inkubieren Sie die Dias bei RT in einer befeuchteten Kammer für 30 min.
  6. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung (500 l für zwei Dias) mit der Blockierlösung vor, um den primären Antikörper auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen. Die Lösung sollte bis zur Verwendung auf Eis gelagert werden.
    1. Fügen Sie für 3-HSD 2 l 3-HSD in 498 L der Blockierlösung hinzu.
    2. Fügen Sie für TH 0,5 l TH-Antikörper in 499 l der Blockierlösung hinzu.
    3. Fügen Sie für die Blockierlösung 1 l des A-Catenin-Antikörpers in 499 l der Blockierlösung hinzu.
    4. Für 20-HSD, fügen Sie 1 l von 20-HSD-Antikörper in 499 L der Blockierlösung.
    5. Fügen Sie für CYP2F2 2 L CYP2F2-Antikörper in 498 L der Blockierlösung hinzu.
  7. Mit dem primären Antikörper bebrüten, indem sie die Blockierende Lösung von den Dias abschütteln und sie schnell mit einer ausreichenden primären Antikörperlösung abdecken. Die Dias in einer befeuchteten Kammer über Nacht bei 4 °C inkubieren. Während der Inkubation können die Dias mit einem kleinen Stück Paraffinfolie abgedeckt werden, um ein Austrocknen zu verhindern.
  8. Am nächsten Morgen waschen Sie die Rutschen mit PBST für 5 min 3x.
  9. Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung (500 l für zwei Dias) mit der Blockierlösung vor, um den biotinylierten Sekundärantikörper auf die gewünschte Konzentration zu verdünnen (z. B. 1 L Esel-Anti-Maus-Antikörper oder Esel-Anti-Kaninchen-Antikörper in 499 l Lösung). Die Lösung sollte bis zur Verwendung auf Eis gelagert werden.
  10. Mit dem zweiten Antikörper bebrüten, indem man PBST von den Dias abschüttelt und schnell mit ausreichender Sekundärantikörperlösung bedeckt. Inkubieren Sie die Dias in einer befeuchteten Kammer für 1 h bei RT.
    HINWEIS: Wenn endogenes Biotin ein Problem ist, verwenden Sie einen peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper anstelle des biotinylierten Sekundärantikörpers. Springen Sie zu Schritt 1.14, wenn Sie einen peroxidasekonjugierten Sekundärantikörper in Schritt 1.10 verwenden.
  11. Waschen Sie die Dias mit PBST für 5 min 3x.
  12. Bereiten Sie die Mitrad-Peroxidase-konjugierte Streptavidin-Lösung (SA-HRP) (500 l für zwei Dias) vor, indem Sie 0,5 l SA-HRP in 499 L PBS einzuteilen. Die Endkonzentration liegt bei 1 g/ml.
  13. Inkubieren Sie mit der SA-HRP-Lösung. Schütteln Sie PBST von den Dias ab und decken Sie die Dias schnell mit ausreichender SA-HRP-Lösung ab. Inkubieren Sie die Dias in einer befeuchteten Kammer für 0,5 h bei RT.
  14. Waschen Sie die Dias mit PBST für 5 min 3x.
  15. Bereiten Sie die Fluorophor-Tyramid-Lösung vor, indem Sie Fluorophor-Tyramid mit seinem Verdünnungspuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen (z. B. 5 l Fluorophor-Tyramid in 496 L Verdünnungspuffer).
  16. Führen Sie die Signalentwicklung mit Fluorophor-Tyramid durch Abschütteln von PBST von den Dias und schnelles Abdecken der Dias mit ausreichender Fluorophor-Tyramid-Lösung durch. Inkubieren Sie in einer befeuchteten Kammer für 1 min bei RT. Die Inkubationszeit kann angepasst werden, um die gewünschte Fluoreszenzintensität zu erhalten. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie die Dias in ein Coplin-Glas übertragen, das PBST enthält. Schlitten mit PBST für 3 min 2x waschen.
  17. Signale können schnell unter einem Fluoreszenzmikroskop überprüft werden, um das Ergebnis in diesem Stadium zu bestätigen. Wenn Keine Abdeckungen verwendet werden, tragen Sie einen Tropfen Glycerin auf jeden Abschnitt auf, um die Proben feucht zu halten. Schlitten mit PBST für 3 min 2x waschen. Die Dias können in PBST bei 4 °C für einige Tage gelagert werden, bevor Sie zum nächsten Schritt übergehen.

2. Entfernen Sie den ersten Antikörper

  1. Legen Sie die Dias in 275 ml kochende Natriumcitratlösung (10 mM, pH = 6,0) für mindestens 8 min. Halten Sie die Lösung kochend, indem Sie die Dias flach auf den Boden einer 14 x 9,5 x 9 cm3 (B x L x H) Pipettenkippe mit Deckel und Mikrowaving der Lösung auf 70% Leistung in einem 700 W Mikrowellenherd für 8 min. Wenn eine längere Abisolierzeit bevorzugt wird, kann es erforderlich sein, den Puffer mit einer kochenden Natriumcitratlösung abzuladen, um die Dias jederzeit in Pufferlösung einzutauchen. Entfernen Sie die Pipettenkippdose aus dem Mikrowellenherd, öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Lösung bei RT mindestens 20 min abkühlen.
  2. Übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas, das PBST enthält. Mit PBST für 5 min 3x waschen. Wenn der nächste Schritt nicht sofort durchgeführt wird, lagern Sie die Dias in einem Coplin-Glas mit PBST bei RT für ein paar Stunden oder bei 4 °C für 1-2 Tage.

3. Fleck mit dem zweiten Antikörper

  1. Beginnen Sie mit dem Blockierungsschritt und folgen Sie den gleichen Verfahren in Schritt 1.5 bis Schritt 1.14. Verwenden Sie bei den Signalentwicklungsschritten (Schritt 1.15 und Schritt 1.16) das Fluorophor-Tyramid in einem anderen Fluoreszenzspektrum.
    HINWEIS: Folien können mit dieser Methode mehrmals entfernt werden, um Multiplexfärbung zu ermöglichen. Der letzte Antikörper benötigt als Reporter kein Fluorophor-Tyramid. Ein fluorophorkonjugierter Sekundärantikörper könnte verwendet werden, um Signale des letzten primären Antikörpers anzuzeigen.
  2. Inkubieren Sie Dias mit 2 g/ml 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) oder Hoechst-Lösung für 1 min bei RT, wenn nukleare Gegenfärbung erforderlich ist. Dann waschen Sie die Dias mit PBST für 3 min 2x.

4. Imaging mit einem Fluoreszenzmikroskop zur Erkennung von Signalen

  1. Montieren Sie einen Deckelschlupf mit einem Tropfen Montagemedium, der für die Immunfluoreszenz geeignet ist.
  2. Verwenden Sie für die Bildgebung ein Fluoreszenzmikroskop, um Signale jedes Fluoreszenzkanals zu erkennen. Beginnen Sie mit dem Kernfärbungskanal (DAPI) und der 4x Linse, um das Gewebe auf dem Dia zu lokalisieren.
  3. Wechseln Sie zur Bildgebung auf das 10-fache Objektiv. Passen Sie die Belichtungszeit (300 ms) und die Lichtquellenintensität (80 % Intensität) an. Passen Sie diese Einstellungen an, wenn das Signal zu hell oder zu dunkel ist. Nehmen Sie Fotos von jedem Kanal auf, ohne die Bühne zu bewegen. Für jeden Kanal kann eine Neuausrichtung erforderlich sein. Führen Sie die Bilder von jedem Kanal mit der Software des Mikroskops oder ImageJ (imagej.nih.gov/ij/) zusammen.

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Ergebnisse

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Die Ergebnisse wurden aus Proben gewonnen, die mit allen beschriebenen Schritten einschließlich des Antigen-Abrufschritts 1.2 behandelt wurden. Alle hier verwendeten sekundären Antikörper wurden biotinyliert. Fluorophor-Tyramid wurde verwendet, um Signale aus dem ersten und zweiten primären Antikörper zu entwickeln. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem FITC-Würfel (für grüne Fluoreszenz), einem TxRED-Würfel (für Cy3) und einem DAPI-Würfel (für DAPI) aufgenommen.

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Diskussion

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Multiplex-Immunostaining ist nützlich, um die zelluläre Kolokalisierung von zwei oder mehr Antigenen zu untersuchen. Diese weit verbreitete Technik liefert überzeugende Kolokalisierungsergebnisse, wenn primäre Antikörper mit verschiedenen Reportern konjugiert werden (direkte Färbung). Jedoch, direkte Färbung bietet in der Regel schwächere Signale im Vergleich zu indirekten Färbung, die konjugierte sekundäre Antikörper beinhaltet, um die primären Antikörper zu erkennen. Bei der indirekten Färbung beruht ein hochwertiges M...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wird von NIH R00 HD032636 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Antifade EindeckmediumVector LaboratoriesH-1000
Biotinylierter Esel Anti-MausJacksonImmuno715-066-1511:500 Verdünnung
Biotinylierter Esel Anti-KaninchenJacksonImmuno711-066-1521:500 Verdünnung
DAPIBioLegend4228012 μ g/mL in destilliertem Wasser
FluoreszenzmikroskopECHORevolve 4
Meerrettichperoxidase-konjugiertes StreptavidinJacksonImmuno016-030-0841:1.000 Verdünnung
Mikrowelle, 700 WGeneral ElectricJEM3072DH1BB
Maus anti-CYP2F2Santa CruzSC-374540:250 Verdünnung
Maus anti-THSanta CruzSC-252691:1.000 Verdünnung
Normales EselserumJacksonImmuno017-000-1212% Serum in PBST
Kaninchen Anti-20α HSDKerafastEB40021:500 Verdünnung
Kaninchen Anti-3β HSDTransGenicKO6071:250 Verdünnung
Kaninchen anti-THNOVUSNB300-1091:1.000 Verdünnung
Kaninchen anti-β-CateninAbcamab325721:500 Verdünnung
Streptavidin Meerrettichperoxidase (SA-HRP)JacksonImmuno016-303-0841:1.000 Verdünnung
TSA Cy3 TyramidPerkinElmerSAT704B001EA1:100 Verdünnung
TSA Fluorescein TyramidPerkinElmerSAT701001EA1:100 Verdünnung
1

Referenzen

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  1. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
  2. Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).
  3. Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies. Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).
  4. Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization. PLoS One. 7 (2), e32043(2012).
  5. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
  6. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  7. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification. Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).
  8. Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype. Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).
  9. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
  10. Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).
  11. Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
  12. Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
  13. Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry. Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).
  14. Wang, H., Pevsner, J. Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology. Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).

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Schlagwörter

Mikrowellen StrippingAntigen RetrievalAvidin Biotin PeroxidaseFluoreszenzmikroskopieFFPE SchnitteAntik rper Kreuzreaktivit t

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