Probenahme und Analyse von Tierischen Duftsignalen

Zusammenfassung

Wir haben eine effektive Methodik für die Probenahme und Analyse von Geruchssignalen entwickelt, um zu verstehen, wie sie in der Tierkommunikation verwendet werden können. Insbesondere verwenden wir Headspace-Festphasen-Mikroextraktion in Verbindung mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie, um die flüchtigen Bestandteile von Tiergerüchen und Geruchsmarkierungen zu analysieren.

Zusammenfassung

Wir haben eine effektive Methodik für die Probenahme und Analyse von Geruchssignalen entwickelt, indem wir Headspace-Festphasen-Mikroextraktion in Verbindung mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie verwenden, um zu verstehen, wie sie in der Tierkommunikation verwendet werden können. Diese Technik ermöglicht die semi-quantitative Analyse der flüchtigen Bestandteile von Geruchssekreten, indem sie die Trennung und vorläufige Identifizierung der Komponenten in der Probe ermöglicht, gefolgt von der Analyse von Spitzenflächenverhältnissen, um nach Trends zu suchen, die Verbindungen bedeuten könnten, die an der Signalisierung beteiligt sein könnten. Die wichtigsten Stärken dieses aktuellen Ansatzes sind die Bandbreite der probentypen, die analysiert werden können; das Fehlen eines Bedarfs an komplexer Probenvorbereitung oder -extraktion; die Fähigkeit, die Bestandteile einer Mischung zu trennen und zu analysieren; die Identifizierung der erkannten Komponenten; und die Fähigkeit, semi-quantitative und potenziell quantitative Informationen über die erkannten Komponenten bereitzustellen. Die Haupteinschränkung der Methodik bezieht sich auf die Stichproben selbst. Da die Komponenten von spezifischem Interesse flüchtig sind und diese leicht verloren gehen oder ihre Konzentrationen verändert werden können, ist es wichtig, dass die Proben nach ihrer Entnahme angemessen gelagert und transportiert werden. Dies bedeutet auch, dass die Lagerungs- und Transportbedingungen der Proben relativ kostspielig sind. Diese Methode kann auf eine Vielzahl von Proben angewendet werden (einschließlich Urin, Kot, Haar- und Geruchssekreten). Diese Gerüche bestehen aus komplexen Mischungen, die in einer Reihe von Matrizen vorkommen, und erfordern daher den Einsatz von Techniken, um die einzelnen Komponenten zu trennen und die Verbindungen von biologischem Interesse zu extrahieren.

Einleitung

Über die chemischen Veränderungen, die den olfaktorischen Signalen bei Tieren zugrunde liegen, ist sehr wenig bekannt^1,auch wegen methodischer Herausforderungen bei der Erfassung und Quantifizierung flüchtiger chemischer Geruchsprofile². Bei der Arbeit mit hochkomplexen, chemischen Matrizen gibt es mehrere mögliche Fallstricke; Dazu gehören bei der Probenahme und Analyse der Geruchsproben³.

Am Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, führen wir die Analyse von Gerüchen und Duftmarken durch, um zu verstehen, wie sie von Tieren verwendet werden können. Wir kombinieren Semiochemie mit Verhaltensökologie, Endokrinologie und Zytologie, um die Rolle von olfaktorischen Signalen in der Tierkommunikation besser zu verstehen.

Wir haben eine Methodik entwickelt und dann Gerüche und Markierungen von einer Vielzahl von Arten analysiert, darunter mehrere nichtmenschliche Primaten (z. B. Kronenmakis, Rotrüschenmakis, japanische Makaken, Olivenpaviane, Schimpansen) und andere Säugetiere (dh Katzen, Kühe). Wir haben eine Vielzahl von Proben gesammelt und analysiert, darunter Urin, Kot, Haare und Geruchssekrete. Diese Gerüche und Duftmarken bestehen aus komplexen Mischungen von Verbindungen, und daher muss jede Methodik, die für ihre Analyse verwendet wird, eine Form von Trenntechnik enthalten. Wie dargestellt, kommen sie auch in einer Reihe von Matrizen vor, die den Einsatz von Techniken zur Extraktion der interessierenden Komponenten erfordern.

Frühere Studien von Vaglio et al.⁴ und anderen Autoren⁵ verwendeten die dynamische Headspace-Extraktion (DHS) mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS), während die direkte Lösungsmittelextraktion⁶ und komplexe Lösungsmittelextraktionen^{7 ebenfalls} verwendet wurden. Insbesondere beinhaltet die dynamische Headspace-Probenahme das Spülen des Headspace mit einem bekannten Volumen an Inertgas, das letztendlich alle flüchtigen Verbindungen entfernt, mit Ausnahme derjenigen, die eine starke Affinität zur Probenmatrix aufweisen (z. B. polare Verbindungen in bässrigen Proben).

Für die aktuelle Methodik haben wir die Technik der Headspace-Festphasen-Mikroextraktion (HS-SPME) in Verbindung mit GC-MS übernommen. Insbesondere haben wir die Methodik entwickelt und verbessert, die Vaglio et al. bereits in ihrem vorherigen GC-MS-Labor^8,9,10verwendet haben.

Lösemittellose Extraktionstechniken sind sehr effektiv für die Analyse kleiner, leicht flüchtiger Verbindungen (die sonst leicht aus einer Probe verloren gehen können), da diese Methoden Verbindungen auf einem stabilen, festen Phasenträger immobilisieren. Das HS-SPME verwendet eine mit einem Adsorbenspolymer beschichtete Faser, um flüchtige Verbindungen im Probenkopfraum einzufangen oder gelöste Verbindungen durch Eintauchen in eine wässrige biologische Flüssigkeit zu extrahieren^11. Die Polymerbeschichtung bindet die Verbindungen nicht stark, daher können sie durch Erhitzen im Einspritzanschluss des GC entfernt werden. Diese Methode ist leistungsfähiger als Lösungsmittelextraktionstechniken und auch effektiver als DHS.

Im aktuellen Ansatz sind Proben in Glasfläschchen enthalten. Diese Fläschchen werden auf eine Temperatur von 40 °C erwärmt, um die Körpertemperatur des Tieres zu simulieren, um die flüchtigen Bestandteile der Duftmarke zu fördern, um den Kopfraum der Durchstechflasche einnahm. Eine SPME-Faser, die mit 65 μm Polydimethylsiloxan/Divinylbenzol (PDMS/DVB)-Sorptionsmittel beschichtet ist, wird der Headspace-Umgebung ausgesetzt und flüchtige Komponenten aus der Probe werden an die Faser adsorbiert. Beim Erhitzen der Faser im Einlass eines GC-MS werden die flüchtigen Komponenten von der Faser dezentriert und dann durch den GC getrennt. Massenspektrale Fragmentierungsmuster werden für jede Komponente mit hilfe der MS erhalten. Durch den Vergleich dieser Massenspektren mit Massenspektraldatenbanken kann es möglich sein, die Bestandteile der Duftmarke vorläufig zu identifizieren. Durch den Einsatz eines Auto-Samplers sind wir in der Lage, mehrere Proben in Chargen konsistent zu analysieren.

Da jede Art von SPME-Faser eine unterschiedliche Affinität zu polaren Chemikalien aufweist, wird die Faser normalerweise in Abhängigkeit von der Polarität und / oder dem Molekulargewicht der chemischen Zielverbindungen ausgewählt. Darüber hinaus werden die GC-Bedingungen in Abhängigkeit von der Art der GC-Säule und den Eigenschaften der chemischen Zielverbindungen geändert.

Diese Technik ermöglicht die semi-quantitative Analyse der flüchtigen Bestandteile von Duftmarkierungen, indem sie die Trennung und vorläufige Identifizierung der Komponenten in der Probe ermöglicht, gefolgt von der Analyse von Spitzenflächenverhältnissen, um nach Trends zu suchen, die Komponenten der Duftmarkierung bezeichnen könnten, die an der Signalisierung beteiligt sein können.

Die wichtigsten Stärken dieses aktuellen Ansatzes sind:

• Der Bereich der Probentypen, die analysiert werden können.
• Es sind keine aufwändig-aufbereitung oder Extraktionen erforderlich.
• Die Fähigkeit, flüchtige Komponenten zu analysieren.
• Die Fähigkeit, die Komponenten einer Mischung zu trennen.
• Um die erkannten Komponenten identifizieren zu können.
• Die Fähigkeit, semi-quantitative und potenziell quantitative Informationen über die erkannten Komponenten bereitzustellen.

Protokoll

1. Probenentnahme

1. Probengerüche, die eine der folgenden sind:
   1. Sammeln Sie spontan, die von gewöhnungsmäßigen Studienteilnehmern (z. B. Zooprimaten) über Duftmarkierung auf Sterilfilterpapier (z. B. Geruchsdrüsengeruchsekrete) oder direkt in Fläschchen (z. B. Urin) freigesetzt werden.
   2. Sammeln Sie sterile Wattestäbchen nach dem Training der Probanden durch positives Verstärkungstraining.
   3. Sammeln Sie sterile Wattestäbchen nach der Sedierung der Studienteilnehmer.
2. Legen Sie die Proben in sterile 10-ml-Durchstechflaschen mit Schraubverschluss aus Klarglas und versiegeln Sie sie mit Schraubverschlüssen mit FTFE/Silikonsepten. Sofort bei -20 °C lagern.
   HINWEIS: Es ist wichtig, saubere persönliche Schutzausrüstung wie Nitrilhandschuhe zu verwenden. ändern Sie sie häufig; Vermeiden Sie direkten Hautkontakt mit Proben und Fläschchen. Es wird bevorzugt, brandneue Fläschchen zu verwenden; Im Falle von gebrauchten Fläschchen ist es jedoch wichtig, die Durchstechflaschen vorzureinigen und dann das gleiche Protokoll zu verwenden.
3. Nehmen Sie jedes Mal, wenn Duftflecken gesammelt werden, Umweltrohlinge. Sammeln Sie beispielsweise die Probenahmemedien (z. B. Filterpapier oder Tupfer) und eine Kopfraumfläschchen, die während der Probenahme der Umgebung ausgesetzt sind.

2. Probenvorbereitung

1. Bereiten Sie Proben im Feld vor, indem Sie mit einer Klinge ein ca. 10 mm großes Quadrat aus einem duftmarkierten Filterpapier oder dem Kopf des Tupfers schneiden und in eine 10-ml-Durchstechflasche mit verschraubtem Kopfraum legen.
2. Nachdem jede Probe vorbereitet wurde, entsorgen oder reinigen Sie die Klinge, mit der die Probenahmemedien mit einem geeigneten antibakteriellen Tuch und/oder Alkohol geschnitten und gründlich getrocknet wurden.
3. Lagern Sie alle Proben bei -20 °C.
   HINWEIS: Bevorzugt bei -20 °C oder anderweitig so niedrig wie praktisch möglich im Feld.

3. Vorbereitung der Analyse

1. Die Proben aus dem Gefrierschrank nehmen und mindestens 1 h auf natürliche Weise auf Raumtemperatur erwärmen lassen.
2. Richten Sie die Analysemethode auf dem GC-MS wie folgt ein:
   1. Befolgen Sie für SPME-Analysebedingungen die Anweisungen des Herstellers, um SPME-Fasern vor der ersten Verwendung zu konditionieren: Faservorbedingung (260 °C für 5 min), Probeninkubation (40 °C für 2 min), Extraktionszeit (15 min), Desorptionszeit (2 min) und Fasernachbedingung (260 °C für 20 min).
   2. Verwenden Sie die folgenden GC-Bedingungen: Säule (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), Injektortemperatur (270 °C), Durchfluss (1 ml/min), Injektionsmodus (splitless), GC-Ofenprofil (45 °C für 2 min; 4 °C/min bis 170 °C; 20 °C/min bis 300 °C), MSD-Transferleitung (280 °C).
      HINWEIS: Um die Konsistenz zwischen den Probenretentionszeiten zu verbessern, ist die Analysemethode die Aufbewahrungszeit gesperrt).
   3. Verwenden Sie die folgenden MSD-Bedingungen: Lösungsmittelverzögerung (2,5 min) und Scanbereich (29 bis 400 amu).
      HINWEIS: In früheren Protokollen 4 wurde ein Bereich von 10 bis⁴⁰⁰verwendet.
3. Stellen Sie sicher, dass die Spülgaszufuhr zur Faserkonditionierungseinheit eingeschaltet ist.
   HINWEIS: Es ist wichtig, dass die SPME-Baugruppe korrekt im Auto-Sampler installiert ist und dass sie auf die Auto-Sampler-Trays, die Faserkonditionierungseinheit und den GC-Einlassanschluss ausgerichtet ist. Eine falsche Ausrichtung kann zu einer Beschädigung oder Zerstörung der SPME-Faser führen.

4. Analyse

1. Platzieren Sie eine leere Headspace-Durchstechflasche (um als Systemleer zu fungieren) an der ersten Position des GC-MS-Auto-Sampler-Fachs. Platzieren Sie den Umgebungsrohling an der zweiten Position des Auto-Sampler-Fachs. Legen Sie die zu analysierenden Proben in die nachfolgenden Positionen des Automatischprobenfachs.
2. Erstellen Sie eine Analysesequenz, um jede Probe innerhalb des Probenfachs zu analysieren.
   1. Wählen Sie auf dem MassenHunter-Startbildschirm Sequenz | Lastfolge.
   2. Füllen Sie die Sequenztabelle für alle Rohlinge und Proben aus, indem Sie die entsprechenden Informationen einfügen. Speichern Sie die abgeschlossene Sequenztabelle.
      HINWEIS: Die genauen Informationen für die Sequenztabelle hängen von der Formatierung der Labore für die Tabelle ab. Zu den Mindestinformationen gehören normalerweise Probentyp, Probenname, Standort und Nummer der Durchstechflasche, Analysemethode und Speicherort und Name der Datendatei (die Zuweisung eines Datendateinamens, der mit dem Probennamen übereinstimmt, erleichtert die zukünftige Datenverarbeitung). Während der Analyse können weitere Proben zur Sequenz hinzugefügt werden.
3. Führen Sie die Sequenz aus, indem Sie Sequenz | Ablauffolge.
4. Nach der Analyse werden die Proben so schnell wie möglich in den Gefrierschrank zurückgespendet.
   HINWEIS: Es kann möglich sein, Proben erneut zu analysieren, aber es sollte beachtet werden, dass einige flüchtige Komponenten während der ersten Analyse vollständig extrahiert wurden und einige Verbindungen bei 40 ° C einer thermischen und bakteriellen Zersetzung unterzogen wurden, so dass das resultierende Chromatogramm möglicherweise nicht vollständig repräsentativ für die ursprüngliche Duftmarkierung ist.

5. Datenanalyse

HINWEIS: Die anfängliche Datenanalyse umfasst die Integration von Chromatogrammen, um Retentionszeit- und Peak-Flächendaten zu erhalten, zusammen mit der vorläufigen Identifizierung von Peaks mit der ChemStation-Software und NIST (National Institute of Standards and Technology) Massenspektraldatenbanken, Version MSD F.01.01.2317. Die Datenanalyse kann entweder manuell oder durch eine halbautomatische Methode durchgeführt werden. Wenn die halbautomatische Methode verwendet wird, ist es manchmal von Vorteil, ein gewisses Maß an manueller Datenanalyse durchzuführen, um vorläufige Identifizierungen zu überprüfen.

1. Öffnen Sie die Datendatei, indem Sie in der linken Navigationsleiste auf die entsprechende Datei klicken. Das Gesamtionenchromatogramm (TIC) wird im oberen Fenster des Datenanalysebildschirms angezeigt.
2. Um das TIC mit dem RTE-Integrator zu integrieren, wählen Sie Chromatogramm | Integrieren.
3. Passen Sie die Integrationsparameter so an, dass Spitzen, die größer als 3 x Grundlinienrauschen sind, integriert werden. Wählen Sie Chromatogramm-| MS Signal Integration Parameter. Passen Sie in der Ausgabebox die minimale Spitzenfläche entsprechend an (1.0 führt in unseren Beispielen zu akzeptablen Ergebnissen).
4. Um Spitzen zu identifizieren und einen zusammenfassenden Bericht zu generieren, wählen Sie Berichte exportieren | Bibliothekssuchergebnisse melden sich an XLS.
   HINWEIS: Die zu durchsuchenden Spektralbibliotheken müssen zusammen mit der Anzahl der anzuzeigenden Bibliotheksabweichungsabweichung in der Software voreingestellt werden, bevor eine Bibliothekssuche durchgeführt werden kann.
5. Der resultierende Tabellenkalkulationsbericht enthält Integrationsdaten für jeden Peak und eine vorläufige Spektralbibliothekszuordnung zur Zuweisung der Identität. In der Regel sollte die Übereinstimmung zwischen Bibliotheksqualität und Bibliothek >80 sein, um die vorläufige Identifizierung zu akzeptieren. Speichern Sie die Tabelle.
6. Identifizieren Sie einen Peak direkt aus dem TIC.
   1. Wählen Sie den Peak of Interest.
   2. Wenn der Peak klein ist, zoomen Sie hinein, indem Sie ein Feld um den Peak zeichnen, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten, das Feld über den Peak strecken und loslassen.
   3. Platzieren Sie die Cursorlinie so, dass sie sich am höchsten Punkt des Gipfels (oder kurz danach) befindet.
   4. Doppelklicken Sie mit der rechten Maustaste und das Massenspektrum für den Peak erscheint im unteren Fenster des Datenanalysebildschirms.
   5. Um die Spektralbibliothek zu durchsuchen, bewegen Sie den Cursor an eine beliebige Stelle im Spektralfenster und doppelklicken Sie mit der rechten Maustaste. Die Suchergebnisse der Bibliothek werden in einem neuen Fenster angezeigt.
   6. Um die Hintergrundgeräusche aus einem Interessenspektrum zu entfernen, doppelklicken Sie zunächst mit der rechten Maustaste auf den betreffenden Peak. Doppelklicken Sie dann mit der rechten Maustaste in einen Bereich ohne Spitzen unmittelbar vor dem Peak of Interest. Wählen Sie Chromatogramm-| Subtrahieren Sie Spektren. Das subtrahierte Spektrum wird im unteren Fenster des Datenanalysebildschirms angezeigt und zeigt "(-)" neben den SCAN-Daten im Fensterkopf an.

Ergebnisse

Nach diesem Protokoll identifizierten wir vorläufig insgesamt 32 flüchtige chemische Verbindungen aus der Analyse von 14 ano-genitalen Duftmarken, die spontan auf Filterpapier von Rotrüschenmakis (Varecia variegata rubra) freigesetzt wurden, und verglichen Geruchsprofile mit Merkmalen des Signalgebers¹². Natürlich vorkommende flüchtige Verbindungen wie Kohlenwasserstoffe, Terpene, Terpenalkohole und Ketone waren in diesen Profilen vorhanden und enthielten Verbindungen, von denen zuvor fes...

Diskussion

Die Verwendung von Kontrollproben, sowohl Umweltkontrollen, die zum Zeitpunkt der Probenentnahme erstellt wurden, als auch Systemrohlinge, sind entscheidend für die Interpretation der Duftmarkenproben. Alle Peaks, die der Sampling-Umgebung oder dem Instrumentssystem zugeschrieben werden, müssen von den Duftmarkenproben ausgeschlossen werden, so dass nur die Peaks von Interesse in jede Interpretation einbezogen werden. Diese Kontrollen können auch eine Rolle bei der Bewertung und Überwachung des "Zustands" der Instrumente...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
10-ml-Autosampler-Fläschchen	Agilent	5188-5392	10-ml-Fläschchen mit Schraubverschluss und
18-mm-Fläschchenkappen	Agilent	8010-0139	Magnetisch mit PTFE/Silikon-Septen
Autosampler Agilent		GC120 PAL-Autosampler
Kapillarsäule	Agilent	HP5-MS	30 m x 0,25 mm; 0,25 & Mikro; m
Datenanalysesoftware		Agilent-ChemStation
Gaschromatograph	Agilent	7890B
Einlasssepten	Agilent	5182-3442	Merlin Microseal
Massenselektiver Detektor	Agilent	5977A
Reporting-Software	Microsoft-Excel
Spektralbibliothek	NIST	-	NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library
Suchprogramm für Spektralbibliotheken	NIST-MS		Search v.2.2
Splitless Inlet	Liner Agilent	5190-4048
SPME-Fasern	Agilent	SU57345U	65 µ m PDMS/DVB-Faser