Charakterisierung der In-Vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch RNA-Seq-Analyse

Jos G.A. Smits; Jieqiong Qu; Hanna Niehues; Huiqing Zhou

doi:10.3791/60905

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Methodenartikel

Charakterisierung der In-Vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch RNA-Seq-Analyse

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DOI:

10.3791/60905

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16. Mai 2020

Jos G.A. Smits^*¹ , Jieqiong Qu^*¹ , Hanna Niehues² , Huiqing Zhou¹^,³

¹Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, ²Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, ³Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein schrittweises Verfahren zur In-vitro-Differenzierung menschlicher Primärkeratinozyten durch Kontakthemmung dargestellt, gefolgt von einer Charakterisierung auf molekularer Ebene durch RNA-seq-Analyse.

Zusammenfassung

Humane primäre Keratinozyten werden oft als In-vitro-Modelle für Studien über epidermale Differenzierung und verwandte Krankheiten verwendet. Es wurden Methoden zur In-vitro-Differenzierung von Keratinozyten berichtet, die in zweidimensionalen (2D) untergetauchten Weisen unter Verwendung verschiedener Induktionsbedingungen kultiviert wurden. Hier wird ein Verfahren zur 2D-In-vitro-Keratinozytendifferenzierungsmethode durch Kontaktinhibition und anschließende molekulare Charakterisierung durch RNA-seq beschrieben. Kurz gesagt, Keratinozyten werden in definierten Keratinozyten Medium mit Wachstumsfaktoren ergänzt, bis sie vollständig konfluent sind angebaut. Die Differenzierung wird durch enge Kontakte zwischen den Keratinozyten induziert und durch den Ausschluss von Wachstumsfaktoren im Medium weiter stimuliert. Anhand von RNA-Seq-Analysen wird gezeigt, dass beide 1) differenzierten Keratinozyten während der Differenzierung unterschiedliche molekulare Signaturen aufweisen und 2) das dynamische Genexpressionsmuster bei der epidermalen Schichtung weitgehend Zellen ähnelt. Was den Vergleich mit der normalen Keratinozytendifferenzierung betrifft, so weisen Keratinozyten, die Mutationen des Transkriptionsfaktors p63 tragen, veränderte Morphologie und molekulare Signaturen auf, die mit ihren Differenzierungsfehlern übereinstimmen. Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur 2D-In-vitro-Keratinozytendifferenzierung und deren molekulare Charakterisierung, wobei der Schwerpunkt auf der bioinformatischen Analyse von RNA-seq-Daten liegt. Da die RNA-Extraktion und die RNA-Seq-Verfahren gut dokumentiert sind, steht dieses Protokoll nicht im Mittelpunkt. Das experimentelle Verfahren der In-vitro-Keratinozytendifferenzierung und bioinformatischen Analyse-Pipeline kann verwendet werden, um molekulare Ereignisse während der epidermalen Differenzierung in gesunden und kranken Keratinozyten zu untersuchen.

Einleitung

Menschliche primäre Keratinozyten, die von der menschlichen Haut abgeleitet werden, werden oft als zelluläres Modell verwendet, um die Biologie der Epidermis¹^,²^,³^,⁴zu studieren. Die Schichtung der Epidermis kann durch Keratinozytendifferenzierung modelliert werden, entweder in 2D-Unterschicht-Manier oder 3D-Luftlift-Organotypikmodell²^,³^,⁵^,⁶^,⁷. Obwohl 3D-Modelle für die Bewertung d....