Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Tonbandzellen von gesunden Menschen, die sich einer partiellen chirurgischen Tonsillektomie unterziehen, leicht verarbeitet und kultiviert, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen.
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Methodenartikel
Isolierung von Tonsillar Mononukleären Zellen zur Untersuchung von Ex-Vivo-angeborenen Immunantworten in einem menschlichen Mukosal-Lymphgewebe
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Untersuchung isolierter Zellen aus Mukosa-assoziierten Lymphgeweben (MALT) ermöglicht das Verständnis der Reaktion von Immunzellen in Pathologien mit Schleimhautimmunität, da sie Wirtspathogen-Wechselwirkungen im Gewebe modellieren können. Während isolierte Zellen aus Geweben das erste Zellkulturmodell waren, wurde ihre Verwendung vernachlässigt, da Gewebe schwer zu erhalten sein kann. Im vorliegenden Protokoll erklären wir, wie man mononukleäre Mandelzellen (TMCs) von gesunden menschlichen Mandeln leicht verarbeiten und kulturieren kann, um angeborene Immunantworten bei aktivierung zu untersuchen und eine Virusinfektion in Schleimhautgeweben nachzuahmen. Die Isolierung von TMCs von den Mandeln ist schnell, da die Mandeln kaum Epithel haben und bis zu Milliarden aller großen Immunzelltypen erwirtschaften. Diese Methode ermöglicht den Nachweis der Zytokinproduktion mit verschiedenen Techniken, einschließlich Immunoassays, qPCR, Mikroskopie, Durchflusszytometrie usw., ähnlich wie bei der Verwendung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus Blut. Darüber hinaus weisen TMCs eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteltests auf als PBMCs, die bei zukünftigen Toxizitätstests berücksichtigt werden müssen. Daher sind ex vivo TMCs Kulturen ein einfaches und zugängliches Schleimhautmodell.
Einleitung
Studien an menschlichen Organen sind aufgrund der Zugänglichkeit sowie offensichtlicher ethischer Gründe eingeschränkt. Sie sind jedoch unerlässlich, um die Komplexität der menschlichen Biologie vollständig zu verstehen. Kulturen isolierter Zellen (Primärkulturen oder Zelllinien) sind aufgrund ihrer Verfügbarkeit ein Standardsystem in zellbiologischen Studien. Während isolierte Zellkulturen hervorragende Entdeckungen ermöglicht haben, ist die Verwendung von Zelllinien genauer unter die Lupe genommen worden, weil sie die in vivo Organbiologie nicht vollständig imitieren. Die Kultur der dreidimensionalen Zellen oder Gewebeexplanten ist jedoch hochkomplex
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Protokoll
Die Proben werden nicht speziell für Forschungszwecke gesammelt und die Studie gilt nicht als invasiv. Die Sammlung menschlicher Mandeln bedarf jedoch der ethischen Zustimmung der zuständigen Behörden vor Ort. In unserem Fall wurde es vom Comité de Protection des Personnes (IDRCB/EUDRACT: 2018A0135847) genehmigt. Darüber hinaus wird die Zustimmung jedes Patienten oder gesetzlichen Vertreters einzuholen, um die personenbezogenen Daten der Spender (z. B. Geschlecht, Alter, Geschichte von HNO-Infektionen) zu erhalten, die bei der Interpretation experimenteller Ergebnisse helfen können.
1. Umgang mit dem menschlichen Tonsillargewebe
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Ergebnisse
Wir charakterisierten zunächst das Immunprofil der in der Kultur vorhandenen Zellen und analysierten die Menge der TMCs. Wir phäphierten die TMCs aus Mandeln mit Durchflusszytometrie. Wie in Abbildung 1dargestellt, waren alle wichtigen Immunzelltypen, die in PBMCs aus Blut vorkommen, in den TMCs aus Mandeln dargestellt. Bei TMCs war die Häufigkeit aller Zelltypen mit Ausnahme von B-Zellen jedoch niedriger als bei PBMCs.
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Diskussion
Menschliche Mandeln stellen ein integratives und physiologisches Ex-vivo-Modell dar, um angeborene Immunantworten an der Schleimhautschnittstelle zu untersuchen, da sie die Rolle eines sekundären Lymphorgans imitieren. Interessanterweise ist die zelluläre Zusammensetzung der TMCs den PBMCs ähnlich und umfasst alle wichtigen Zellpopulationen, obwohl ihr Prozentsatz von PBMCs aus Blut abweichen kann (Abbildung 1). Zusätzliche Populationen können auch gefunden werden, da alle Immunantworten in .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Agence National de la Recherche sur le SIDA et les Hépatites ANRS (J-P. H) für die Experimente und Das N.B.-Stipendium (AAP 2017 166). N.S. unterstützt das ANRS für Stipendien (AAP 2016 1), die European Molecular Biology Organization EMBO for Fellowship (LT 834 2017), das Startup-Förderprogramm "Baustein" der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm (LSBN.0147) und die Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (SM 544/1 1).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 Maschen Stahlgitter - 1910 & Mikro; m | Dutscher | 198586 | Zum Einschieben in das Zellensieb Cellector |
| 60 Maschen Stahlgitter - 230 & Mikro; m | Dutscher | 198591 | Zum Einfüllen in das Zellsieb Cellector |
| 70 & micro; m weiß ClearLine Zellsiebe | Dutscher | 141379C | |
| Anios Excell D Waschmittel | Dutscher | 59852 | Detergens |
| Antibiotische Lösung, 100x | Thermo Fisher | 15140122 | 100 U/mL Penicilium und 100 μ g/mL Streptomycin - zur Zugabe zu Nährmedien |
| BD FalconTM Röhrchen mit rundem Boden, 5 mL | BD Biosciences | 352063 | FACS Röhrchen |
| Zellsieb Cellector, 85 mL und 37 mm Durchmesser | Dutscher | 198585 | |
| CellTiter-Glo (CTG) Lumineszierender Zellviabilitätsassay | Promega | G7572 | Viabilitätsassay |
| Zentrifuge 5810 | R Eppendorf | ||
| Konische Röhrchen Falcon 50 mL | Dutscher | 352070 | |
| Gebogene Pinzette | Dutscher | 711200 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Ohne Calcium und |
| Magnesium EnVision | PerkinElmer | Misst die Lumineszenz | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Zur Zugabe zu Nährmedien | ||
| Fluoreszenzmarkierungen Antikörper | Siehe Tabelle 1 | ||
| Glasstößel | Dutscher | 198599 | |
| Hepes (1 m) | Thermo Fisher | 15630056 | Verwendung im 20 |
| mM Inkubator | |||
| LEGENDplex Human Anti-Virus Response Panel | BioLegend | 740390 | Bead-basierter Immunoassay |
| Lymphoprep | StemCell | 7801 | Dichtegradientenmedium |
| Mr. Frosty Behälter | Thermo Fisher | 5100-0001 | Behälter mit langsamem Gefrieren |
| Pierce 16% Formaldehyd (w/v), Methanolfrei | Thermo Fisher | 28908 | |
| Resiquimod (R848) | InvivoGen | tlrl-r848 | TLR7/8 Agonist |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| SPL Zellkulturschale, 150 mm x 25 mm (SPL150) | Dutscher | 330009 | |
| Chirurgische Klinge steril N° 23 | Dutscher | 132523 | |
| UltraComp eBeads Compensation Beads | Thermo Fisher | 01-2222-41 | |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher | 15575020 | Zur Herstellung von Waschpuffer in PBS |
Referenzen
- Taylor, M. W. A History of Cell Culture. Viruses and Man: A History of Interactions. , 41-52 (2014).
- Scherer, W. F., Syverton, J. T., Gey, G. O.
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Nachdrucke und Genehmigungen
