Analyse von angeborenen Herzfehlern bei Mausembryonen mit qualitativen und quantitativen histologischen Methoden

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Entwicklungsphänotypen bei Mäusen, die mit angeborenen Herzfehlern assoziiert sind.

Zusammenfassung

Angeborene Herzfehler (CHD) sind die häufigste Art von Geburtsfehler beim Menschen und betreffen bis zu 1% aller Lebendgeburten. Die zugrunde liegenden Ursachen für DIE CHD sind jedoch noch immer schlecht verstanden. Die sich entwickelnde Maus stellt ein wertvolles Modell für die Untersuchung von CHD dar, da kardiale Entwicklungsprogramme zwischen Mäusen und Menschen stark konserviert sind. Das Protokoll beschreibt detailliert, wie Mausembryonen des gewünschten Schwangerschaftsstadiums hergestellt werden können, Methoden zur Isolierung und Erhaltung des Herzens für die nachgeschaltete Verarbeitung, quantitative Methoden zur Identifizierung gängiger CHD-Typen durch Histologie (z. B. ventrikuläre Septum Defekte, vorgerichtliche Septumdefekte, Patent ductus arteriosus) und quantitative Histomorphometriemethoden zur Messung gängiger Muskelverdichtungsphänotypen. Diese Methoden artikulieren alle Schritte, die bei der Probenvorbereitung, -entnahme und -analyse erforderlich sind, sodass Wissenschaftler DIE CHD korrekt und reproduzierbar messen können.

Einleitung

CHDs sind die häufigste Art von Geburtsfehler beim Menschen und sind die Hauptursache für Geburtsfehler-bedingte Todesfälle^1,2,3,4,5,6. Obwohl etwa 90% der neugeborenen Kinder CHD überleben, wird es häufig mit signifikanter Morbidität und medizinischen Interventionen im Laufe der Jahre verbunden, was eine schwere Belastung für das Leben der Patienten und das Gesundheitssystem^7,8,9,10. Außerhalb rein genetischer Faktoren sind die Ursachen der CHD schlecht verstanden⁴. Unbekannte Ursachen machen 56-66% aller CHD-Fälle nach der American Heart Association und anderen Quellen^2,3,4,11. Bekannte Faktoren sind genetische Mutationen, CNVs, de novo Single Nukleotid-Varianten und Aneuploidie. Es wird vermutet, dass Umwelt- und Ernährungsfaktoren auch wichtige Quellen sind, die zur CHD beitragen, wie epidemiologische Studien nahelegen, die den mütterlichen Lebensstil^2,12, wirtschaftliche Benachteiligung und Rasse¹³, und durch die Erforschung von Ernährungsfaktoren wie Folsäure^11,14 und die bioaktive Lipid-Retinsäure^15,16. Die Untersuchung der Mechanismen und Ursachen von CHD und anderen kardiovaskulären Defekten ist wichtig, um präventive Strategien und neuartige therapeutische Optionen zu entwickeln^1,4,17,18,19.

Die sich entwickelnde Maus ist ein Eckpfeiler modellt, um CHD bei Säugetieren zu untersuchen. Einige der angewandten Methoden und Analysen, wie z. B. Sezierungen zur Erhaltung der Herzmorphologie, Analyse von Entwicklungsstadien und Identifizierung von CHD-assoziierten Defekten, können jedoch für Wissenschaftler, die neu in der Analyse muriner Herzen sind, beängstigend sein. Das Ziel der in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ist es, qualitative und quantitative Leitlinien für diese Prozesse anzubieten. So erklären wir in diesem Protokoll, wie man zeitnahe Paarungen durchführt, um Embryonen des gewünschten Schwangerschaftsstadiums zu produzieren, schwangere Weibchen für eine intakte Herzregeneration (einschließlich assoziierter Gewebe wie dem Abflusstrakt), Herzfixierung und Kryostatschnitt, grundlegende histologische Methoden, quantitative Analysen von allgemeinen Herzfehlern und qualitative Analyse der Herzmuskelverdichtung, ein häufiger Vorläufer-Phänotyp für einige Arten von KHK.

Protokoll

Alle Tiere, die in den in diesem Papier genannten Experimenten verwendet wurden, wurden nach den Tierpflegerichtlinien des Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) behandelt.

1. Zeitliche Paarung von C57BL6/J-Mäusen für die Embryoproduktion

1. Sobald Mäuse das Brutalter erreicht haben (6-8 Wochen), stellen Sie sie in Haremszuchtformat zusammen (d.h. zwei Weibchen pro Männchen). Richten Sie sie für die Zucht irgendwann am Nachmittag oder Abend.
   HINWEIS: Mäuse brüten oft innerhalb von 1 h, nachdem die Lichter in ihrer Wohnanlage ausgeschaltet wurden. Weibchen sollten mit etwa 6-8 Monaten aus der Zucht ausgemustert werden und Männchen sollten spätestens im Alter von 12 Monaten verwendet werden.
2. Wenn Sie die Wägemethode verwenden, um die Befruchtung zu bestimmen, züchten Sie Mäuse in großen Gruppen, da die Wägemethode dazu führt, dass die zeitgezeitete Paarung langsamer verläuft als Methoden, bei denen nur Kopulationsstecker überwacht werden.
3. Überprüfen Sie am nächsten Morgen zwischen 8 und 12 Uhr auf Kopulationsstecker. Stellen Sie sicher, dass dies zu den richtigen Zeiten erfolgt. Wenn der Steckertest vor 8 Uhr durchgeführt wird, besteht die Gefahr, dass der Stecker zu tief im Vaginalkanal ist, um beobachtet zu werden. Wenn der Steckertest nach 12 Uhr durchgeführt wird, besteht die Gefahr, dass der Stecker ausfällt.
   1. Schnappen Sie sich das Weibchen an der Basis des Schwanzes und untersuchen Sie die Öffnung zum Vaginalkanal mit der Verwendung einer Mikropipette-Spitze. Ein Kopulationsstecker wird wie eine Schleimhautbarriere aussehen (Abbildung 1A), die in einigen Fällen etwas schwer zu erkennen sein könnte. Crustiness ist auch ein Hinweis darauf, dass ein Kopulationsstecker vorhanden ist oder war. Wenn es keine Schleimhautbarriere gibt (Abbildung 1B), dann hat sich das Weibchen wahrscheinlich nicht verpaart oder der Kopulationsstecker könnte bereits ausgefallen sein.
   2. Beziehen Sie sich auf den Morgen der Kopulation als e0.5.
      HINWEIS: Bei C57BL6/J-Mäusen können Kopulationsstecker schwer zu identifizieren sein. Daher paarten sich manchmal die Mäuse, obwohl kein Stecker beobachtet wurde. Kopulation führt nicht immer zur Empfängnis. Dies ist bei C57BL6/J-Mäusen oft wahrscheinlicher. Überwachen Sie daher die Gewichtsprogression, um die Schwangerschaft zu bestätigen (siehe Schritt 1.4). Die Wiege ins kann helfen, schwangere Frauen zu identifizieren und zu bestätigen, dass Stecker zur Empfängnis geführt haben. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie Weibchen für aufeinander folgende Nächte paaren. Wenn ein bestimmtes Männchen beobachtet wird, um gut bei der Herstellung eines Kopulationssteckers zu sein, kann man diesem Männchen vertrauen, dass es sich für aufeinanderfolgende Nächte mit demselben Weibchen paart.
   3. Denken Sie daran, dass die Wahrscheinlichkeit einer Schwangerschaft bei Mäusen, die bewährte Züchter sind, höher ist, da sie zuvor erfolgreich gezüchtet wurden. Um die Chancen auf bewährte Züchter zu erhöhen, sollten die verwendeten Männchen nicht zu alt sein.
4. Nach dem Stecker-Assay, wiegen Sie die Weibchen. Dieses Wiegen sollte 7-10 Tage später weiterverfolgt werden. Wenn die Gewichtszunahme 1,73 g überschreitet, dann ist die Maus wahrscheinlich schwanger²⁰. Wenn die Gewichtszunahme unter 1,73 g liegt, ist es wahrscheinlich nicht mit einer Schwangerschaft zu tun und die Maus sollte wieder in die Zuchtpopulation eingeführt werden.
   HINWEIS: C57BL6/J-Mäuse produzieren kleine Würfe (durchschnittlich fünf bis sechs Embryonen). Wiegen in Methoden, um die Schwangerschaft zu bestimmen, sind für die Mehrheit genau. Mit dieser Methode bietet eine 12,8% falsch positive Rate und wird 3% der Frauen, die tatsächlich schwanger sind²⁰. Wenn der Forscher befürchtet, dass die gewünschte Schwangerschaftszeit später ist, fahren Sie mit Schritt 1.5 fort.
5. Optional: Der Tag, an dem die Zerlegung stattfinden wird, stellen Sie sicher, dass die Schwangerschaft durch körperliche Inspektion fortgeschritten ist. Schnappen Sie sich das Weibchen an der Basis des Schwanzes und strecken Sie den Körper aus. Dies ist am einfachsten zu tun, indem Sie die Maus auf das Handgelenk legen und sanft die Basis des Schwanzes ziehen. Wenn das Weibchen schwanger ist, dann wird es wahrscheinlich Gewichtszunahme speziell im unteren Oberkörper geben, und es wird als kleine Klumpen erscheinen.
   HINWEIS: Schwangerschaft kann bereits ab e12.5 greifbar sein und wird in den meisten Fällen durch e14.5 spürbar sein. C57BL6/J-Mäuse haben kleine Wurfgrößen, daher könnte das Weibchen schwanger sein, auch wenn es keine körperlichen Anzeichen gibt.

2. Zerlegung von Weibchen und Embryonen zur Herzerholung

1. Bereiten Sie vor Beginn der Zerlegung die folgenden Lösungen bei Raumtemperatur vor.
   1. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in Phosphatgepufferter Saline (PBS) in einer Konzentration von 0,5 mM auflösen.
      HINWEIS: Nach der Vorbereitung ist es vorzuziehen, die Lösung auf Eis zu halten und nur bei 4 °C zu verwenden. Wenn eine Kontamination ein Problem darstellt, sollte sie vor der Verwendung autoklaviert werden.
   2. Paraformaldehyd (PFA) in 4% Konzentration in PBS auflösen.
      HINWEIS: Nach der Vorbereitung ist es vorzuziehen, die Lösung auf Eis zu halten und nur bei 4 °C zu verwenden. Bei 4 °C oder kälter für langzeitige Lagerung lagern. Die Konzentration der PFA-Lösung kann je nach den nachgeschalteten Anwendungen der Gewebeproben variieren. Dieser Prozentsatz wird für Hämatoxylin- und Eosinfärbung, Immunhistochemie und immunfluoreszierende Färbung verwendet.
2. Sobald das Weibchen das gewünschte Schwangerschaftsstadium erreicht hat, sollte die Maus zur richtigen Tageszeit gemäß den anerkannten Richtlinien für die Tierverwendung eingeschläfert werden. Wenn die Zeiten am halben Tag (z.B. e15.5) sind, sollten sie gegen 12 Uhr geopfert werden. Wenn die Zeiten an ganzen Tagen (z.B. e15.0) sind, sollten sie gegen 12 Uhr geopfert werden.
   HINWEIS: Es wird angenommen, dass die Empfängnis in der Nacht, in der die Mäuse gepaart sind, gegen Mitternacht auftritt. Es ist jedoch schwierig, den genauen Zeitpunkt der Empfängnis zu bestimmen. Aus diesem Grund wird das Timing geschätzt, nicht genau.
3. Nach dem Anheften der vier Gliedmaßen nach unten, sorgfältig einen I-förmigen Schnitt entlang des Oberkörpers, beginnend um die Harnröhre bis zum Brustbein.
4. Die Gebärmutter wird sich wahrscheinlich direkt über dem Beckenbereich befinden. Die Maus-Gebärmutter ist Y-förmig; daher wird es wahrscheinlich sehr lang und um den Oberkörper gewickelt sein. Entfernen Sie es, indem Sie es vorsichtig anheben. Tun Sie dies mit den Seiten der feinen Zange in einer Schaufelbewegung. Die oberflächlichen Gewebe der Gebärmutter können sehr sorgfältig von den Spitzen der feinen Zange beim ersten Herausziehen der Gebärmutter gegriffen werden. Verwenden Sie eine Schere, um die Gebärmutter aus dem Körper zu schneiden.
   HINWEIS: Achten Sie unter Berücksichtigung der ungewöhnlichen Y-förmigen Gebärmutter, stellen Sie sicher, dass die gesamte Gebärmutter entfernt wird.
5. Die Gebärmutter in eiskaltem PBS einweichen. Pin ein Ende der Gebärmutter nach unten und strecken Sie es in eine einzige Linie.
6. Schneiden Sie die Gebärmutter in Abschnitte, die jeweils einen separaten Embryo enthalten. Den Embryo vorsichtig mit feiner Zange herausziehen. Dies ist am einfachsten mit einem Paar Zangen in jeder Hand zu tun. Nach dem Entfernen den Embryo sofort in eine neue Petrischale geben, die mit PBS-EDTA-Lösung bei 4 °C gefüllt ist.
   HINWEIS: Normale PBS-Lösung kann auch verwendet werden, aber die EDTA verhindert die Gerinnung in den Proben.
7. Inszenieren Sie die Embryonen mit Theiler Staging²¹. Da die Inszenierung zwischen Embryonen innerhalb eines einzigen Wurfes variieren kann, inszenieren Sie jeden einzelnen Embryo.
   HINWEIS: Dies kann auch eine Voraussicht in die möglichen angeborenen Herzfehler in den Embryonen bieten. Typischerweise können Symptome eines angeborenen Herzfehlers in der embryonalen Morphologie beobachtet werden. Andere größere Defekte, die oft mit bestimmten Herzerkrankungen verbunden sind, können vorhanden sein.
8. Das Herz kann auf verschiedene Weise entfernt werden, abhängig vom Alter des Embryos.
   HINWEIS: Wenn unklar ist, ob der Abflusstrakt während der Entfernung intakt bleibt, entfernen Sie entweder mehr Gewebe als nur das Herz (den Abflusstrakt intakt zu halten und den direkten Kontakt zwischen Herz und Zange zu minimieren) oder analysieren Sie den gesamten Embryo.
   1. Positionieren Sie den Embryo mit einem Sezierbereich und zwei Paarfeinern auf dem Rücken und stabilisieren den Zugang zur Brust. Dies kann durch anheften die Arme mit der Zange oder das Entfernen der Arme und halten den Oberkörper in Position zu tun.
   2. Verwenden Sie den scharfen Punkt eines zweiten Paarfläschen, um einen Schnitt entlang des Brustbeins des Embryos zu machen und sich zwischen den Clavusen bis zum Nabel zu erstrecken. Beginnen Sie mit sehr feinen und oberflächlichen Schnitten, während Sie allmählich auf das Innere der Brusthöhle hinarbeiten. Das Herz sollte kaum sichtbar werden. Kontaktieren Sie sie während dieser oberflächlichen Schnitte nicht mit der Zange.
   3. Den Rippenkäfig mit dem ersten Zangenpaar offen ziehen, um sanft auf den Rumpf des Embryos zu drücken, leicht kaudal zum Rippenkäfig. Das Herz sollte herausspringen oder sichtbar werden. Das Herz kann einige sanfte Koaxing erfordern, um herauszukommen. Verwenden Sie die Seite der Zange, um sicherzustellen, dass der Punkt der Zange nie in Kontakt mit dem Herzen kommt. Um den Arbeitsbereich und die Zange sauber zu halten, halten Sie ein fusselfreies Wischen in der Nähe.
   4. Greifen Sie vorsichtig die Lungenblutgefäße mit den Seiten der Zange, stellen Sie sicher, dass das Gewebe nicht zu trennen, und ziehen Sie das Herz aus der Brusthöhle. Dann reinigen Sie das Herz.
      HINWEIS: Bei Embryonen e13.5 und jünger wird das Herz durch das Perikard abgedeckt. Diese muss entfernt werden, um das Herz zu erreichen.
9. Mit einem Stereoskop, nehmen Sie ein Foto des Herzens für spätere Referenz.
10. Spülen Sie die Herzen in PBS-EDTA-Lösung für 1-2 min, und legen Sie sie dann in 4% PFA-Lösung für ca. 45-60 min, um sie zu beheben. Wenn die Analyse des gesamten Embryos gewünscht wird, über Nacht einweichen. Das Volumen der PFA-Lösung sollte 5-6x das Volumen des zu fixierenden Gewebes betragen.
    HINWEIS: Diese Inkubationszeit kann je nach späteren Studien variieren. Diese Inkubationszeit wird für Hämatoxylin- und Eosinfärbung, Immunhistochemie und immunfluoreszierende Färbung verwendet.
11. 5-10 min mit PBS-Glycin 3x waschen und wieder in PBS geben. Natriumazid oder Penicillin/Streptomycin kann auch hinzugefügt werden, um das Bakterienwachstum zu minimieren und intaktes Gewebe zu erhalten. Die Herzen können nun kurzfristig bei 4 °C gelagert werden.

3. Gewebevorbereitung

HINWEIS: Gewebe können entweder mit OCT (optimale Schnitttemperatur) Einbettung oder Paraffineinbettung hergestellt werden. Es gibt Vor- und Nachteile für beide Methoden, und das Ziel der Analyse sollte bei der Entscheidung, welche Einbettungsmethode verwendet werden soll, berücksichtigt werden.

1. OCT-Einbettung
   HINWEIS: Diese Methode kann der Einbettung von Formalin/Paraffin vorzuziehen sein, da Kryosections die Antigenreaktivität erhalten, immer noch für Hämatoxylin- und Eosinfärbungen verwendet werden können und Scheiben schneller produzieren.
   1. Bereiten Sie eine In-PBS gelöste Saccharoselösung mit einer Konzentration von 30 % (w/v) vor.
   2. Übertragen Sie das Gewebe in ein neues 15 ml konisches Rohr oder 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das PBS-30% Saccharose enthält. Zunächst wird das Gewebe schweben.
   3. Legen Sie es bei 4 °C in den Kühlschrank. Das Gewebe wird bereit für OCT Einbettung bereit sein, wenn es auf den Boden des Rohres sinkt, in der Regel in 24-40 h.
      HINWEIS: Muskelgewebe leiden während frost-/tauenzyklen erheblich und verlieren ihre native Morphologie. Saccharose wird vom Gewebe absorbiert und wirkt als Kryokonservierungsmittel, das eine verbesserte Konservierung der Morphologie ermöglicht. Stellen Sie sicher, dass genügend Lösung im Rohr vorhanden ist, damit das Schwimmen der Gewebe ausreichend überwacht werden kann. PBS-Saccharose ist leicht mit Bakterien kontaminiert, so überprüfen Sie die Lösung häufig auf Trübung, die entweder Pilz oder bakterielle Überwucherung zeigt. Um das Kontaminationsrisiko zu minimieren, kann der PBS-Saccharoselösung entweder Penicillin/Streptomycin oder Natriumazid zugesetzt werden.
   4. Entfernen Sie die Herzen mit einer Pasteur Pipette, stellen Sie sicher, dass das Öffnen der Pipette breit genug ist, um das Gewebe nicht zu reißen. Schneiden Sie die Pipette bei Bedarf mit einer Schere. Wenn Sie mit ganzen Embryonen arbeiten, verwenden Sie Zangen, um die Probe abzurufen.
      HINWEIS: Tun Sie dies vorsichtig. Auch wenn die Pipetteöffnung breit genug ist, um die Herzen zu bergen, können die Ränder der Pipette das Gewebe noch reißen. Zangen können Gewebeproben einrücken, wenn sie zu aggressiv verwendet werden.
   5. Lassen Sie das Gewebe kurz auf einem fusselfreien Wisch trocknen. Legen Sie die Probe in einer OCT-Form in die gewünschte Position zum Schneiden (d. h. sagittal, quer, koronal). Fügen Sie OCT-Verbindung hinzu, bis die Probe vollständig untergetaucht ist, um sicherzustellen, dass keine Blasen in Kontakt mit dem Gewebe sind.
   6. Legen Sie die Form bei -20 °C über Nacht oder mehrere Tage und bewegen Sie die Form dann auf -80 °C. Nach 24 h ist die Form zum Kryosektionen bereit. Gewebe in diesem Format können langfristig gelagert werden.
2. Paraffin Einbettung
   1. Mit Ethanol, dehydrieren Sie das Gewebe in dieser Folge: 50% Ethanol für 10 min, 70% Ethanol für 10 min, 80% Ethanol für 10 min, 95% Ethanol für 10 min, 100% Ethanol für 10 min (do this 3x).
   2. Das Gewebe in einer Reihe von Ethanol/Xylol-Lösungen in dieser Folge einweichen: 2:1 Ethanol/Xylol-Lösung für 10-15 min, 1:1 Ethanol/Xylol-Lösung für 10-15 min, 1:2 Ethanol/Xylol-Lösung für 10-15 min, 100% Xylol für 10-15 min (do this 3x).
   3. Um das Xylol durch Paraffin zu ersetzen, Das Gewebe in einem Vakuumofen (zwischen 54-58 °C) in dieser Folge einweichen: 2:1 Xylol/Paraffinlösung für 30 min, 1:1 Xylol/Paraffinlösung für 30 min, 1:2 Xylol/Paraffinlösung für 30 min, 100% Paraffin für 1-2 h, 100% Paraffin für 1-2 h oder über Nacht.
      HINWEIS: Wenn sie das Gewebe über einen längeren Zeitraum über 60 °C erhitzen, werden die Paraffinpolymere abgebaut und das Gewebe spröde.
   4. Mit frischem Paraffin, betten Sie das Gewebe in der gewünschten Position.

4. Kryostatschnitt für OCT-Eingebettete Gewebe

1. Legen Sie am Kryostat alle Proben mindestens 1 h ins Innere, wenn die Proben zuvor im Gefrierschrank -80 °C gelagert wurden. Sie sollten dort bleiben, bis alle Abschnitte gesammelt sind.
2. Stellen Sie sicher, dass der Kryostat auf die richtigen Temperatureinstellungen eingestellt ist. Die Umgebungstemperatur in der Kryostatkammer sollte bei etwa -20 °C und der Arm des Kryostats bei etwa -24 °C liegen.
   HINWEIS: Diese Temperatur kann variieren, je nachdem, wie der Block auf das Schneiden reagiert. Wenn inkonsistentes Schneiden ein Problem ist, könnte die Temperatur der Umgebung gesenkt werden.
3. Entfernen Sie den OCT-Block aus seiner Form, indem Sie an den Rändern der offenen Seite der Form ziehen, um ihn zu lösen, und dann den Block am geschlossenen Ende kneifen, wo sich die Form verengt.
4. Um den OCT-Block zu montieren, legen Sie die Raumtemperatur OCT auf das Futter, beginnend von der Mitte und arbeiten bis zum Rand. Das gesamte Futter muss nicht abgedeckt werden.
5. Legen Sie den OCT-Block (siehe Schritt 3.1) auf die Form. Die Kante des Blocks, die gegen die geschlossene Seite der Form war, sollte nach oben auf dem Futter sein. Lassen Sie das OCT auf dem Futter einfrieren, bis es undurchsichtig weiß ist, ca. 5-10 min.
6. Legen Sie das Futter auf den Arm für weitere 5-10 min für den Block auf die Armtemperatur zu kommen. Um eine parallele Scheibe zu erhalten, passen Sie den Arm so an, bis der Rand des Blocks parallel zur Bühne ist und es einen gleichmäßigen Abstand zwischen der Bühne und dem unteren Rand des Blocks gibt, der mit der Bühne und dem oberen Rand des Blocks identisch ist.
7. Legen Sie die Klinge ein, und passen Sie den Abstand des Blocks von der Klinge an, um Abschnitte zu nehmen.
8. Nehmen Sie Scheiben mit einer Dicke von 10 m. Schneiden Sie so lange, bis der Point of Interest entweder manuell oder mit der Trimmfunktion erreicht ist.
9. Um Scheiben zu sammeln, verwenden Sie einen kleinen flachen Pinsel und einen Detailpinsel. Wenn die Form zu schneiden beginnt, verwenden Sie die flache Bürste, um die Scheibe vorsichtig gegen den Ständer zu ziehen. Beim Durchschneiden der Probe muss die Bewegung kontinuierlich und ohne Pause sein, obwohl die Geschwindigkeit von der Festigkeit der Probe abhängen kann.
10. Verwenden Sie beim Schneiden die flache Bürste, um die Scheibe vorsichtig zu lenken, während sie hergestellt wird. Die Scheibe muss an dieser Stelle nicht bündig mit der Bühne sein, also lassen Sie sie, um keine Risse oder Züge zu verursachen und die Histologie zu beeinflussen.
    HINWEIS: Beim Schneiden ganzer Embryonen kann dieser Teil besonders schwierig sein, insbesondere wenn Gewebetypen gewechselt werden. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben ohne Pausen gemacht werden und der Pinsel nicht zu aggressiv an den Scheiben zieht. Wenn sich gewebetypen ändern, kann die Scheibe brechen, daher ist es entscheidend, die Temperatur kalt zu halten. Wenn Bruch ein Problem ist, verringern Sie die Temperatur oder erhöhen Sie die Dicke der Probe.
11. Halten Sie die Bewegung des Blocks an, sobald die Probe vollständig durchgeschnitten ist, aber die Scheibe ist noch nicht frei vom Block. Ohne den flachen Pinsel aus der Scheibe zu bewegen, verwenden Sie den Detailpinsel, um die Scheibe nach unten zu klopfen, um sie flach zu machen und gegen die Bühne einzufrieren.
12. Halten Sie die Scheibe dort für 10 s, bevor Sie den Detailpinsel entfernen und die Scheibe fertigstellen. Verwenden Sie die beiden Pinsel, um die Scheibe sanft gegen die Bühne abzuflachen, ein Rollen zu verhindern und sie für 20-30 s auf die Bühne zu stellen.
13. Drehen Sie die Scheibe und flachen Sie wieder gegen die Bühne. Bewegen Sie eine elektrostatisch geladene Folie so nah, dass die Scheibe angezogen werden kann, und haften Sie an der Folie, ohne die Folie zur Bühne berühren zu müssen. Beschriften Sie die Folien mit einem Bleistift.
14. Bewahren Sie die Dias in einer luftdichten Box auf, um das Gewebe während der Lagerung vor Eisbildung zu schützen. Für die kurzfristige Lagerung sollten Dias vor der Färbung bei -20 °C gelagert werden. Für die Langzeitlagerung bei -80 °C aufbewahren.

5. Mikrotomschnitt für Paraffin-eingebettete Gewebe

1. Legen Sie die Blöcke vor dem Schnitt auf Eis, um die Proben zu kühlen. Wenn sie kühl sind, schneidet Paraffin leichter und kann dünnere Scheiben produzieren.
2. Bereiten Sie ein 40-45 °C Wasserbad mit Reinstwasser vor.
3. Legen Sie die Klinge in den Halter innerhalb des Mikrotom. Stellen Sie sicher, dass es sicher ist, und stellen Sie dann den Abstandswinkel ein. Stellen Sie sicher, dass der Abstandswinkel korrekt ist. Dies kann nach den Anweisungen des Herstellers überprüft werden.
4. Legen Sie den Paraffinblock in das Mikrotome. Stellen Sie sicher, dass es richtig ausgerichtet ist, so dass die Klinge gerade über den Block schneidet.
5. Stellen Sie sicher, dass die Klinge korrekt mit dem Block ausgerichtet ist, indem Sie ein paar Scheiben machen. Tun Sie dies sorgfältig, damit Anpassungen vorgenommen werden können.
6. Trimmen Sie den Block, bis der Point of Interest erreicht ist.
7. Machen Sie Scheiben in der gewünschten Dicke. Berücksichtigen Sie, dass die ersten Slices wahrscheinlich verworfen werden.
8. Nehmen Sie die Abschnitte auf und bewegen Sie sie mit Zangen ins Wasserbad. Dadurch sollten die Abschnitte abgeflacht werden. Verwenden Sie die Zange, um sie nach Bedarf anzupassen.
9. Bewegen Sie eine elektrostatisch geladene Rutsche so nah, dass die Scheibe angezogen und an der Folie haften kann. Beschriften Sie die Folien mit einem Bleistift.
10. Platzieren Sie alle gesammelten Dias in einem Dia-Rack. Lassen Sie die Dias über Nacht bei 37 °C trocknen.

6. Entparaffinierung von Geweben

1. Die Dias in der folgenden Reihenfolge waschen: 3 min in Xylol (2x), 3 min in einer 1:1 Xylol/100% Ethanollösung, 3 min in 100% Ethanol (2x), 3 min 95% Ethanol, 3 min in 70% Ethanol, 3 min in 50% Ethanol.

7. Hämatoxylin- und Eosinfärbung

1. Bereiten Sie die Folien für die Färbung vor.
   1. Wenn Sie OCT-vorbereitetes Gewebe verwenden, in destilliertem Wasser für 4 min einweichen, bis OCT aufgelöst ist und trocknen lassen.
   2. Bei Verwendung von Paraffin-eingebetteten Geweben müssen diese deparaffinisiert werden. Siehe Schritt 6.1.
2. Legen Sie die Rutsche 10 min in gefiltertes 0,1% Hämatoxylin. Legen Sie die Rutsche in destilliertes Wasser, wechseln Sie das Wasser sofort und dann wieder nach 3 min.
3. Legen Sie die Rutsche in 0,5% Eosin für 10 s oder tauchen Sie 12x. Tauchen Sie die Rutsche in destilliertes Wasser, bis das Eosin nicht mehr streifen, etwa 2-3 Dips.
4. Dehydrieren Sie den Schlitten, indem Sie 50% Ethanol für 10 s, 75% Ethanol für 10 s, 95% Ethanol für 30 s und 100% Ethanol für 1 min. In Xylol tauchen, bis Xylol glatt herauskommt, 5-7 Dips.
5. Lassen Sie Xylol verdampfen und montieren Sie es mit einem schnell trocknenden Montagemedium, das einen Brechungsindex in glasnähe hat.

8. Qualitative Analyse von allgemeinen Herzfehlern

1. Nehmen Sie Bilder aller Proben mit einem invertierten oder Stereomikroskop und der entsprechenden Kamera auf. Nehmen Sie makroskopische und mikroskopische Bilder, abhängig von der Art der analysierten Defekte. Makroskopische Bilder können mit jeder Vergrößerung unter 10x aufgenommen werden. Mikroskopische Bilder sollten bei 40-facher Vergrößerung oder höher aufgenommen werden. Die Fotos, die in diesem Papier aufgenommen wurden, wurden mit 5-facher Vergrößerung mit einem Stereomikroskop und einem 40-fachen Luftobjektiv (Objektiv N.A. von 0,55) mit einem invertierten Mikroskop aufgenommen.
   HINWEIS: Makroskopische Bilder sind ein guter Ausgangspunkt, da sie eine Ansicht auf das gesamte Herz bieten (Abbildung 3). Wenn sich Muster identifizieren, können bestimmte Bereiche fokussiert und weiter untersucht werden.
2. Richten Sie alle Bilder nebeneinander auf einem Computerbildschirm aus. Haben Sie alle Bilder von Kontrollproben auf einer Seite des Bildschirms und alle Bilder von experimentellen Proben auf der anderen Seite des Bildschirms. Es ist am besten, eine Behandlungsgruppe nach der anderen zu analysieren.
3. Achten Sie auf Unterschiede in den Phänotypen zwischen den Behandlungsgruppen, beginnend bei Schlüsselbereichen, in denen häufige Herzfehler auftreten. Dies hängt davon ab, ob die Bilder makroskopisch sind, die grobe Anatomie des Herzens darstellen, oder mikroskopisch, die mikroskopische Anatomie des Herzgewebes darstellen.
4. Beginnen Sie mit der Suche nach häufigen makroskopischen Herzfehlern, wie ventrikulären Septumdefekten (Abbildung 2A), vorgerichtlichen Septumdefekten (Abbildung 2B) und Patent ductus arteriosus (Abbildung 2C). All diese Defekte sind am leichtesten in der Quersicht des Herzens zu erkennen.
5. Um Septumdefekte zu identifizieren, sollten Sie mehrere Scheiben betrachten, da sie in einer Ebene des Gewebes und nicht in einer anderen beobachtet werden könnten.
   HINWEIS: Manchmal ist ein Defekt nicht das Fehlen eines Septums, sondern ein Loch im Septum. Achten Sie daher darauf, einen Riss nicht mit einem Septaldefekt zu verwechseln. Die Suche nach Konsistenzen zwischen nahe gelegenen Slices in einer bestimmten Region kann bestätigen, ob es sich tatsächlich um einen Defekt oder einen Riss beim Schneiden handelt.
6. Um Defekte im Abflusstrakt zu identifizieren, wie z. B. den Patentductus arteriosus, verwenden Sie mehrere Scheiben, um den wichtigsten Blutgefäßen beim Verlassen des Herzens zu folgen. Erstellen Sie ein Bild der wichtigsten Blutgefäße relativ zueinander. Ein Beispiel ist in Abbildung 2Cdargestellt.
   HINWEIS: Einige Unregelmäßigkeiten können auf das Entwicklungsstadium eines Embryos zurückzuführen sein (z. B. schließt der Patent ductus arteriosus postnatal kurz nach der Geburt; das ventrikuläre Septum schließt sich erst ab 14,5). Einige andere häufige makroskopische Herzfehler, die nicht in den Zahlen enthalten sind, sind persistente truncus atereriosus, die am einfachsten bei e16.5 und höher erkannt werden können; Doppelauslass rechter Ventrikel (DORV), der in Scheiben nachgewiesen werden kann, in denen das Herz in den Abflusstrakt gelangt; und eine übergeordnete Aorta²². Ein häufiger mikroskopischer Herzfehler beinhaltet verminderte Muskelverdichtung (Abbildung 4).

9. Quantitative Analyse der Herzmuskelverdichtung mit Hämatoxylin und Eosin-gefärbten Geweben

1. Anhand der makroskopischen Ansicht der gebeizten Gewebeproben (Abbildung 4A) identifizieren Sie einen Bereich von Interesse, der mit einer 40-fachen Vergrößerung abgebildet ist (Abbildung 4B). Für dieses Papier wurde die Wand des linken Ventrikels verwendet. Speichern Sie das Bild im gewünschten Format. Für dieses Papier wurden Bilder als .tif-Dateien gespeichert.
2. Öffnen Sie das Bild in der ImageJ-Software.
3. Stellen Sie das Bild auf 8 Bit ein. Dadurch kann das Bild das Schwellenwertwerkzeug im nächsten Schritt^23,24verwenden. Wählen Sie dazu "Bild | Typ | 8-Bit".
4. Legen Sie den Schwellenwert für das Foto fest. Der Zweck dieses Schritts besteht darin, nur die Pixel auszuwählen, die den Hintergrund darstellen, mit Ausnahme der Pixel, die die Gewebe^23,24darstellen.
   HINWEIS: Diese Fläche wird später subtrahiert. Ein korrekter Schwellenwert wählt die Pixel aus, die der Forscher aus der Oberfläche des Muskelgewebes ausschließen möchte. Daher sollte das Endergebnis das Gewebe in Graustufen enthalten und der Hintergrund wird ausgewählt.
   1. Klicken Sie auf "ImageJ | Bild | Anpassen | Schwelle". Bewegen Sie die obere Leiste, um Schwellenwertanpassungen vorzunehmen. Schließen Sie das Fenster für Schwellenwertanpassungen, ohne weitere Änderungen vorzunehmen, sobald die gewünschten Abschnitte ausgewählt sind²¹.
5. Verwenden Sie das Werkzeug Polygonauswahl, um den Platz auszuwählen, den das Gewebe einnimmt. Stellen Sie sorgfältig sicher, dass die Umrisse die Geweberänder nachzeichnen, da lose Spuren falsche Messungen liefern.
6. Passen Sie die Messeinstellungen auf ImageJ so an, dass die Software nur den Pixelbereich misst, der mit dem Schwellenwertwerkzeug in Schritt 9.4²³ausgewählt wurde. "ImageJ | Analysieren | Festlegen von Messungen | Fläche und Limit auf Schwellenwert". Wählen Sie nur Fläche und Limit auf Schwellenwertaus.
7. Messen Sie den Bereich der hervorgehobenen Pixel. "ImageJ | Analysieren | Maß". Dieser Wert stellt den Bereich des negativen Raums dar.
8. Messen Sie die Fläche der gesamten Interessenregion. Dies ist der Bereich, der mit dem Werkzeug Polygonauswahl ausgewählt wurde. "Bild J | Analysieren | Festlegen von Messungen | Bereich". Wählen Sie nur Bereich aus, und deaktivieren Sie die Option Limit to Threshold. Dann messen, wählen Sie "Bild J | Analysieren | Maß".
9. Berechnen Sie den Bereich, den das eigentliche Muskelgewebe innerhalb des Interessenbereichs belegt. Subtrahieren Sie die Fläche des negativen Raums von der Fläche der gesamten Interessensregion. Dieser Wert ist der Bereich des Muskelgewebes.
10. Berechnen Sie den Muskelverdichtungsindex (MCI). Teilen Sie den Bereich des Muskelgewebes durch den Bereich der Region von Interesse.
    
    Je größer der MCI-Wert, desto verdichteter ist der Muskel. Diese MCI-Werte können dann für statistische Analysen verwendet werden, um signifikante Veränderungen in der Muskelverdichtung zwischen Behandlungsgruppen zu testen (Abbildung 4C).

Ergebnisse

Der Muskelverdichtungsindex wurde zwischen Herzen verglichen, die sich unter zwei verschiedenen Umgebungen, einer Steuerung und einer experimentellen Gruppe, entwickeln. Diese Protokolle wurden verwendet, um die Verdichtung von Muskelgewebe quantitativ zu analysieren, was statistische Analysen ermöglichte. Die Muskelverdichtung zeigte sich in den Versuchsherzen signifikant reduziert im Vergleich zu den Embryonen, die sich unter nichtexperimentellen Bedingungen entwickelten.

Diskussion

Dieses Protokoll untersucht die Techniken, die an der Analyse der Herzentwicklung in embryonalen Herzen beteiligt sind. Einige Einschränkungen dieser Methode sind die erforderliche körperliche Geschicklichkeit für die Vorbereitenden Techniken, die Übung erfordern können, und Geschicklichkeit mit Mikroskop-Bildgebung. Wenn die am Kryostat erhaltenen Scheiben chaotisch sind, die Hämatoxylin- und Eosinfärbung nicht klar ist, oder wenn die am Mikroskop aufgenommenen Bilder eine schlechte Beleuchtung haben, dann funktioniert ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL konische RöhrchenFisher	Scientific	# 1495970C
C57BL/6J Mäuse	Jackson Labs	C57BL/6J - Lager 000664
Coplin Färbegläser (x6)	VWR Scientific	# 25457-006
Deckgläser 24X50MM #1,5	VWR Scientific	# 48393-241
Kryostat - Leica CM3050S	Leica	N/A
Präparierschale(n)	Fisher Scientific	# 50930381
Dumont #5 - Feine Pinzette (x2)	Fine Science Tools	# 11254-20
Eosin Y Lösung	Millipore Sigma	# HT110116-500ML
Ethylalkohol (rein, 200 proof)	Fisher Scientific	# BP2818-500
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Millipore Sigma	# E9884-100G
Eukitt	Millipore Sigma	03989-100ML
Feine Schere	Fine Science Tools	# 14060-10
Fluoreszierendes Stereomikroskop Leica M165 FC	Leica	N/A
Glycin	Millipore Sigma	410225-250G
Graefe Pinzette	Fine Science Tools	# 11052-10
Graphpad Prism 8 Software	Graphpad
ImageJ Software	ImageJ
Kimwipes	Fisher Scientific	# 06666A
Mayer's Hämatoxylin-Lösung	Millipore Sigma	# MHS16-500ML
Mikropipettenspitze(n) - p200	Fisher Scientific	# 02707448
Microsoft Excel Software	Microsoft
OCT Compound	VWR Scientific	# 102094-106
Olympus CkX53 Mikroskop	Olympus
Pinsel (mindestens 2)
Paraformaldehyd	VWR Scientific	# 0215014601	In 4%ige Lösung verwandeln (gelöst in PBS)
Pasteurpipette(n)	Fisher Scientific	# 13-711-7M
Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	# 15140122
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	ThermoFisher Scientific	# 70011044	Vor Gebrauch von 10x auf 1x verdünnen
Waage	Mettler Toledo	# MS1602TS
Waage	Mettler Toledo	# MS105
Skalpellgriff #3	VWR Scientific	# 10161-918
Skalpellklingen	VWR Scientific	# 21909-612
Quadratische Form	VWR Scientific	# 100500-224	Für OCT-Formen
Saccharose	Millipore Sigma	S9378-500G
Superfrost Plus Objektträger	Fisher Scientific	# 1255015
Chirurgische Schere	Fine Science Tools	# 14002-14
Tissue-Tek Accu-Edge Einweg-Mikrotomklingen	VWR Scientific	# 25608-964
Reisewaage	Acculab	VIC 5101
Xylol	Millipore Sigma	214736-1L