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Saccharosepräferenz und Neuheit-induzierte Hypophagie-Tests bei Ratten mit einem automatisierten Lebensmittelaufnahme-Überwachungssystem

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DOI:

10.3791/60953

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8. Mai 2020

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1Charité Center for Internal Medicine and Dermatology, Department for Psychosomatic Medicine, Charité-Universitätsmedizin, Corporate Member of Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin and Berlin Institute of Health, 2Department of Internal Medicine, Helios Clinic, 3Department of Psychosomatic Medicine and Psychotherapy, University Hospital Tübingen, 4Department of Quantitative Health Sciences, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Untersuchung des depressiven und anhedonischen Verhaltens bei Ratten vorgestellt. Es kombiniert zwei etablierte Verhaltensmethoden, die Saccharosepräferenz und neuheitsinduzierte Hypophagie-Tests, mit einem automatisierten Lebensmittel- und Flüssigkeitsaufnahmeüberwachungssystem, um indirekt das Verhalten von Nagetieren mit Ersatzparametern zu untersuchen.

Zusammenfassung

Die Prävalenz und Inzidenz depressiver Störungen nimmt weltweit zu und betrifft etwa 322 Millionen Menschen, was die Notwendigkeit von Verhaltensstudien in Tiermodellen unterstreicht. In diesem Protokoll, um depressiv-ähnliches und anhedonisches Verhalten bei Ratten zu studieren, werden die etablierte Saccharosepräferenz und neuheitsinduzierte Hypophagie-Tests mit einem automatisierten Lebensmittel- und Flüssigkeitsaufnahmeüberwachungssystem kombiniert. Vor dem Testen, in der Saccharose Präferenz Paradigma, männliche Ratten sind für mindestens 2 Tage trainiert, um eine Saccharose-Lösung zusätzlich zu Leitungswasser zu konsumieren. Während des Tests werden Ratten erneut Wasser und Saccharoselösung ausgesetzt. Der Verbrauch wird jede Sekunde vom automatisierten System erfasst. Das Verhältnis von Saccharose zur Gesamtwasseraufnahme (Saccharosepräferenzverhältnis) ist ein Ersatzparameter für Anhedonia. Im neuartigen Hypophagie-Test durchlaufen männliche Ratten eine Trainingsphase, in der sie einem schmackhaften Snack ausgesetzt sind. Während des Trainings zeigen Nagetiere eine stabile Basissnackaufnahme. Am Testtag werden die Tiere aus heimischen Käfigen in einen frischen, leeren Käfig gebracht, der eine neuartige unbekannte Umgebung mit Zugang zum bekannten schmackhaften Snack darstellt. Das automatisierte System zeichnet die Gesamtaufnahme und die zugrunde liegende Mikrostruktur auf (z. B. Latenz, um sich dem Snack zu nähern) und gibt Einblicke in anhedonische und ängstliche Verhaltensweisen. Die Kombination dieser Paradigmen mit einem automatisierten Messsystem liefert detailliertere Informationen sowie eine höhere Genauigkeit durch Reduzierung von Messfehlern. Die Tests verwenden jedoch Ersatzparameter und stellen Depressionen und Anhedonia nur indirekt dar.

Einleitung

Im Durchschnitt sind 4,4 % der Weltbevölkerung von Depressionen betroffen. Diese machen weltweit 322 Millionen Menschen aus, 18 % mehr als vor zehn Jahren1. Nach Schätzungen der Weltgesundheitsorganisation wird Depression im Jahr 2020 im Ranking der behindertengerechten Lebensjahre an zweiter Stelle stehen2. Um der zunehmenden Prävalenz affektiver Störungen entgegenzuwirken und neue interventionsbezogene Strategien zu etablieren, ist es notwendig, dieses Verhalten weiter zu untersuchen. Vor und zusätzlich zur Untersuchung am Menschen sind Tierversuche notwendig.

Mehrere Modelle wurden etabliert, um Komponenten des depressiven Verhaltens zu untersuchen (d.h. erzwungener Schwimmtest, Schwanzsuspensionstest, Saccharosepräferenztest und neuheitsinduzierte Hypophagie)3,4. Der Saccharose-Präferenztest (SPT) und die neuartige Hypophagie (NIH) können depressives Verhalten bei Tieren erkennen. Diese Tests selbst induzieren keinen Depressionszustand bei Nagetieren, sondern zeigen akute Verhaltensänderungen. Sowohl der SPT als auch das NIH bewerten eine charakteristische Eigenschaft der Depression, die als Anhedonia bekannt ist, d. h. den Verlust des Interesses an folgenden Themen: lohnende Aktivitäten, Aktivitäten, die einst von den einzelnen5genossen wurden, und ein Aspekt des komplexen Phänomens der Verarbeitung und Reaktion auf Belohnung6. Beide Tests untersuchen die Reaktion auf einen lohnenden Stimulus in Form von schmackhaften Lebensmitteln. Der Umfang des Verbrauchs dient als Ersatzparameter für Anhedonia7,8,9.

Der Wert von Tests zur Untersuchung von Anhedonia hängt stark von der genauen Bestimmung des Verbrauchs ab, die sich aus der genauen Messung des Substanzgewichts ergibt. Üblicherweise wird diese Messung einmal und einmal nach dem Test manuell durchgeführt. Dies ist jedoch aus mehreren Gründen anfällig für fehlerhafte Messungen. Zuerst neigen Nagetiere dazu, Nahrung zu horten, was bedeutet, dass sie Nahrung entfernen, ohne sie sofort zu konsumieren, dann verstecken sie sie an einem sicheren Ort. Somit kann dieser Lebensmittelverlust in die Berechnung des Gesamtverbrauchs einbezogen werden. Zweitens verschütten Ratten Nahrung und Wasser, was zu Gewichtsverlust ohne entsprechenden Verbrauch führt. Drittens kommt es durch den Umgang mit den Flaschen durch Einsetzen und Entfernen aus Käfigen zu einem unbeabsichtigten Flüssigkeitsverlust.

Um diese Fehlerquellen zu reduzieren, haben wir die beiden gemeinsamen Tests zur Bewertung von Anhedonia (SPT3,4 und NIH9) mit der Messung der Lebensmittel- und Wasseraufnahme mit einem automatisierten Lebensmittel- und Flüssigkeitsaufnahmeüberwachungssystem kombiniert. Dieses Verfahren ermöglicht eine genaue Untersuchung des Konsums von schmackhaften Substanzen sowie Informationen über die Erfahrung des Vergnügens bei Ratten als Merkmal des depressiven Verhaltens. Die oben genannten Fehler im Zusammenhang mit der manuellen Messung werden durch verschiedene Ansätze reduziert, die später ausführlicher veranschaulicht werden.

Um Informationen über Mikrostruktur bereitzustellen, wiegt das in diesem Protokoll10 verwendete automatisierte Ansaugüberwachungssystem die Lebensmittel (±0,01 g) pro Sekunde. So wird ein stabiles Gewicht als "nicht essen" und ein instabiles Gewicht als "Essen" dokumentiert. Ein "Bout" ist definiert als Änderung des stabilen Gewichts vor und nach einem Ereignis. Eine Mahlzeit besteht aus einem oder mehreren Anfällen und ihre Mindestgröße bei Ratten wurde als 0,01 g definiert. Eine Mahlzeit wird von einer anderen Mahlzeit bei Ratten durch 15 min getrennt (standardisierter Wert). So wird die Nahrungsaufnahme als eine Mahlzeit betrachtet, wenn die Anfälle innerhalb von 15 min aufgetreten sind und die Gewichtsänderung gleich oder größer als 0,01 g ist. Zu den in diesem Protokoll bewerteten Mahlzeiten sind die Essensdauer, die Zeit, die in den Mahlzeiten verbracht wird, die Kampfgröße, die Kampfdauer, die Inlandszeit, die Latenz bis zum ersten Kampf und die Anzahl der Kämpfe.

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Protokoll

Tierpflege und experimentelle Verfahren folgten den spezifischen institutionellen Ethikrichtlinien und wurden von der staatlichen Behörde für Tierforschung genehmigt.

1. Betrieb des automatisierten Überwachungssystems

HINWEIS: Beim Betrieb des automatisierten Überwachungssystems ist es wichtig, jede Aktion im Kommentarfeld, das in der Software enthalten ist, unmittelbar vor der Aktion zu dokumentieren. Die Beschreibung sollte in das Kommentarfeld eingegeben werden, und durch Drücken von Speichernwird sie mit einem bestimmten Zeitpunkt gespeichert. Die Zeitpunkte sind bei der Analyse der Daten signifikant, da das System kontinuierlich zeichnet und der Zeitraum von Interesse für die Analyse angegeben werden muss.

  1. Installation, Verwendung und Wartung des automatisierten Überwachungssystems
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet erwachsene männliche Sprague Dawley Ratten mit einem Gewicht von 250–300 g (ca. 10 Wochen alt). Es wird empfohlen, Ratten während der Akklimatisierungsphase in Gruppen unterzubringen. Die Umgebungsbedingungen sollten mit folgenden Parametern kontrolliert werden: 12 h/12 h Dunkel-/Lichtzyklus mit eingeschaltetem Licht um 6:00 A.M., Luftfeuchtigkeit von 45%–65% und Temperatur von 21–23 °C und ad libitum Zugang zu Wasser und Standard-Nagetierernährung. Der tägliche Umgang ermöglicht es den Tieren, sich an die Ermittler zu gewöhnen.
    1. Trennen Sie die Ratten, so dass jedes Tier einen individuellen Käfig hat. Stellen Sie sicher, dass jede Ratte während des Protokolls getrennt bleibt.
    2. Füllen Sie die Gehäusekäfige mit normaler Bettwäsche mit einer 1–2 cm dicken Schicht. Diese (reduzierte) Menge verringert die Möglichkeit einer Kontamination von Mikrowaagen und Trichtern durch Verschüttung und reduziert so Messfehler. Fügen Sie Kunststoffrohre (z. B. ein 20 cm langes Stück eines Kunststoff-Ablaufrohres mit einem Durchmesser von 8 cm) und nagendes Holz als Anreicherung hinzu, während Papiergewebe weggelassen wird, um Messfehler zu reduzieren.
    3. Bereiten Sie die Käfige für die automatisierte Messung der Feststoff- und Flüssignahrungsaufnahme vor, indem Sie zwei geschlossene Käfighalterungen mit Mikrowaagen an maßgeschneiderten Löchern in der Vorderseite der Käfige befestigen. Legen Sie zwei leere Trichter auf die Käfighalterungen, einen für das Chow und einen für die Flasche.
      HINWEIS: Die Mikrowaagen werden über Kabel an ein an einen Computer angeschlossenes Aufnahmesystem angeschlossen und die entsprechende Software auf dem Computer installiert.
    4. Um mit der Aufnahme zu beginnen, öffnen Sie "Monitor" und drücken Sie "Start", und wählen Sie dann einen Ort aus, an dem die Daten gespeichert werden sollen.
    5. Mit der Kalibrierungsfunktion (Drücken "Kalibrieren") des automatisierten Ansaugüberwachungssystems können Sie jede Waage kalibrieren, indem Sie die Trichter entfernen und zwei unterschiedliche Gewichte auf den Käfighalterungen mit Waagen platzieren. Tun Sie dies in regelmäßigen Zeitabständen (wöchentlich wirdempfohlen).
    6. Füllen Sie einen Trichter vollständig mit Chow (ca. 100 g) und entfernen Sie Chow-Stücke und Crumbles, die zu klein sind. Füllen Sie das Wasser in die Flasche (ca. 100 ml) und legen Sie es in den anderen Trichter.
    7. Dokumentieren Sie die Position von Nahrung und Wasser (z. B. Gleichgewicht 1: Futtertier 1, Gleichgewicht 2: Wassertier 1).
    8. Legen Sie die Ratte in den Käfig und öffnen Sie alle Tore der Käfighalterungen, damit sie ad libitumessen und trinken kann.
      HINWEIS: Für eine genaue Messung ist es notwendig, die Waagen und Trichter täglich zu halten, indem sie sanft mit einer Bürste vor dem Verschütten gereinigt und kleine Lebensmittelkrümel aus dem Lebensmittelbehälter entfernt werden. Dadurch wird die fehlerhafte Messung erheblich reduziert. Schließen Sie alle Tore während der täglichen Wartung.
  2. Zugriff auf Daten nach den Experimenten
    1. Suchen Sie im Kommentarfeld nach den Anfangs- und Endzeitpunkten eines Zeitraums (z. B. Training, Test), der analysiert werden muss.
    2. Klicken Sie auf "Daten anzeigen" auf der Software, um den Data Viewer zu öffnen.
    3. Fügen Sie die Zeitpunkte in die Felder unter "Startzeit" und "Endzeit" ein. Drücken Sie das Quadrat in der linken oberen Ecke, das den Saldo angibt, der die Informationen aufgezeichnet hat.
    4. Klicken Sie auf "PSC Totals", um auf die Mikrostrukturdaten zuzugreifen. Drücken Sie die Taste "PSC-Tabelle exportieren", um die Daten zu exportieren.
      ANMERKUNG: Um die Mikrostruktur einzelner Tiere (z. B. unbelastet vs. gestresst) mittels automatisierter Überwachung zu vergleichen, können einzelne Tiere im"Datenbetrachter" ausgewählt werden, indem das entsprechende Quadrat in der linken oberen Ecke gedrückt wird. Die PSC Totals zeigt nur die Mikrostruktur für das ausgewählte Tier an. Statistische Analysen können nicht mit dem System durchgeführt werden. Die Daten müssen in ein Tabellenkalkulationsprogramm/Analysesoftware extrahiert werden.

2. Durchführung des Saccharosepräferenztests

  1. Durchführung der Ausbildung
    HINWEIS: Vor dem Test müssen die Tiere an die Verfügbarkeit von zwei Flaschen für Flüssigkeiten auf Trichtern durch die Tore gewöhnt sein, während Lebensmittel von den Decken der Käfige bereitgestellt werden sollten (Einrichtung ist in Abbildung 1dargestellt). Diese Ausbildung sollte mindestens 2 Tage dauern. Es wird in den Hauskäfigen in dem Raum durchgeführt, in dem die Tiere gehalten werden.
    1. Schließen Sie alle Tore. Entfernen Sie die Wasserflasche und den Lebensmittelbehälter aus den Mikrowaagen.
    2. Legen Sie vorgewogene Lebensmittel (ca. 50 g) auf die Oberseite des Käfigs und dokumentieren Sie ihr Gewicht täglich mit einem regelmäßigen Gleichgewicht, um den täglichen Lebensmittelverbrauch zu bewerten. Nachfüllen, falls erforderlich.
    3. Reinigen Sie eine Flasche mit klarem Wasser und füllen Sie sie mit ca. 100 ml Wasser auf. Legen Sie es wieder auf den Trichter.
    4. Füllen Sie eine zweite saubere Flasche mit 100 ml frisch hergestellter 1% Saccharoselösung. Legen Sie es auf den Trichter.
      HINWEIS: Markieren Sie die Flaschen sorgfältig und dokumentieren Sie ihre Standorte (z. B. Waage 1: Wassertier 1, Balance 2: Saccharoselösung Tier 1).
    5. Öffnen Sie alle Tore. Dokumentieren Sie den Beginn der Schulung im Überwachungssystem. Lassen Sie die Tore für 24 h offen, was zu ad libitum Zugang zu beiden Flaschen. Nach 24 H, schließen Sie die Tore und dokumentieren das Ende des Trainings. Daten aus dem 24-Stunden-Intervall können mit dem automatisierten Überwachungssystem ausgewertet werden, indem die "Anfangszeit" und "Endzeit" eingefügt werden. Die Verfahren sind die gleichen, wenn ein 1 h Testintervall bewertet wird.
    6. Reinigen und füllen Sie die Flaschen alle 24 h. Frische 1% Saccharoselösung täglich zubereiten. Schalten Sie die Position der Wasser- und Saccharoselösungsflasche täglich, um Gewöhnungseffekte zu vermeiden.
      ANMERKUNG: Führen Sie das Training bei allen Tieren mindestens 48 h durch, bis die Präferenzverhältnisse 1 erreichen. Das Saccharose-Präferenzverhältnis wird direkt nach dem Training mit dem "Data Viewer" bewertet. Er wird als Verhältnis der Saccharoseaufnahme zur Gesamtaufnahme (Wasser- und Saccharosezufuhr) berechnet.
    7. 24 h vor dem Test, entfernen Sie die Flasche mit der Saccharoselösung, so dass die Ratte nur Zugang zu Standard-Chow und Wasser hat.
    8. Bereiten Sie eine frische Flasche mit Leitungswasser und eine mit einer 1% Saccharoselösung gefüllt, beide mit 100 ml.
    9. Schließen Sie vor dem Testen alle Tore.
    10. Entfernen Sie die mit Leitungswasser gefüllte Flasche aus dem Trichter und legen Sie die beiden frischen Flaschen, eine mit Leitungswasser und eine mit einer 1% Saccharoselösung gefüllt, auf den Trichter.
    11. Öffnen Sie alle Gates, dokumentieren Sie den Start des Tests im Überwachungssystem. Lassen Sie die Tore für 60 min offen. Schließen Sie die Tore nach 60 min und dokumentieren Sie das Ende des Tests.
    12. Bewerten Sie die Daten (z. B. das Saccharose-/Gesamtflüssigkeitsaufnahmeverhältnis).
      HINWEIS: Der Test kann mehrmals mit Intervallen des Trainings (mindestens 2 Tage) dazwischen wiederholt werden.

3. Durchführung des neuartigen Hypophagietests

  1. Durchführung der Ausbildung
    HINWEIS: Vor dem Testen wird eine tägliche 30-Minuten-Trainingszeit von 5 Tagen empfohlen (Einrichtung ist in Abbildung 2dargestellt). Ziel ist es, vor dem Experiment eine stabile Ausgangsbasis für die schmackhafte Snackaufnahme zu erreichen. Es wird in den Hauskäfigen in dem Raum durchgeführt, in dem die Tiere gehalten werden.
    1. Schließen Sie alle Tore und entfernen Sie den Trichter mit Standard-Chow.
    2. Füllen Sie einen frischen Trichter mit dem schmackhaften Snack (ca. 50 g). Setzen Sie die Cracker vorsichtig in den Trichter ein, um ein Zerbröckeln zu vermeiden. Legen Sie den Trichter auf die Käfighalterung auf der Mikrowaage.
    3. Öffnen Sie die Tore für 30 min, so dass die Ratte ad libitum Zugang zum Snack und Wasser hat. Dokumentieren Sie den Beginn der Ausbildung im Überwachungssystem.
      HINWEIS: Die Ratte sollte während des Trainings keinen Zugang zu Standard-Chow haben.
    4. Schließen Sie die Tore nach 30 min und dokumentieren Sie das Ende der Ausbildung im Überwachungssystem. Ersetzen Sie den Snack durch Standard-Chow.
    5. Wiederholen Sie dies täglich, bis eine 1) stabile, schmackhafte Snackaufnahme erreicht ist (z. B. 1,5–2,0 g/30 min) und 2) die Aufnahme zwischen den Trainingstagen statistisch nicht unterschiedlich ist.
  2. Durchführung des neuartigen Hypophagietests
    1. Bereiten Sie einen leeren, frisch gereinigten Käfig vor, ohne dass das automatisierte Lebensmittelaufnahmeüberwachungssystem mit Einstreu oder Anreicherung versehen ist. Legen Sie einen Trichter mit einer Flasche Leitungswasser und Trichter mit einem schmackhaften Snack auf die Käfighalterungen.
      HINWEIS: Der neuartige Käfig sollte in demselben Raum untergebracht werden, in dem die Ratten gehalten und trainiert werden. Halten Sie die Tore geschlossen.
    2. Entfernen Sie die Ratte aus dem Hauskäfig und legen Sie sie in den neuartigen Käfig.
    3. Öffnen Sie alle Tore für 30 min. Dokumentieren Sie den Beginn der Tests im Überwachungssystem.
      HINWEIS: Während der 30 min des Zugangs zum Snack werden die Größe der Snackaufnahme und die zugrunde liegenden Mikrostrukturparameter (z. B. Latenz bis zur ersten Mahlzeit) mit dem automatisierten System zur Überwachung der Nahrungsaufnahme aufgezeichnet.
    4. Schließen Sie die Tore nach 30 min und dokumentieren Sie das Ende der Tests. Legen Sie die Ratte wieder in den heimischen Käfig.
      HINWEIS: Der Test kann mehrmals mit Intervallen des Trainings (mindestens 5 Tage) dazwischen wiederholt werden.

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Ergebnisse

Um die Datenverteilung zu testen, wurde der Kolmogorov-Smirnov-Test verwendet. T-Tests wurden verwendet, wenn Daten normal verteilt wurden und Mann-Whitney-U-Test verwendet wurde, wenn nicht. Einweg-ANOVA gefolgt von Tukey Post-hoc-Test wurde für normal verteilte Mehrfachgruppenvergleiche verwendet. Einweg-ANOVA gefolgt von Dunns Mehrfachvergleichstest wurde in Fällen von Nicht-Normalverteilung verwendet. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden als signifikant angesehen, wenn p < 0,05.

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Diskussion

Die Saccharosepräferenz und neuheitsinduzierte Hypophagie-Tests sind zwei etablierte Techniken zur Bewertung von Anhedonia bei Ratten. Ihre Kombination mit dem automatisierten Lebensmittelaufnahmeüberwachungssystem ermöglicht eine detailliertere Analyse bei ungestörten Ratten und reduziert fehlerhafte Messungen.

Die Fehlerhäufigkeit wird durch unterschiedliche Ansätze verringert. Erstens, um den Fehler zu beheben, der durch Verschütten auftritt, ermöglicht die Lücke zwischen dem Lebensmittelbe...

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Offenlegungen

A.S. ist Berater für a & r Berlin, Boehringer-Ingelheim, Takeda und Schwabe. Es bestehen keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (STE 1765/3-2) und der Charité Universitätsförderung (UFF 89/441-176, A.S.) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Montage LH Cage Mount - RAT-FOOD - beinhaltet Edelstahl-Käfighalterung, Trichter, Blocker, KupplungResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCMPRF01
Montage LH Cage Mount unplugged - RAT - FOOD beinhaltet Edelstahl-Käfighalterung, Trichter, Blocker, unplugged Adapter, KupplungResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCMUPRF01
Käfig mit 2 Öffnungen - RAT - kundenspezifisch modifizierter Käfig - beinhaltet Käfigaufsatz und Standard-WasserflascheResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCR02Einzelgehäuse
Datenerfassung Laptop Windows - Konfiguriert mit BioDAQ SoftwareResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABLT003
Anreicherung (Plastikrohre, Nageholz),verteilt von der Tiereinrichtung
HoneyMaid Graham Cracker CrumbsNabisco, East Hanover, NJ, USAASIN:schmackhafter Snack für NIH-Test
vibrationsarmes PolymergestellResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABRACKR
männlich Sprague Dawley RattenEnvigoBestellcode: 002
Modell #2210 32x Port BioDAQ Central Controller - inklusive Kabel und KalibrierungskitResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABCC32_03
Peripheriesensor-Controller - einschließlich KabelResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABPSC01
SigmaStat 3.1Systat Software, San Jose, CA, USAstatistische Analyse
EdelstahlblockerResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USABBLKR
Standard-Nagetierdiät mit 10 kcal% FettResearch Diets, Inc., Jules Lane, New Brunswick, NJ, USAD12450B
SaccharosepulverRoth4621.1für SPT
B01COWTA98

Referenzen

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