Ein Rattenmodell von Drucküberlastung induziert moderate Remodeling und systolische Dysfunktion im Gegensatz zu overt systolische Herzinsuffizienz

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Erstellung eines Rattenmodells von drucküberlastinduzierter moderater Umgestaltung und frühsystolischer Dysfunktion, bei der Signaltransduktionswege aktiviert werden, die an der Einleitung des Umbauprozesses beteiligt sind. Dieses Tiermodell wird bei der Identifizierung molekularer Ziele für die Anwendung von frühtherapeutischen Anti-Remodeling-Strategien für Herzinsuffizienz helfen.

Zusammenfassung

Als Reaktion auf eine Verletzung wie Myokardinfarkt, verlängerte Hypertonie oder ein kardiotoxisches Mittel passt sich das Herz zunächst durch die Aktivierung von Signaltransduktionswegen an, um kurzfristig dem Herzmyozytenverlust und der Zunahme von Wandstress entgegenzuwirken. Eine längere Aktivierung dieser Bahnen wird jedoch nachteilig, was zur Einleitung und Ausbreitung des Herzumbaus führt, was zu Veränderungen der linksventrikulären Geometrie und zu einer Zunahme der linksventrikulären Volumina führt; phänotyp bei Patienten mit systolischer Herzinsuffizienz (HF). Hier beschreiben wir die Erstellung eines Rattenmodells von Drucküberlastung induzierte moderate Remodellierung und frühe systolische Dysfunktion (MOD) durch aufsteigende Aortenbanding (AAB) über einen Gefäßclip mit einem innenfläche von 2 mm². Die Operation wird in 200 g Sprague-Dawley Ratten durchgeführt. Der MOD HF-Phänotyp entwickelt sich 8-12 Wochen nach AAB und wird durch Echokardiographie nichtinvasiv charakterisiert. Frühere Arbeiten schlagen die Aktivierung von Signaltransduktionswegen und veränderter Genexpression und posttranslationalen Modifikationen von Proteinen im MOD HF-Phänotyp vor, die diejenigen imitieren, die im humanen systolischen HF gesehen werden; daher ist der MOD HF Phänotyp ein geeignetes Modell für die translationale Forschung, um potenzielle therapeutische Anti-Remodeling-Ziele in HF zu identifizieren und zu testen. Die Vorteile des MOD HF Phänotyps gegenüber dem unüben systolischen HF-Phänotyp besteht darin, dass er die Identifizierung molekularer Ziele ermöglicht, die am frühen Umbauprozess beteiligt sind, und die frühe Anwendung therapeutischer Interventionen. Die Einschränkung des MOD HF Phänotyps ist, dass er das Spektrum der Krankheiten, die zu systolischen HF beim Menschen führen, möglicherweise nicht imitiert. Darüber hinaus ist es ein anspruchsvoller Phänotyp zu schaffen, da die AAB-Operation mit hoher Mortalität und Ausfallraten verbunden ist, wobei nur 20% der operierten Ratten den gewünschten HF-Phänotyp entwickeln.

Einleitung

Herzinsuffizienz (HF) ist eine weit verbreitete Krankheit und ist mit hoher Morbidität und Mortalität^{verbunden 1}. Nagetier-Druck-Überlast-Modelle (PO) von HF, die durch aufsteigende oder transversale Aortenbanding hergestellt werden, werden häufig verwendet, um molekulare Mechanismen zu erforschen, die zu HF führen, und um potenzielle neuartige therapeutische Ziele in HF zu testen. Sie imitieren auch Veränderungen, die bei humanem HF sekundär zu längerer systemischer Hypertonie oder schwerer Aortenstenose beobachtet wurden. Nach PO nimmt die linke ventrikuläre (LV) Wand allmählich an Dicke zu, ein Prozess, der als konzentrische LV-Hypertrophie (LVH) bekannt ist, um die Erhöhung der LV-Wandspannung zu kompensieren und anzupassen. Dies ist jedoch mit der Aktivierung einer Reihe von maladaptiven Signalwegen verbunden, die zu Derangements im Kalziumkreislauf und Homöostase, metabolischer und extrazellulärer Matrix-Umgestaltung und Veränderungen der Genexpression sowie verbesserter Apoptose und Autophagie^2,3,4,5,6führen. Diese molekularen Veränderungen sind der Auslöser für die Initiierung und Ausbreitung des myokardischen Umbaus und des Übergangs in einen dekompensierten HF-Phänotyp.

Trotz der Verwendung von inzuchtfarbenen Nagetierstämmen und der Standardisierung der Clipgröße und der chirurgischen Technik gibt es eine enorme phänotypische Variabilität in der LV-Kammerstruktur und -funktion in den Aortenbandmodellen^7,8,9. Die phänotypische Variabilität nach PO in Ratte, Sprague-Dawley-Stamm, wird an anderer Stelle beschrieben^10,11. Von diesen, zwei HF-Phänotypen sind mit Beweisen für myokarddiale Remodellierung und Aktivierung von Signaltransduktionswegen, die zu einem Zustand von erhöhtem oxidativem Stress. Dies ist verbunden mit metabolischer Umgestaltung, veränderter Genexpression und Veränderungen in der posttranslationalen Modifikation von Proteinen, die insgesamt eine Rolle im Umbauprozess^{spielen 10,12}. Der erste ist ein Phänotyp der moderaten Umgestaltung und frühen systolischen Dysfunktion (MOD) und der zweite ist ein Phänotyp von overt systolischen HF (HFrEF).

Das PO-Modell von HF ist vorteilhaft gegenüber dem Myokardinfarktmodell (MI) von HF, da die PO-induzierten Umfangs- und Meridionalwandspannungen homogen auf alle Segmente des Myokards verteilt sind. Beide Modelle leiden jedoch an Variabilität in der Schwere von PO^10,,11 und in Infarktgröße^13,14 zusammen mit intensiven Entzündungen und Narben bildung an der Infarktstelle¹⁵ sowie Haftung an der Brustwand und umgebenden Geweben, die im MI-Modell von HF beobachtet werden. Darüber hinaus ist das Ratten-PO-induzierte HF-Modell eine Herausforderung zu schaffen, da es mit einer hohen Sterblichkeit und Ausfallraten^{von 10}verbunden ist, wobei nur 20% der operierten Ratten den MOD HF-Phänotyp¹⁰entwickeln.

Der MOD ist ein attraktiver HF-Phänotyp und stellt eine Weiterentwicklung des traditionell erstellten HFrEF-Phänotyps dar, da er eine frühzeitige Ausrichtung von Signaltransduktionswegen ermöglicht, die eine Rolle bei der Myokard-Remodellierung spielen, insbesondere wenn es um Störungen in der mitochondrialen Dynamik und Funktion, myokarden Stoffwechsel, Kalzium-Zyklus und extrazellulären Matrix-Remodeling geht. Diese pathophysiologischen Prozesse sind beim MOD HF Phänotyp¹¹sehr deutlich. In diesem Manuskript beschreiben wir, wie man die MOD- und HFrEF-Phänotypen erstellt, und wir behandeln Fallstricke bei der Durchführung des aufsteigenden Aortenbandings (AAB). Wir erläutern auch, wie wir die beiden HF-Phänotypen MOD und HFrEF am besten durch Echokardiographie charakterisieren können und wie man sie von anderen Phänotypen unterscheidet, die keine schwere PO entwickeln oder schwere PO- und konzentrische Umbauten entwickeln, aber ohne signifikante exzentrische Umgestaltung.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden und Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Tulane University School of Medicine genehmigt.

1. Werkzeuge und Instrumente für die Erstellung von AAB-Modellen

1. Besorgen Sie sich Desinfektionsmittel wie 70% Isopropylalkohol und Povidon-Jod.
2. Erhalten Sie Ketamin und Xylazin für Anästhesie und Buprenorphin für Analgesie.
3. Erhalten Sie ein Heizkissen und schwere Saugfähigkeit Einweg-Unterpad mit den Abmessungen von 18 Zoll x 30 Zoll.
4. Erhalten Sie eine 100% Baumwoll-Bindfädenrolle, ein Klebeband und einen Haarschneider.
5. Erhalten Sie eine 20 cm x 25 cm Kunststoffplatte, Dicke Bereich zwischen 3-5 mm.
6. Erhalten Sie einen Z-LITE Glasfaser-Beleuchtungser.
7. Besorgen Sie sich ein mechanisches Beatmungsgerät für Kleintiere (z. B. SAR-830/AP).
8. Erhalten Sie 2-0 und 3-0 Vicryl Verjüngung Nähte und Nylon 3-0 Monofilament Naht, sterile Gaze Pads und sterile extra große Baumwollspitzen und sterile Handschuhe.
9. Erhalten Sie 16 G Angiocath für die Intubation.
10. Kaufen Sie die folgenden chirurgischen Werkzeuge.
    1. Besorgen Sie sich eine Weck Edelstahl-Hemoclip-Ligation und Edelstahl-Ligating-Clips.
    2. Erhalten Sie gehärtete feine Irisschere.
    3. Erhalten Sie Adson Zangen.
    4. Erhalten Sie zwei gekrümmte Graefe Zangen.
    5. Besorgen Sie sich eine Halsted-Mosquito Hemostats-straight Zange.
    6. Erhalten Sie einen Mayo-Hegar Nadelhalter.
    7. Erhalten Sie einen Alm Brustretraktor mit stumpfen Zähnen.
11. Verwenden und erhalten Sie einen Autoklaven und einen Perlensterilisator.

2. Aufsteigende Aortenbanding chirurgischen Eingriff

1. Anästhesisieren Sie das Tier mit einer intraperitonealen Injektion einer Mischung aus 75-100 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin.
   HINWEIS: Lassen Sie ein paar Minuten, damit das Tier vollständig sediert und schlaff ist. Wenn die Anästhesiedosis nicht ausreicht und sich das Tier immer noch im Käfig bewegt, injizieren Sie das Tier mit der gleichen Anästhesiedosis, nachdem es genügend Zeit gelassen hat, etwa 5-10 Minuten zwischen den nachfolgenden Injektionen. Die meisten Tiere benötigen 1-2 Injektionen, um eine tiefe Sedierung und Anästhesie zu erreichen.
2. Rasieren Sie das Haar an der chirurgischen Stelle im rechten seitlichen Brustbereich unter der rechten Achselhöhle.
3. Stabilisieren Sie das Tier, indem Sie alle vier Gliedmaßen sanft auf das Plastikbrett kleben. Dann führen Sie endotracheale Intubation mit einem 16 G Angiocath. Nachdem das Tier erfolgreich intubiert wurde, initiieren Sie eine mechanische Belüftung mit Gezeitenvolumen von 2 ml bei 50 Zyklen/min und FiO₂ von 21%. Achten Sie auf den symmetrischen Anstieg in der Brustwand mit jedem Atemzug.
4. Drehen Sie das Tier langsam auf der linken Seitenseite liegen, und biegen Sie dann den Schwanz in einer U-Form-Manier und stabilisieren Sie es, indem Sie es sanft auf das Plastikbrett kleben. Dann gehen Sie vor und desinfizieren Sie den rasierten Bereich mit topischer Anwendung von Povidon-Jod.
5. Infiltrieren Sie die Haut an der Einschnittstelle mit 50/50 Mischung nach Volumen von 1-2% Lidocain/0,25-0,5 % Bupivacaine als präventive Analgesie, bevor sie den Schnitt macht.
6. Führen Sie einen rechten horizontalen Hautschnitt, 1-2 Zentimeter lang, im rechten Achselbereich 1 cm unterhalb der rechten Achselhöhle durch. Dann sezieren Sie die thorakale Muskelschicht, bis sie den Brustrippenkäfig erreicht. Machen Sie eine 1 cm Thorakotomie zwischen dem^2. und^3. Rippenkäfig.
   1. Achten Sie beim Sezieren der Muskelschicht der Brust darauf und vermeiden Sie Verletzungen der rechten Achselarterie, die unter der rechten Achselhöhle verläuft.
      HINWEIS: Die Thorakotomie, die zwischen der^1. und der^2. Rippe durchgeführt wird, birgt das Risiko, die rechte brachiocephalische Arterie anstelle der aufsteigenden Aorta zu bandieren. Die Thoraxtomie zwischen der^3. und der vierten Rippe macht es schwierig, die aufsteigende Aorta zu visualisieren und zu bandieren, da der Bediener auf das rechte Atrium schaut.
      HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Thorakotomie zu medial auf das Brustbein auszudehnen, um zu vermeiden, dass die rechte innere Brustarterie seziert und verletzt wird.
7. Sezieren Sie die beiden Lappen der Thymusdrüse sanft und schieben Sie sie seitlich auseinander. Identifizieren Sie dann die aufsteigende Aorta und isolieren Sie sie durch stumpfe Zerlegung durch eine gekrümmte Graefe-Zange von der überlegenen Vena cava.
   HINWEIS: Signifikante Manipulation der Thymusdrüse wird es geschwollen und macht es schwierig, die aufsteigende Aorta zu visualisieren.
   1. Sezieren Sie die überlegene Vena cava aus der Aorta mit besonderer Vorsicht, um Verletzungen oder Brüche der überlegenen Vena cava zu vermeiden, die tödlich ist. Dies kann der schwierigste Teil des Verfahrens sein und wird von Zeit zu Zeit auch in den meisten erfahrenen Händen passieren, aber oft mit Anfängern und Lernenden.
8. Heben Sie sanft die aufsteigende Aorta mit einer gekrümmten Graefe Zange an und platzieren Sie den Gefäßclip um die aufsteigende Aorta.
   1. Stellen Sie das vaskuläre Hämoclip-Ligationswerkzeug über ein vorgeschnittenes 7-Prozent-Stück aus Kunststoff ein, um einen Gefäßclip der gewünschten Innenfläche von 1,5 mm² oder 2 mm²zu erhalten, je nachdem, welches HF-Modell gewünscht wird.
9. Den Thorax über eine Vicryl 2-0 Monofilament-Naht besonen. Dann die Muskelschicht der Brust über eine 3:0 Vicryl Verjüngung Naht. Dann den Hautschnitt über eine Nylon 3-0 Monofilament-Naht verankern.
10. Verabreichen Sie eine Kombination der folgenden Medikamente nach Abschluss der Operation für 48-72 Stunden, um als Analgesie in der postoperativen Periode zu dienen: 1) Buprenorphin 0,01-0,05 mg/kg subkutan alle 8-12h, 2) Meloxicam 2 mg/kg subkutan alle 12h und 3) Morphin 2,5 mg/kg subkutan alle 2-4h, wie bei starken Schmerzen erforderlich.
    HINWEIS: Lassen Sie das Tier auf einem Heizkissen unter regelmäßiger Überwachung erholen. Sobald das Tier Anzeichen einer Erholung von der Anästhesie zeigt (in der Lage, spontan zu atmen - ohne Beweise für Dasappen oder Denuse von Zubehörmuskeln für mehr als zwei Minuten - und hat gute Reflexe, rote und warme Extremitäten), extubieren Sie das Tier und bringen Sie es in den Käfig zurück.

3. Echokardiographie

1. Besen Sie das Tier mit intraperitonealer Injektion von 80-100 mg/kg Ketamin. Stellen Sie eine angemessene Sedierung für die ordnungsgemäße Erfassung von Echobildern guter Qualität sicher.
   HINWEIS: Die Verwendung von Isofluran als Anästhetikum wird für seine Kardiodepressiva-Wirkung abgeraten, insbesondere bei der Einstellung einer starken Drucküberlastung und könnte einen falschen Eindruck von LV-Dilatation und systolischer Dysfunktion vermitteln, die sich auflöst, sobald das Tier aus dem Anästhetikum ist.
   1. Seien Sie vorsichtig und verabreichen Sie die Hälfte oder sogar ein Drittel der Dosis ketamin bei Tieren, die dyspnoisch und tachypinisch aussehen, mit dem Verdacht, dass sie den HFrEF-Phänotyp entwickelt haben.
2. Rasieren Sie die Haare der Brust, vorderlich, in dem vollständig sedierten Tier.
3. Legen Sie das Tier auf den Rücken und stabilisieren Sie es auf dem Kunststoffbrett.
4. Erfassen Sie 2D parasternale lange Achsen- und 2D-parasternale Kurzachsen-Ansichtsclips auf der Ebene des Papillenmuskels. Erhalten Sie auch M-Modus-Bilder aus der kurzen parasternalen Achsenansicht auf der Ebene des Papillenmuskels, um die LV-Septal- und hintere Wanddicke in Diastole sowie den LV-Enddiastol- und End-systolischen Durchmesser zu messen.
   1. Erfassen Sie Bilder oder Clips mit einer Herzfrequenz von 370 - 420 Schlägen pro Minute, um eine ordnungsgemäße Bewertung der LV-Größe und -Funktion zu gewährleisten. Die Erfassung von Bildern mit niedrigeren Herzfrequenzen führt zu einem falschen Eindruck von depressiver LV-Funktion und LV-Dilatation.
      HINWEIS: Die Erfassung von verkürzten 2D-Weitenachsenansichtsbildern/Clips führt zu falschen Messungen. Stellen Sie zur Qualitätskontrolle sicher, dass der LV-Apex und der Aorto-Mitral-Winkel innerhalb desselben Ebenenschnitts visualisiert sind.
   2. Erfassen Sie 2D kurze parasternale Achse Ansicht Bilder / Clips auf der Ebene der mittleren Papillarmuskel. Dies dient als Referenz, um zuverlässige serielle und nachfolgende LV-Messungen zu erhalten, während die Tiere im Laufe des Studienzeitraums verfolgt werden.
5. Erhalten Sie M-Modus-Bilder in langer parasternaler Achsenansicht auf der Ebene der Aortenklappe, um den relativen Aorten-links-Atrium-Durchmesser (LA) am Ende der Systole zu bewerten.
   ANMERKUNG: Tiere mit den Mod- und HFrEF-Phänotypen sollten Hinweise auf eine LA-Dilatation mit einem LA/Ao-Verhältnis von 1,25 und <1,5 im MOD HF-Phänotyp und 1,5 € beim HFrEF-Phänotyp¹⁰aufweisen.

Ergebnisse

Die Charakterisierung der HF-Phänotypen, die 8-12 Wochen nach AAB entstehen, könnte leicht über echokardiographie durchgeführt werden. Repräsentative M-Modus-Bilder von Sham, Woche 3 post-AAB, MOD und HFrEF Phänotypen sind in Abbildung 1Adargestellt. Abbildung 1B und Abbildung 1C zeigen die vaskuläre Clipgröße für die Erstellung des MOD HF-Phänotyps bzw. des HFrE...

Diskussion

Nach dem Po im Zusammenhang mit AAB bei Ratten wird das LV konzentrisch umgebaut, indem die LV-Wanddicke, die so genannte konzentrische LVH, als Kompensationsmechanismus erhöht wird, um der Erhöhung der LV-Wandspannung entgegenzuwirken. Die Erhöhung der LV-Wanddicke macht sich in der ersten Woche nach AAB bemerkbar und erreicht ihre maximale Dicke bei 2-3 Wochen nach AAB. Während dieses Zeitraums führt die Aktivierung maladaptiver Signaltransduktionswege zu einer fortschreitenden Vergrößerung des LV mit einer Erhöhung de...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Adson-Zange	F.S.T.	11019-12	chirurgisches Werkzeug
Alm Brustretraktor mit stumpfen Zähnen	ROBOZ	RS-6510	chirurgisches Werkzeug
Graefe Zange, gebogen	F.S.T.	11152-10	chirurgisches Werkzeug
Halsted-Mosquito Hemostaten, gerade	F.S.T.	13010-12	chirurgisches Werkzeug
Gehärtete feine Irisschere, gerade	Fine Science Tools F.S.T.	14090-11	chirurgisches Werkzeug
hemoclip traditionell-edelstahl ligierende Clips	Weck	523735	chirurgisches Werkzeug
Mayo-Hegar Nadelhalter	F.S.T.	12004-18	chirurgisches Werkzeug
mechanisches Beatmungsgerät	CWE inc	SAR-830 / AP	mechanisches Beatmungsgerät für Kleintiere
Weck Edelstahl Hemoclip Ligation	Weck	533140	chirurgisches Werkzeug