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Methodenartikel

Selbstmontage von Hybrid-Lipidmembranen, dotiert mit hydrophoben organischen Molekülen an der Wasser-Luft-Schnittstelle

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DOI:

10.3791/60957

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1. Mai 2020

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1Research Institute of Electrical Communication, Tohoku University, 2Advanced Institute for Materials Research, Tohoku University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir berichten über ein Protokoll zur Herstellung einer Hybrid-Lipidmembran an der Wasser-Luft-Schnittstelle, indem wir die Lipid-Doppelschicht mit Kupfer (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-Phthalocyanin (CuPc) Molekülen dopen. Die resultierende Hybrid-Lipidmembran hat eine Lipid/CuPc/Lipid-Sandwichstruktur. Dieses Protokoll kann auch auf die Bildung anderer funktioneller Nanomaterialien angewendet werden.

Zusammenfassung

Aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften, einschließlich einer ultradünnen Dicke (3-4 nm), ultrahohem Widerstand, Fließfähigkeit und Selbstmontagefähigkeit, können Lipid-Doppelschichten leicht funktionalisiert werden und wurden in verschiedenen Anwendungen wie Biosensoren und Bio-Geräten verwendet. In dieser Studie haben wir ein planares organisches Molekül eingeführt: Kupfer (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-Phthalocyanin (CuPc) um Lipidmembranen zu dope. Die CuPc/lipid Hybridmembran bildet sich per Selbstmontage an der Wasser-Luft-Schnittstelle. In dieser Membran befinden sich die hydrophoben CuPc-Moleküle zwischen den hydrophoben Schwänzen von Lipidmolekülen und bilden eine Lipid/CuPc/Lipid-Sandwichstruktur. Interessanterweise kann eine luftstabile Hybrid-Lipid-Bilayer leicht gebildet werden, indem die Hybridmembran auf ein Si-Substrat übertragen wird. Wir berichten über eine einfache Methode zur Integration von Nanomaterialien in ein Lipid-Bilayer-System, das eine neue Methode für die Herstellung von Biosensoren und Biogeräten darstellt.

Einleitung

Als wesentliche Sanurnrahmen werden das Innere der Zellen durch ein Lipid-Doppelschichtsystem vom Äußeren getrennt. Dieses System besteht aus amphiphilen Phospholipiden, die aus hydrophilen Phosphorester-"Köpfen" und hydrophoben Fettsäuren "Schwänzen" bestehen. Aufgrund der bemerkenswerten Fließfähigkeit und Selbstmontagefähigkeit von Lipid-Doppelschichten in wässriger Umgebung1,2können künstliche Lipid-Doppelschichten mit einfachen Methoden gebildet werden3,4. Verschiedene Arten von Membranproteinen, wie Ionenkanäle, Membranrezeptoren und Enzyme, wurden in die künstliche Lipid-Bilayer integriert, um die Funktionen der Zellmembranen5,6nachzuahmen und zu untersuchen. In jüngerer Zeit wurden Lipid-Doppelschichten mit Nanomaterialien (z.B. Metall-Nanopartikel, Graphen und Kohlenstoff-Nanoröhren) dotiert, um funktionelle Hybridmembranen7,8,9,10,11,12,13zu bilden. Ein weit verbreitetes Verfahren zur Bildung solcher Hybridmembranen beinhaltet die Bildung von dotierten Lipidbläschen, die hydrophobe Materialien wie modifizierte Au-Nanopartikel7 oder Kohlenstoff-Nanoröhren11enthalten, und die resultierenden Vesikel werden dann zu planaren Lipid-Doppelschichten verschmolzen. Dieser Ansatz ist jedoch komplex und zeitaufwändig, was die Einsatzmöglichkeiten solcher Hybridmembranen einschränkt.

In dieser Arbeit wurden Lipidmembranen mit organischen Molekülen dotiert, um Hybrid-Lipidmembranen zu produzieren, die sich an der Wasser-Luft-Schnittstelle durch Selbstmontage bildeten. Dieses Protokoll umfasst drei Schritte: Die Vorbereitung der Mischlösung, die Bildung einer Hybridmembran an der Wasser-Luft-Schnittstelle und die Übertragung der Membran auf ein Si-Substrat. Im Vergleich zu anderen zuvor gemeldeten Methoden ist die hier beschriebene Methode einfacher und erfordert keine ausgeklügelte Instrumentierung. Mit dieser Methode können luftstabile Hybrid-Lipidmembranen mit einer größeren Fläche in kürzerer Zeit gebildet werden. Das in dieser Studie verwendete Nanomaterial ist ein halbleitendes organisches Molekül, Kupfer (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-Phthalocyanin (CuPc), das in einer Reihe von Anwendungen weit verbreitet ist, einschließlich Solarzellen, Photodetektoren, Gassensoren und Katalyse14,15. CuPc, ein kleines organisches Molekül mit einer planaren Struktur, hat eine hohe Affinität zu den "Schwänzen" des Phospholipid-Duos zu seinen hydrophoben Eigenschaften. Andere Gruppen haben berichtet, dass CuPc-Moleküle sich auf Einkristalloberflächen mit der Bildung von hochgeordneten Strukturen selbst zusammensetzen können16,17. Daher ist es sehr gut möglich, dass die CuPc-Moleküle durch Selbstmontage in die Lipid-Doppelschichten eingearbeitet werden.

Wir bieten eine detaillierte Beschreibung der Verfahren zur Bildung von Membranen und einige Vorschläge für eine reibungslose Umsetzung dieses Verfahrens. Darüber hinaus stellen wir einige präsentationswerte Ergebnisse der Hybridlipidmembranen vor und diskutieren mögliche Anwendungen dieser Methode.

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Protokoll

1. Vorbereitung einer Hybridlösung

  1. Waschen Sie vier 4 ml Einwegglasfläschchen und Schraubverschlüsse (mit PTFE-beschichteten Dichtungen) in einem Ultraschallbad für 10 min in destilliertem Wasser (gereinigt mit einem Filtersystem), gefolgt von Ethanol bzw. Chloroform. Trocknen Sie die Glasfläschchen und Kappen in einem Strom von Stickstoffgas.
  2. In einer anaeroben Handschuhbox eine CuPc-Stammlösung (10 mg/ml) in einer gewaschenen Glasdurchstechflasche vorbereiten, indem Sie pulverisierte CuPc in Chloroform auflösen.
  3. Filtern Sie die CuPc-Lösung durch eine 0,2 m Polytetrafluorethylen-Membran (PTFE).
  4. Bewahren Sie die gefilterte Lösung in einer mit Stickstoff gefüllten gewaschenen Glasflasche auf und versiegeln Sie die Durchstechflasche mit Parafilm.
  5. Nehmen Sie die gekaufte 1,2-Diphytanoyl-Sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPhPC) Chloroformlösung (25 mg/ml) aus dem -80 °C-Kühlschrank und lassen Sie sie auf Raumtemperatur erwärmen.
  6. Rühren Sie die DPhPC-Lösung mit einem Wirbelmischer bei 2300 Rpm für 10 s.
  7. Spülen Sie eine Glasmikrospritze mit Chloroform 5 Mal aus.
  8. Mit der gewaschenen Spritze 200 l der DPhPC Chloroform-Lösung in eine vorgewaschene Glasflasche geben. Verdampfen Sie das Lösungsmittel in der Durchstechflasche mit einem sanften Stickstoffstrom.
  9. Spülen Sie eine Glasmikrospritze 5 Mal mit Chloroform.
  10. Mit der gereinigten Spritze 202,6 l Chloroform in die Glasflasche mit DPhPC geben.
  11. Fügen Sie der DPhPC-Lösung 47,4 l gefilterte 10 mg/ml CuPc-Lösung hinzu. Das Molverhältnis von DPhPC zu CuPc sollte 10:1 betragen.
  12. Spülen Sie die Glasmikrospritze 5 Mal mit Chloroform.
  13. Fügen Sie der Lösung mit der Spritze 250 l Hexan hinzu. Die Endkonzentration der Lösung sollte 10 mg/ml betragen.
  14. Mischen Sie die vorbereitete Lösung mit einem Wirbelmischer bei 2300 Rpm für 10 s.
  15. Filtern Sie die CuPc-Lösung durch eine 0,2 m Polytetrafluorethylen-Membran (PTFE).
  16. Versiegeln Sie die Glasdurchstechflasche mit Parafilm. Legen Sie ihn in einen griffversiegelten Beutel, der mit Stickstoff gefüllt ist, und legen Sie den griffversiegelten Beutel bei -20 °C in einen Gefrierschrank.
    HINWEIS: Nach Schritt 1.13 wurden DPhPC und CuPc in einem gemischten Lösungsmittel gelöst, das aus Chloroform und Hexan (Volumenverhältnis 1:1) bestand. Darüber hinaus ist das Molverhältnis von DPhPC zu CuPc nicht auf 10:1 beschränkt. Bei einer konstanten Konzentration von Lipiden (10 mg/ml) können unterschiedliche Molverhältnisse verwendet werden. Nach bisherigen experimentellen Ergebnissen wird ein Bereich von 10:1 bis 3:1 für die Bildung einer hochwertigen Hybrid-Lipidmembran bevorzugt.

2. Bildung einer Hybridmembran an der Wasser-Luft-Schnittstelle

  1. Si-Substrate (3 cm x 3 cm) aus einem Si-Wafer schneiden.
  2. Reinigen Sie die 3 cm x 3 cm Si-Substrate in einem Ultraschallbad 10 min in gereinigtem Wasser, gefolgt von Ethanol und dann Chloroform. Behandeln Sie das Si-Substrat mit einemO2-Plasma für 5 min, um adsorbierte organische Materialien von der Oberfläche zu entfernen und die Hydrophilie zu verbessern.
  3. Waschen Sie einen Teflonbecher mit einem Innendurchmesser von 7,5 cm mit fließendem gereinigtem Wasser für 3 min.
  4. Legen Sie das gereinigte Si-Substrat in den gewaschenen PTFE-Becher. Das Substrat ist in einem Winkel von 30° zur Horizontalen geneigt.
  5. Gießen Sie eine ausreichende Menge gereinigten Wassers in das Teflon-Becherglas, bis das gesamte Si-Substrat unterWasser steht.
  6. Nehmen Sie vorbereitete Hybridlösung aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es auf Raumtemperatur erwärmen.
  7. Rühren Sie die Hybridlösung mit einem Wirbelmischer bei 2300 Rpm für 15 s.
  8. Spülen Sie eine Glasmikrospritze (50 l) 5 Mal mit Chloroform.
  9. Lassen Sie 3-5 l der Hybridlösung mit der Spritze auf die Wasseroberfläche fallen, um eine schwimmende Hybrid-Lipidmembran zu bilden.
    HINWEIS: Wenn die Lösung fallen gelassen wird, ist es wichtig, das Tröpfchen in der Nähe (weniger als 1 cm) der Wasseroberfläche zu halten. Es sollte auch beachtet werden, dass eine einschichtige Hybridmembran mit bloßem Auge nicht sichtbar ist, aber die mehrschichtige Hybridmembran erscheint als dünner, blauer Film. Um die mehrschichtige Hybridmembran auf das Si-Substrat zu übertragen, ist es wichtig, die Mischlösung so nah wie möglich am Si-Substrat zu lassen.

3. Übertragung der Membran auf ein Si-Substrat

  1. Nach der Verdunstung von organischem Lösungsmittel (es dauert weniger als 2 Sekunden), senken Sie den Wasserspiegel um eine Rate von 3 mm/min, indem Sie das Wasser durch ein Gummirohr, das von einer peristaltischen Pumpe angetrieben wird, auspumpen, um die schwimmende Hybridmembran auf das Si-Substrat zu übertragen.
  2. Nach Abschluss des Transfervorgangs (ca. 5 min) das Si-Substrat auf einen Reinraumwischer legen und das gesamte Restwasser verdampfen lassen.
    HINWEIS: Die Senkung des Wasserspiegels bei einer so niedrigen Rate dient dazu, die Turbulenzen des Wassers zu minimieren und die Membran zu schützen.

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Ergebnisse

Die as-formed Membran hat eine einheitliche hellblaue Farbe aufgrund der Anwesenheit von CuPc-Molekülen. Die Fläche der farbigen Membran beträgt in der Regel mehrere Quadratzentimeter. In Abbildung 1A und Abbildung 1Bzeigen wir ein mikroskopisches Bild und ein Atomkraftmikroskop (AFM) (einschließlich eines Höhenprofils) der Hybrid-Lipidmembran auf einem Si-Substrat. Im AFM-Bild ist die Membran oben links dick, mit einer Dicke von 79,4 nm und die unten rechts ist...

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Diskussion

In der Vorläuferlösung der Hybridmembran wird ein gemischtes organisches Lösungsmittel (Chloroform und Hexan) anstelle von reinem Chloroform verwendet, um Lipide und CuPc aufzulösen. Bei Verwendung von reinem Chloroform wäre die Dichte der Vorläuferlösung höher als bei Wasser. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass die Lösung auf den Grund des Wassers sinken würde, anstatt sich auf der Wasseroberfläche auszubreiten. Die Zugabe von Hexan, einem Lösungsmittel mit geringer Dichte, zur Vorläuferlösung stellt sicher, dass die...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das CREST-Programm der Japan Science and Technology Agency (JPMJCR14F3) und Grant in-Aids von der Japan Society for the Promotion of Science (19H00846 und 18K14120) unterstützt. Diese Arbeiten wurden teilweise am Labor für Nanoelektronik und Spintronik, Forschungsinstitut für elektrische Kommunikation, Tohoku Universität durchgeführt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ChloroformWako  Chemikalien033-08631
CuPcSigma-Aldrich423165
DPhPcAvanti Polar Lipids850356C
Glasfläschchen mit SchraubverschlussNichiden-Rike Glass Co., Ltd6-29801
HexanWako  Chemie084-03421
MembranfilterMerck Millipore Ltd.
MikrospritzeHamilton80530
SchlauchpumpeTokyo Rikakikai Co., Ltd.
Vortex-MischerScientific Industries, Inc.SI-0286
R8CA4283611914199

Referenzen

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