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Methodenartikel

Eliminierung serotonerger Neuronen durch stereotaktische Injektion von 5,7-Dihydroxytryptamin in die dorsalen Raphe-Kerne von Mäusen

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DOI:

10.3791/60968

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1. Mai 2020

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1Institute for Regenerative Medicine, Shanghai East Hospital, Frontier Science Center for Stem Cell Research, School of Life Sciences and Technology, Tongji University, 2Department of Ophthalmology, Shanghai Tenth People's Hospital Affiliated to Tongji University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein desaler Raphe-Kern (DRN)-läsioniertes Mausmodell (>90% Überlebensrate bei Versuchsmäusen) mit stabilem Verlust von dorsalen serotonergen Raphe-Neuronen durch stereotaktische Injektion von 5,7-Dihydroxytryptamin in das DRN unter Verwendung eines abgewinkelten Ansatzes, um eine Schädigung des Sinus sagittalis superior zu verhindern.

Zusammenfassung

Stereotaktische Injektionen werden häufig für die direkte Abgabe von Verbindungen oder Viren an bestimmte Gehirnbereiche bei Nagetieren eingesetzt. Das direkte Targeting serotonerger Neuronen im dorsalen Raphe-Kern (DRN) kann aufgrund seiner Lage unterhalb des Sinus sagittalis superior (SSS) zu übermäßigen Blutungen und zum Tod von Tieren führen. Dieses Protokoll beschreibt die Generierung eines DRN-serotonergen Neuronen-läsionierten Mausmodells (>90% Überlebensrate) mit stabilem Verlust von >70% 5-HT-positiven Zellen im DRN. Die Läsion wird durch stereotaktische Injektion eines selektiven serotonergen Neurotoxins 5,7-Dihydroxytryptamin (5,7-DHT) in das DRN unter Verwendung eines abgewinkelten Ansatzes (30° in anteriorer/posteriorer Richtung) induziert, um eine Verletzung des SSS zu vermeiden. DRN-serotonerge Mäuse mit Neuronenläsionen zeigen angstassoziierte Verhaltensänderungen, was den Erfolg der DRN-Läsionsoperation bestätigt. Diese Methode wird hier bei DRN-Läsionen eingesetzt, kann aber auch bei anderen stereotaktischen Injektionen eingesetzt werden, die eckige Injektionen erfordern, um Mittellinienstrukturen zu vermeiden. Dieses DRN-Mausmodell mit serotonergen Neuronenläsionen bietet ein wertvolles Werkzeug zum Verständnis der Rolle serotonerger Neuronen bei der Pathogenese psychiatrischer Störungen, wie z. B. generalisierte Angststörung und schwere depressive Störung.

Einleitung

Serotonin oder 5-Hydroxytryptamin (5-HT) ist ein wichtiger Neurotransmitter, der hauptsächlich im Darm und im Gehirn produziert wird und eine Vielzahl von psychologischen Funktionen beeinflusst. Im Zentralnervensystem (ZNS) spielt das serotonerge System eine zentrale Rolle bei der Regulierung von Stimmung und Sozialverhalten, Schlaf und Wachen, Appetit, Gedächtnis und sexuellem Verlangen. Im ZNS wird Serotonin von serotonergen Neuronen synthetisiert, die in die folgenden zwei Gruppen unterteilt werden können: die rostrale Gruppe, die aufsteigende Vorsprünge hat, die praktisch das gesamte Gehirn innervieren; und die kaudale Gruppe, die hauptsächlich zum Rückenmark projiziert1. Die rostrale Gruppe, die etwa 85 % der serotonergen Neuronen im Gehirn enthält, besteht aus dem kaudalen linearen Kern, dem Nucleus raphe medianus und dem DRN, in dem sich die größte Population serotonerger Neuronen im Gehirn befindet.

Es wird allgemein angenommen, dass eine Dysregulation des serotonergen Systems mit der Pathogenese der Major Depression (MDD) und der generalisierten Angststörungen (GAD) zusammenhängt2. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRIs) eine wirksame pharmakologische Behandlung für diese psychiatrischen Störungen darstellen 3,4. Darüber hinaus deuten kumulative Beweise darauf hin, dass Manie5 und suizidales Verhalten6 mit einer geringeren Serotoninfunktion im DRN verbunden sein können. Es wurde auch berichtet, dass Pet1-Cre; Lmx1b-flox/flox-Mäuse und hTM-DTAiPet1-Mäuse (genetische Mausmodelle, denen die meisten zentralen serotonergen Neuronen aus dem spätembryonalen Stadium7 bzw. dem Erwachsenenalter8 fehlen) zeigen ein erhöhtes kontextuelles Angstgedächtnis. Trotz umfangreicher Forschung muss jedoch die genaue Beteiligung von serotonergen DRN-Neuronen an diesen psychiatrischen Erkrankungen noch geklärt werden.

Um die Mechanismen zu erforschen, durch die serotonerge DRN-Neuronen die Pathogenese der Serotonin-assoziierten psychiatrischen Störungen regulieren, wurden Tiermodelle erstellt. Optogenetische Werkzeuge wurden eingesetzt, um serotonerge Neuronen bei Ratten-DRN zu hemmen, und diese Tiere zeigen vermehrt angstähnliche Verhaltensweisen9. Die Optogenetik hat jedoch Grenzen. Zum Beispiel muss eine Lichtabgabevorrichtung in die Zielregion tief im Gehirn implantiert werden, und das umgebende Gewebe kann während der Implantationsoperation oder durch Wärme, die von der Lichtvorrichtung abgegeben wird, verletzt werden. Auch wenn Temperaturänderungen keine nachweisbaren Schäden am Hirngewebe verursachen, können sie dennoch bemerkenswerte physiologische und verhaltensbezogene Auswirkungen haben10.

Pharmakologische Manipulation könnte ein einfacherer Ansatz sein, um DRN-serotonerge neuron-läsionierte Tiermodelle zu erstellen. Einige Gruppen haben DRN serotonerge Neuronen-läsionierte Ratten durch stereotaktische Mikroinjektion von Serotonin-Neurotoxin 5,7-DHT in das DRN erzeugt. Diese Rattenmodelle zeigen jedoch unterschiedliche Verhaltensänderungen, wie z. B. anxiolytisches Verhalten11, erhöhtes angstähnliches Verhalten12 und beeinträchtigtes Objektgedächtnis13. Trotz vieler Studien an Ratten wurden weniger Studien zu den Einflüssen von 5,7-DHT auf Mäuse durchgeführt. Eine Gruppe berichtete über eine übermäßige Mortalität (>50%) und einen begrenzten Serotoninmangel bei Versuchsmäusen, die stereotaktische Mikroinjektionen von 5,7-DHT in der DRN14 erhielten. Eine andere Gruppe berichtete, dass unvorhersehbarer chronischer milder Stress (UCMS) bei 5,7-DHT-induzierten DRN-läsionierten Mäusen eine signifikante Veränderung der Attacklatenz induzieren kann. Es wurden jedoch keine histologischen Ergebnisse vorgelegt, um den genauen serotonergen Neuronenverlust in der DRN15 zu bestätigen. Eine stereotaktische Injektion in die DRN unter Verwendung von Standardverfahren kann bei Mäusen zu massiven Blutungen und hoher Mortalität führen, da die anatomische Lokalisation der DRN unterhalb des SSS16 liegt.

Dieses Protokoll beschreibt das Protokoll zur Generierung eines DRN-serotonergen Neuronen-läsionierten Mausmodells (>90% Überlebensrate der Versuchsmäuse) mit stabilem Verlust von DRN-serotonergen Neuronen durch stereotaktische Injektion von 5,7-DHT. Die Injektion in DRN verwendet einen abgewinkelten Ansatz, um eine Verletzung des SSS zu verhindern. Diese Operation führt durchweg zu einem Verlust von >70% des serotonergen Neurons im DRN von Mäusen und führt zu angstbedingten Verhaltensänderungen. Das hier verwendete Protokoll dient zur Induktion von DRN-Läsionen, kann aber auch für Forscher nützlich sein, die stereotaktische Injektionen in andere Mittellinienstrukturen durchführen möchten. Darüber hinaus bietet dieses DRN-Mausmodell mit serotonergen Neuronenläsionen ein wertvolles Werkzeug, um die Rolle serotonerger Neuronen bei psychiatrischen Erkrankungen (d. h. MDD und GAD) zu verstehen und potenzielle neuroprotektive Wirkstoffe oder therapeutische Strategien für diese Erkrankungen zu bewerten.

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Protokoll

Alle chirurgischen Eingriffe und Tierpflegeverfahren wurden vom Tierkomitee der School of Life Sciences and Technology der Tongji-Universität in Shanghai, China, genehmigt.

1. Unterbringung von Tieren

  1. Männliche C57BL/6NCrl-Mäuse (10 Wochen alt, 25 g, n = 21) werden unter Standardbedingungen (24 °C Temperatur; 55 % Luftfeuchtigkeit) unter einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h/12 h gehalten.
  2. Stellen Sie Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung.
    HINWEIS: Hier werden drei der Mäuse zur Bestätigung der Nadelspur verwendet.

2. Vorbereitung der Reagenzien

HINWEIS: Alle Schritte zur Arzneimittelzubereitung müssen in einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, um eine Kontamination zu vermeiden. Alle vorbereiteten Lösungen werden in einem -80 °C heißen Gefrierschrank gelagert. Es wird empfohlen, jeweils ein Aliquot zu verwenden, vollständig aufzutauen, vor Gebrauch gut zu mischen, die Reste in der Tube zu entsorgen und wiederholtes Einfrieren und Auftauen zu vermeiden.

  1. Lösen Sie 0,25 g Desipraminhydrochlorid in 100 ml 0,9%iger Kochsalzlösung, um eine Lösung von 2,5 mg/ml zu erhalten. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem Spritzenvorsatzfilter mit einer hydrophilen PES-Membran mit einer Porengröße von 0,22 μm. Anschließend aliquotieren Sie die Lösung (1,8 ml/Röhrchen) in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (EP). Etikettieren, datieren und sofort in einem -80 °C-Gefrierschrank aufbewahren. Die empfohlene Dosierung für Tiere beträgt 25 mg/kg.
  2. 5 mg 5,7-DHT werden in 1,67 ml 0,9 % Kochsalzlösung mit 0,1 % Ascorbinsäure gelöst, um eine Lösung von 3 μg/μl zu erhalten. Zum Mischen vorsichtig vortexen, die Lösung mit einem Spritzenvorsatzfilter (0,22 μm Porengröße) sterilisieren und die Lösung (10 μl/Röhrchen) in 0,5 ml EP-Röhrchen aliquotieren. Etikettieren, datieren und sofort bei -80 °C einfrieren. Die empfohlene Dosierung für Tiere beträgt 2 μL/Maus.
  3. Ketoprofen (Analgetikum) wird nach der zuvor beschriebenen Methode17 gelöst. Lösen Sie 250 mg Ketoprofen in 15 ml Wasser und 1 ml 1 M NaOH auf, stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 ein und füllen Sie das endgültige Volumen auf 125 ml auf, was zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml führt. Sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter und aliquotieren Sie die Lösung (0,4 ml/Röhrchen) in 1,5 mL EP-Röhrchen. Beschriften, datieren und bis zur Verwendung bei -80 °C einfrieren. Die empfohlene Dosierung für Tiere beträgt 5 mg/kg.

3. Vorbereitung von Instrumenten und Mäusen

  1. Bereiten Sie ein chirurgisches Paket (bestehend aus einem Skalpell, einer Gewebezange, einer Schere, einem Nadelhalter, 3-0-Nähten, Ohrmarken und Ohrmarken-Applikator) vor, das zuvor in Hochtemperatur-Autoklaven sterilisiert wurde. Legen Sie 75 % Ethanol, Povidon-Jod, 3 % Wasserstoffperoxid, Vehikellösung (0,1 % Ascorbinsäure in 0,9 % Kochsalzlösung), ein Wattestäbchen, Ofloxacin-Augensalbe und einen Maus-Auffangkäfig auf ein Heizkissen, indem Sie eine Hamilton-Spritze mit einer 32-G-Nadel und einer 1-ml-Spritze verwenden.
  2. h vor der 5,7-DHT-Injektion das Körpergewicht der Mäuse wiegen und aufzeichnen und sie dann intraperitonealen (i.p.) Injektionen von Desipramin (2,5 mg/ml, 10 μl/g Gewicht) unterziehen.
    HINWEIS: Der Zweck der Verabreichung von Desipramin 1 h vor der 5,7-DHT-Injektion besteht darin, einen katacholaminergen Zellverlust zu verhindern18.
  3. Betäubung von Mäusen mit Isofluran-Inhalationsanästhesie (3% während der Induktion, 1,5% während der Erhaltung, Flussrate = 2 L/min). Verabreichen Sie Ketoprofen (2 mg/ml, 2,5 μl/g Gewicht) durch subkutane (s.c.) Injektion. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe durch das Fehlen einer Schwanzklemmreaktion.

4. Stereotaktische Injektion

  1. Platzieren Sie die betäubte Maus auf der stereotaktischen Plattform und fixieren Sie dann ihren Kopf mit den Ohrstangen und dem Schneidezahn des stereotaktischen Geräts.
  2. Rasieren Sie den Kopf der Maus und reinigen Sie dann die freiliegende Kopfhaut mit einem Peeling mit 75 % Ethanol, gefolgt von einem Peeling mit Povidon-Jod.
  3. Tragen Sie Lidocain-Salbe mit einem Wattestäbchen auf die Kopfhaut auf, um eine lokale Analgesie zu erhalten. Tragen Sie Ofloxacin-Augensalbe auf die Augen auf, um die Hornhaut zu schützen.
  4. Machen Sie mit einem Skalpell einen Schnitt auf der Kopfhaut entlang der Mittellinie von 1 mm hinter den Augen bis zur interauralen Linie.
  5. Verwenden Sie einen mit 3 % Wasserstoffperoxid getränkten Tupfer, um das Periost zu entfernen, trocknen Sie dann den Schädel und legen Sie die Schädelnähte frei. Markieren Sie die Position von Bregma und Lambda.
  6. Passen Sie die Kopfposition mit dem Schneidezahn an, bis Bregma und Lambda in derselben horizontalen Ebene liegen. Stellen Sie die Nadelspitze so ein, dass sie das Bregma oder Lambda berührt, notieren Sie die medialen/lateralen (ML) und dorsalen/ventralen (DV) Koordinaten und stellen Sie den Schneidezahn so ein, dass die DV- und ML-Koordinaten von Bregma bzw. Lambda gleich sind.
  7. Entriegeln Sie den senkrechten Positionierungsknopf und die Feststellschraube und stellen Sie dann den Manipulatorarm (z-Achse) auf 30° in anterior/posterior (AP) Richtung ein, wie in Abbildung 1A,B gezeigt. Sperren Sie die Taste.
  8. Befestigen Sie die mit 2 μl 5,7-DHT (3 μg/μl) gefüllte Hamilton-Spritze auf dem Halter (für die Scheingruppe wird Mäusen 0,9 % Kochsalzlösung mit 0,1 % Ascorbinsäure injiziert). Stellen Sie die Nadelspitze so ein, dass sie den Bregma-Orientierungspunkt berührt, und stellen Sie dann die ML-, AP- und DV-Werte mit dem Digitalanzeigemodul auf Null ein.
    HINWEIS: Die 5,7-DHT-Lösung ist eine braun gefärbte Flüssigkeit, so dass leicht festgestellt werden kann, ob die Hamilton-Spritze richtig gefüllt ist. Wenn kein Zugang zu einem digitalen Anzeigemodul vorhanden ist, notieren Sie die Zahl, die auf drei Achsen angezeigt wird, wenn die Nadelspitze das Bregma berührt, und die endgültigen Koordinaten stellen "die aufgezeichnete Zahl plus die in diesem Protokoll angegebene Koordinate" dar. Wenn die aufgezeichnete Zahl auf dem Manipulatorarm der y-Achse (A/P-Richtung) beispielsweise "a" ist, sollte die endgültige Koordinate in A/P-Richtung "a - 6,27" sein.
  9. Bewegen Sie den Manipulatorarm, um die Nadelspitze in die Injektionsposition zu bringen (APa = -6,27, ML = 0; die Formel zur Berechnung der Endkoordinaten ist in Abbildung 1B aufgeführt). Markieren Sie die Zielposition mit einem Markierungsstift.
  10. Bohren Sie das Fräsloch mit einem tragbaren Mikromotor-Hochgeschwindigkeitsbohrer und bewegen Sie dann den Manipulatorarm, um die Nadelspitze auf das Ziel abzusenken (DVa = -4,04). Injizieren Sie 2 μl der Lösung langsam (0,5 μl/3 min) in das Gehirn und halten Sie die Nadel weitere 5 Minuten in situ, um ein Auslaufen der Lösung zu verhindern. Entfernen Sie die Nadel vorsichtig nach der Injektion.
  11. Legen Sie unterbrochene Nähte mit 3-0-Nähten über den Schnitt. Wickeln Sie den genähten Schnitt mit einem in Povidon-Jod getränkten Wattestäbchen ein, um eine Infektion zu vermeiden.
  12. Reinigen Sie das rechte Ohr mit einem Povidon-Jod-Wattestäbchen und kleben Sie dann die sterilisierte Ohrmarke zur Identifizierung auf die Basis des Ohrs.
  13. Nehmen Sie die Versuchsmäuse aus der stereotaktischen Apparatur und legen Sie sie in einen Auffangkäfig für Mäuse auf einem Heizkissen, bis eine vollständige Genesung aus der Anästhesie beobachtet wird.

5. Postoperative Versorgung von Mäusen

  1. Unterziehen Sie Mäuse 1x/Tag bis zu 2 Tage nach der Operation s.c. Injektionen von Ketoprofen.
  2. Untersuchen Sie Mäuse täglich bis zu 7 Tage nach der Operation.

6. Erhöhter T-Labyrinth-Test

HINWEIS: Führen Sie den Test wie zuvor beschriebendurch 19,20.

  1. Stellen Sie sicher, dass der ETM-Test (Elevated T-Maze) aus zwei offenen Armen (30 cm x 5 cm x 0,5 cm) besteht, die senkrecht zu zwei geschlossenen Armen (30 cm x 5 cm x 16 cm x 0,5 cm) mit einer Mittelplattform (5,0 cm x 5,0 cm x 0,5 cm) stehen. Einer der geschlossenen Arme wird durch eine undurchsichtige Kunststofffolie blockiert, um eine T-Form zu bilden (Abbildung 2A).
  2. Gewöhnen Sie die Tiere drei Tage vor dem ETM-Test daran, indem Sie sie täglich 5 Minuten lang anfassen.
  3. Führen Sie am 30. Tag nach der Operation den ETM-Test durch.
  4. Setzen Sie die Mäuse am Tag des Verhaltenstests 10 Minuten lang einem der offenen Arme aus.
  5. Für den Test der inhibitorischen Vermeidung platzieren Sie jede Maus am distalen Ende des geschlossenen Arms und notieren Sie die Zeit, die benötigt wird, um diesen Arm mit vier Pfoten in drei Versuchen zu verlassen. Der erste Versuch ist die Ausgangsvermeidung, der zweite Versuch ist Vermeidung 1 und der dritte Versuch ist Vermeidung 2.
  6. Halten Sie die Mäuse zwischen den Trails 30 s lang in ihren Käfigen und legen Sie eine Cutoff-Zeit fest (hier werden 300 s für jeden Versuch verwendet).

7. Perfusion, Fixierung, immunhistochemische Färbung und Quantifizierung

  1. Am Ende der Studie (35 Tage nach der Operation, nach dem Verhaltenstest) führen Sie eine Ganzkörperperfusion und -fixation durch, sobald die Maus unter Vollnarkose steht.
    1. Betäuben Sie die Maus wie in Schritt 3.3 beschrieben. Legen Sie die tief anästhesierte Maus in eine dorsale Liege.
    2. Befeuchten Sie das Fell mit 75% Alkohol über den gesamten Bauchbereich.
    3. Machen Sie einen Schnitt unterhalb des Brustbeins, gefolgt von einem V-förmigen Schnitt im Brustkorb. Fassen Sie den Brustkorb mit der Klemme, um das Herz freizulegen.
    4. Führen Sie die venöse Infusionsnadel in die linke Herzkammer ein und schneiden Sie dann sofort mit einer Schere das Vorhofohr ab, damit das Blut abfließen kann.
    5. Schalten Sie die Peristaltikpumpe ein, um Kochsalzlösung über das Kreislaufsystem in den ganzen Körper zu perfundieren. Wechseln Sie von Kochsalzlösung zu 4 % Paraformaldehyd (PFA), wenn die aus dem rechten Vorhof austretende Flüssigkeit klar wird und wenn die Leber ihre Farbe von rot zu blassrot ändert. Perfundierte weitere 5 ml 4% PFA, wenn sich der Mausschwanz bewegt und der Körper steif ist.
      HINWEIS: Das Schwanken des Mausschwanzes ist ein Zeichen für eine ausreichende Durchblutung.
  2. Isolierung des Gehirns nach intrakardialer Perfusion mit 4% PFA
    1. Enthaupte die Maus mit einer großen Schere und schneide dann die Haut auf, um den Schädel freizulegen.
    2. Machen Sie zwei Schnitte an der Schädelbasis (verbunden mit dem Hals), machen Sie einen Schnitt entlang der Linie, die die Augen verbindet, und schneiden Sie dann den Schädel entlang der sagittalen Naht. Fassen Sie den Schädel jeder Hemisphäre und schälen Sie ihn nach außen, um das Gehirn mit einer Pinzette freizulegen.
      HINWEIS: Das Schneiden des Schädels entlang der sagittalen Naht muss vorsichtig durchgeführt werden, da sonst das Gehirn beschädigt und in Teile zerfallen kann.
    3. Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie es über Nacht in 4 % PFA bei 4 °C für die Nachfixierung, dann übertragen Sie das Gehirn in 30 % Saccharose, bis es auf den Boden sinkt.
      HINWEIS: Eine Dehydrierung mit 30% Saccharose ist nicht erforderlich, wenn die Abschnitte mit einem Vibratom geschnitten werden.
  3. Nehmen Sie überschüssige Flüssigkeit um das Taschentuch herum vor dem Einbetten mit einem Papiertuch auf. Betten Sie das Hirngewebe in OCT mit der rostralen Fläche auf dem Futter ein.
    HINWEIS: Die Ausrichtung der Probe ist wichtig. Die rostrale Fläche des Gehirns muss am Spannfutter befestigt werden, um sicherzustellen, dass die Schneide der kaudale Teil ist.
  4. Schneiden Sie einen koronalen Schnitt der DRN (4,0–4,8 mm posterior vom Bregma) bei einer Dicke von 30 μm (vierteilige Intervalle) mit einem Kryostaten und entnehmen Sie die Schnitte in PBS. Kryokonservierungslösung (SCS) im Gehirnschnitt bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Die Identifizierung des DRN ist sehr wichtig. Die aufeinanderfolgenden anatomischen Strukturen sind in Abbildung 3A–H dargestellt. Die charakteristischen Strukturen sind wie folgt: laterale Aussparung des vierten Ventrikels (LR4V, rote gestrichelte Linie in Abbildung 3A,E), vierte Herzkammer (4V, rotes gestricheltes Dreieck in Abbildung 3B,F), zweites Kleinhirnläppchen (2Cb, rote gestrichelte rautenförmige Struktur in Abbildung 3C/G) und Aquädukt (Aq, rotes gestricheltes Loch in Abbildung 3D,H). Beginnen Sie mit der Entnahme des Gewebes, wenn Strukturen beobachtet werden, wie in Abbildung 3D,H gezeigt, und schneiden Sie dann in 30 μm dicke Schnitte (Vier-Abschnitte-Intervalle), um insgesamt 24 koronale Schnitte zu erhalten. Die H&E-Färbung der Schnitte ist in (Abbildung 3E–H) dargestellt. Der vierte Abschnitt jeder der vier Sektionen wird ausgewählt, um die Immunfluoreszenzfärbung durchzuführen. Die restlichen Abschnitte werden im SCS gespeichert. Wenn es schwierig ist, die Strukturen zu erkennen, ist es hilfreich, ein Stück der Abschnitte auf der Rutsche zu montieren.
  5. Führen Sie einen immunhistochemischen Assay durch, wie zuvor beschrieben21,22.
  6. Zählen Sie 5-HT-positive Zellen auf verschiedenen Schnittebenen im gesamten DRN mit ImageJ.

8. Statistische Auswertung

  1. Verwenden Sie Statistiksoftware für die Datenanalyse. Geben Sie die Ergebnisse als Mittel ± REM aus.
  2. Verarbeiten Sie die Werte für die statistische Analyse durch bidirektionale ANOVA oder ungepaarte t-Tests und berücksichtigen Sie die signifikanten Unterschiede bei **p < 0,01.

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Ergebnisse

In einem koronalen Schnitt befindet sich die Position des DRN direkt unter dem SSS und dem Aquädukt (Abbildung 1B,C); Daher kann die gezielte Behandlung des DRN mit Standardverfahren zu massiven Blutungen und hoher Mortalität bei Mäusen führen16. Daher wurden hier stereotaktische Injektionen mit einem abgewinkelten Ansatz anstelle des üblichen vertikalen Ansatzes durchgeführt, um eine Beschädigung des SSS zu vermeiden (Abbildung 1...

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Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt erfolgreich die Herstellung eines zuverlässigen DRN-serotonergen Mausmodells mit Neuronenläsionen mit hoher Reproduzierbarkeit und niedriger Mortalitätsrate. Das Targeting des DRN ist eine komplexe Aufgabe, da es das SSS direkt über dem DRN16 beschädigen und zu übermäßigen Blutungen und sogar zum Tod führen kann14. Daher wurden stereotaktische Injektionen durchgeführt, indem der Manipulationsarm in einem Winkel v...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das National Key Research and Development Program of China [Fördernummern 2017YFA0104100]; die National Natural Science Foundation of China [Fördernummern 31771644, 81801331 und 31930068]; und die Fonds für Grundlagenforschung für die Zentralen Universitäten.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,22 Mikron SpritzenvorsatzfilterMilliporeSLGPRB
3% WasserstoffperoxidCaoshanhu Co., Ltd, Jiangxi, China
5,7-DihydroxytryptaminSigma-AldrichSML20583ug/ul, 2ul
Kompaktes Anästhesiegerät für KleintiereRWD Life Science Co., LtdR500 Serie
KryostatLeica Biosystems, Wetzlar, DeutschlandCM1950
Cy 3 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-165-0031:2.000
dapiSigma-AldrichD8417
DesipraminhydrochloridSigma-AldrichPHR172325mg/kg
Eppendorf-TubeQuality Scientific Plastics509-GRD-Q
Ziegen-Anti-5-HT-AntikörperAbcamab660471:800
GraphPad PrismGraphpad Software Inc, CA, US
Hamilton Mikroliter SpritzeHamilton87943
KetoprofenSigma-AldrichK1751-1G5mg/kg
L-AscorbinsäureBBI Life SciencesA610021-05000,10%
Lidocain SalbeTsinghua Tongfang Pharmaceutical Co. LtdH20063466
Ofloxacin AugensalbeShenyang Xingqi Pharmaceutical Co.Ltd, ChinaH10940177
PeristaltikpumpeHuxi Analytical Instrument Factory Co., Ltd, Shanghai, ChinaHL-1D
stereotaktisches GerätRWD Life Science Co., Ltd68018
UltratiefkühlschrankHaierDW-86L388
VortexKylin-GlockeVORTEX-5

Referenzen

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