In Situ Detektion von Ribonucleoprotein Complex Assembly in der C. elegans Germline mit Proximity Ligation Assay

Zusammenfassung

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des Proximity Ligation Assays zur Sonde für Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ in der C. elegans Keimbahn.

Zusammenfassung

Zu verstehen, wann und wo Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPIs) auftreten, ist entscheidend für das Verständnis der Proteinfunktion in der Zelle und wie breitere Prozesse wie die Entwicklung beeinflusst werden. Die Caenorhabditis elegans Keimbahn ist ein großartiges Modellsystem zur Untersuchung von PPI, die mit der Regulierung von Stammzellen, Meiose und Entwicklung zusammenhängen. Es gibt eine Vielzahl von gut entwickelten Techniken, die es ermöglichen, Proteine von Interesse für die Erkennung durch Standardantikörper zu kennzeichnen, was dieses System vorteilhaft für Proximity Ligation Assay (PLA) Reaktionen macht. Dadurch kann die PLA zeigen, wo PPI räumlich und zeitlich in Keimlinien auftreten, effektiver als alternative Ansätze. Hier wird ein Protokoll zur Anwendung und Quantifizierung dieser Technologie zur Untersuchung von PPI in der C. elegans Keimbahn beschrieben.

Einleitung

Über 80% der Proteine haben schätzungsweise Wechselwirkungen mit anderen Molekülen¹, was unterstreicht, wie wichtig PPI für die Ausführung spezifischer biologischer Funktionen in der Zelle²sind. Einige Proteine fungieren als Naben, die die Montage größerer Komplexe erleichtern, die für das Zellüberleben notwendig sind¹. Diese Hubs vermitteln mehrere PPIs und helfen, Proteine in einem Netzwerk zu organisieren, das bestimmte Funktionen in einer Zelle³erleichtert. Die Bildung von Proteinkomplexen wird auch durch den biologischen Kontext beeinflusst, wie das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer interagierender Partner⁴, Zellsignalereignisse und Entwicklungsstadium einer Zelle.

C. elegans wird häufig als Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien verwendet, einschließlich der Entwicklung. Die einfache Anatomie dieses Tieres besteht aus mehreren Organen, einschließlich der Gonaden, des Darms und der transparenten Nagelhaut, was die Analyse der Wurmentwicklung erleichtert. Die Keimbahn, die sich in der Gonade befindet, ist ein großartiges Werkzeug, um zu untersuchen, wie Keimbahnstammzellen zu Gameten⁵ reifen, die sich zu Embryonen und schließlich zur nächsten Generation von Nachkommen entwickeln. Der distale Spitzenbereich der Keimbahn enthält einen Pool von sich selbst erneuernden Stammzellen (Abbildung 1). Wenn Stammzellen die Nische verlassen, gelangen sie in das meiotische Pachyten und entwickeln sich schließlich im jungen Erwachsenenstadium zu Eizellen(Abbildung 1). Dieses Entwicklungsprogramm in der Keimbahn wird durch verschiedene Mechanismen streng reguliert, einschließlich eines post-transkriptionspolitischen regulatorischen Netzwerks, das durch RNA-bindende Proteine (RBPs)⁶erleichtert wird. PPI sind für diese Regulierungstätigkeit wichtig, da RBPs mit anderen Kofaktoren zusammenarbeiten, um ihre Funktionen auszuüben.

Es gibt mehrere Ansätze, die verwendet werden können, um nach PPIs im Wurm zu suchen, aber jeder hat eindeutige Einschränkungen. In vivo Immunpräzipitation (IP) kann verwendet werden, um Protein-Protein-Komplexe aus ganzen Wurmextrakten zu isolieren; Dieser Ansatz gibt jedoch nicht an, wo der PPI im Wurm auftritt. Darüber hinaus können Proteinkomplexe, die vorübergehend sind und sich nur während eines bestimmten Entwicklungsstadiums oder in einer begrenzten Anzahl von Zellen bilden, durch Co-Immunpräzipation nur schwer zu erholen sein. Schließlich müssen IP-Experimente die Bedenken der Proteinkomplex-Neusortierung nach Lyse und unspezifische Retention von Proteinen auf der Affinitätsmatrix ansprechen.

Alternative Ansätze zur In-situ-Detektion von PPI sind Co-Immunostaining, Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) und bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung (BiFC). Co-Immunostaining beruht auf dem gleichzeitigen Nachweis von zwei Proteinen von Interesse in festem Wurmgewebe und der Messung des Ausmaßes der Signalkolokalisierung. Der Einsatz der hochauflösenden Mikroskopie, die detaillierter als die Standardmikroskopie⁷bietet, hilft, die Proteinkolokalisierung über die beugungsbegrenzte Barriere von 200-300 nm⁸hinaus strenger zu testen. Die Ko-Immunostainierung mit konventioneller und superhochauflösender Mikroskopie eignet sich jedoch am besten für Proteine mit genau definierten Lokalisierungsmustern. Im Gegensatz dazu wird es für diffus verteilte interagierende Partner viel weniger informativ. Die Messung der Kolokalisierung von Signalen auf der Grundlage von Überlappungen liefert keine genauen Informationen darüber, ob die Proteine komplex miteinander sind^9,10.

Darüber hinaus sind Co-Immunpräzipation und Co-Immunostaining von Protein-Protein-Komplexen nicht quantitativ, was es schwierig macht, festzustellen, ob solche Wechselwirkungen signifikant sind. FRET und BiFC sind beide fluoreszierende Techniken. FRET stützt sich auf die Kennzeichnung von Proteinen von Interesse mit fluoreszierenden Proteinen (FPs), die spektrale Überlappung haben, bei der Energie von einem RP (Spender) an ein anderes RP (Akzeptor) übertragen wird¹¹. Diese nicht-radiotive Energieübertragung führt zu einer Fluoreszenz des Akzeptor-FP, die bei seiner jeweiligen Emissionswellenlänge nachgewiesen werden kann. BiFC basiert auf der Rekonstitution eines fluoreszierenden Proteins in vivo. Es beinhaltet die Aufteilung von GFP in zwei komplementäre Fragmente, wie Helices 1-10 und Helix 11¹², die dann zu zwei Proteinen von Interesse verschmolzen werden. Wenn diese beiden Proteine interagieren, werden die komplementären Fragmente von GFP in der Nähe nahe genug, um sich zu falten und zu montieren, wodurch das GFP-Fluorophor wieder vorhanden ist. Rekonstituiertes GFP wird dann direkt als Fluoreszenz beobachtet und gibt an, wo ein PPI aufgetreten ist.

Daher sind sowohl FRET als auch BiFC auf große fluoreszierende Tags angewiesen, die die Funktion des markierten Proteins stören können. Darüber hinaus benötigen FRET und BiFC eine reichliche und vergleichbare Expression der markierten Proteine, um genaue Daten zu erhalten. FRET ist möglicherweise nicht für Experimente geeignet, bei denen ein Partner über dem anderen liegt, was zu einem hohen Hintergrund führen kann¹³. Auch eine Überexpression in BiFC-Experimenten sollte vermieden werden, da dies zu einer unspezifischen Assembly¹⁴ führen kann, die zu einem erhöhten Hintergrund führt. Beide Techniken erfordern eine Optimierung der Expression und der bildgebenden Bedingungen der markierten Proteine, was die Zeit verlängern kann, die für die Abschluss von Experimenten erforderlich ist.

Der Proximity Ligation Assay (PLA) ist ein alternativer Ansatz, der die Grenzen der oben genannten Techniken angehen kann. PLA nutzt primäre Antikörper, die die Proteine von Interesse (oder ihre Tags) erkennen. Diese primären Antikörper werden dann durch sekundäre Antikörper gebunden, die Oligonukleotid-Sonden enthalten, die sich innerhalb eines Abstands von 40 nm (oder kürzer)¹⁵miteinander hybridisieren können. Die resultierende hybridisierte DNA wird durch eine PCR-Reaktion verstärkt, die von Sonden nachgewiesen wird, die die DNA ergänzen. Daraus ergeben sich Brennpunkte, die mit einem Mikroskop visualisiert werden. Diese Technologie kann PPI vor Ort in komplexen Geweben (d. h. dem Wurmgonaden) erkennen, der als Fließband organisiert ist, das Zellen in verschiedenen Entwicklungs- und Differenzierungsstadien enthält. Mit PLA können PPIs direkt in einem festen Wurmgonaden visualisiert werden, was vorteilhaft für die Untersuchung ist, ob PPI in einer bestimmten Entwicklungsphase auftreten. PLA bietet eine höhere Auflösung von PPIs im Gegensatz zu co-localization-basierten Assays, die ideal für präzise Messungen sind. Wenn sie verwendet wird, hat die superhochauflösende Mikroskopie das Potenzial, detailliertere Details über die Position von PLA-Brennpunkten innerhalb einer Zelle zu liefern. Ein weiterer Vorteil ist, dass die brennpunkteherreichen PLA-Reaktionen durch einen ImageJ-basierten Analyse-Workflow gezählt werden können, was diese Technik quantitativ macht.

Die LC8-Familie von Dynein-Lichtketten wurde zuerst als Untereinheit des Dynein-Motorkomplexes¹⁶ beschrieben und als Frachtadapter vermutet. Seit seiner ersten Entdeckung wurde LC8 in mehreren Proteinkomplexen neben dem Dynein-Motorkomplex^{17,,18,,19,20}gefunden. Das Scannen nach Proteinsequenzen, die das LC8-Interaktionsmotiv¹⁹ enthalten, legt nahe, dass LC8 viele Wechselwirkungen mit einer Vielzahl verschiedener Proteine haben kann^{17,18,19,20,21,22}. Als Ergebnis gelten Proteine der LC8-Familie heute als Naben, die die Montage größerer Proteinkomplexe^19,22, wie Assemblys von intrinsisch ungeordneten Proteinen²¹, fördern.

Ein C. elegans LC8-Familie Protein, Dynein light chain-1 (DLC-1), ist weit verbreitet über viele Gewebe und nicht in spezifischen subzellulären Strukturen angereichert^23,24. Folglich ist die Identifizierung biologisch relevanter In-vivo-Partner von DLC-1 in C. elegans aus einer Reihe von Gründen eine Herausforderung: 1) Die Co-Immunpräzipation gibt nicht die Gewebequelle an, in der die Wechselwirkung auftritt; 2) eine begrenzte Expression bestimmter Partner oder vorübergehende Wechselwirkungen kann die Fähigkeit behindern, eine Wechselwirkung durch Ko-Immunpräzipation zu erkennen; und 3) die diffuse Verteilung von DLC-1 führt zu unspezifischen Überschneidungen mit potenziellen Partnerproteinen durch Co-Immunostaining. Basierend auf diesen Herausforderungen ist PLA ein idealer Ansatz, um In-vivo-Interaktionen mit DLC-1 zu testen.

Es wurde bereits berichtet, dass DLC-1 direkt mit den RNA-bindenden Proteinen (RBPs) FBF-2²³ und GLD-1²⁵interagiert und als Cofaktor dient. Unsere Arbeit unterstützt das Modell von DLC-1, das als Nabenprotein dient, und schlägt vor, dass DLC-1 ein Interaktionsnetzwerk ermöglicht, das sich über Dynein^19,22hinaus erstreckt. Mit einem GST-Pulldown-Assay wurde ein neuer DLC-1-interagierender RBP namens OMA-1 identifiziert²⁶. OMA-1 ist wichtig für Eizellenwachstum und meiotische Reifung²⁷ und funktioniert in Verbindung mit einer Reihe von translationalen Repressoren und Aktivatoren²⁸. Während FBF-2 und GLD-1 in den Stammzellen bzw. meioten Pachytenregionen exprimiert werden, wird OMA-1 in der Keimbahn aus dem meiotischen Pachyten durch die Eizellen²⁷ diffus exprimiert (Abbildung 1). Dies deutet darauf hin, dass DLC-1 komplexe Komplexe mit RBPs in verschiedenen Regionen des Gonaden bildet. Es wurde auch festgestellt, dass die direkte Interaktion zwischen DLC-1 und OMA-1, die in vitro beobachtet wurde, nicht durch ein In-vivo-IP wiederhergestellt wird. Die PLA wurde erfolgreich als alternativer Ansatz verwendet, um diese Wechselwirkung in der C. elegans Keimbahn weiter zu untersuchen, und die Ergebnisse deuten darauf hin, dass PLA verwendet werden kann, um viele andere PPI im Wurm zu untersuchen.

Protokoll

HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet C. elegans-Stämme, bei denen potenzielle interagierende Partner mit Tags versehen sind. Es wird dringend empfohlen, einen Negativkontrollstamm zu verwenden, bei dem nicht erwartet wird, dass ein markiertes Protein mit einem anderen markierten Kandidaten-Interaktionspartner interagiert. Hier wurde GFP allein als Negativkontrolle verwendet, um den Hintergrund zu bewerten, da nicht erwartet wird, dass DLC-1 mit GFP im Wurm interagiert. ALS experimenteller Stamm wurde MIT GFP-tags OMA-1 verwendet, da vorläufige Daten auf eine Wechselwirkung mit DLC-1 hindeuten. Nematode-Stämme, die Kontroll- und Testproteine mit 3xFLAG-getaggtem DLC-1 koexieren, werden in diesem Text als 3xFLAG::DLC-1 bezeichnet; GFP und 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (Stämme auf Anfrage erhältlich; weitere Informationen in der Tabelle der Materialien), bzw. Hier werden die 3xFLAG- und GFP-Tags verwendet; andere Tags können jedoch ersetzt werden, solange ihre Antikörper mit den PLA-Kit-Reagenzien kompatibel sind.

1. Tierpflege

1. Halten Sie Würmer auf Nematoden-Wachstumsmediumplatten (NGM), die mit dem OP50-Stamm von E. coli gesät sind, und halten Sie bei 24 °C für eine optimale Expression von GFP.
2. Durchreise erwachsene Würmer alle 2-3 Tage, um Würmer zu vermehren und sie gut ernährt zu halten.

2. Vorbereitung der Synchronkultur

1. Synchronisieren Sie Würmer, indem Sie eine Platte mit gut gefütterten, gravid Hermaphroditen bleichen. Ein Bleichprotokoll wird in Porta-de-la-Riva et al.²⁹beschrieben. Lassen Sie die Embryonen über Nacht in einem Zentrifugenrohr bei 24 °C schlüpfen, während sie sich in 10 ml M9-Minimalmedia(M9)-Puffer über Ende drehen. Dies wird eine Kultur der verhafteten L1-Larven produzieren.
2. Inkubieren Sie die Röhre der verhafteten L1-Bühnenlarven auf Eis für 10 min, dann top off die Röhre mit eiskalten 1x M9.
3. Verwenden Sie eine Zentrifuge, um die Larven bei 600 x g für 5 min bei 4 °C zu pellet. Sorgsam den Überstand ansaugen, so dass nur noch 1-2 ml Überstand übrig bleiben.
4. Das Pellet der Larven wieder aufhängen und mit einer Mikropipette 2 l schwebende Larvenkultur auf eine Glasrutsche übertragen. Zählen Sie, wie viele Larven vorhanden sind, um die Dichte der Larvenkultur zu bestimmen, was dazu beitragen wird, die Aussaat der Würmer in Schritt 2.5 zu leiten.
   HINWEIS: Eine Dichte von 10-15 L1-Larven/1 L eignet sich gut für die Aussaat.
5. Verwenden Sie eine Mikropipette, um das Volumen der Larvenkultur zu übertragen, die benötigt wird, um etwa 100-120 L1-Stufenlarven auf einer 60 mm OP50-Platte auszusäen. Zum Beispiel Samen 10 L einer Larvenkultur, die eine Dichte von 10 L1 Larven/1 l Kultur hat.
   HINWEIS: Überschreiten Sie nicht ein Volumen von 40 l, um die Larven auszusäen, oder überschüssige Flüssigkeit wird den OP50 Rasen stören. Wenn das Kulturvolumen 40 l überschreitet, wiederholen Sie die Schritte 2.3-2.4, um das Volumen weiter zu reduzieren und die Larvenkultur zu erhöhen.
6. Würmer bei 24 °C anbauen. Zeichnen Sie die Zeit auf, zu der L1s auf dem Teller gesät werden, und überprüfen Sie regelmäßig den Entwicklungsstand, um den idealen Zeitpunkt für die Zerlegung zu ermitteln.
   HINWEIS: Bei 52 h nach der Aussaat von L1s sind Würmer, die bei 24 °C kultiviert werden, typischerweise im Jungen Erwachsenenstadium, was die ideale Phase für die Zerlegung von Gonaden-gezielten PLA ist. Der tatsächliche Zeitpunkt, zu dem die synchronisierten Würmer das Stadium des jungen Erwachsenen erreichen, kann jedoch je nach Dehnung und Inkubationstemperatur variieren.

3. Dissektion/Gonadenextrusion

HINWEIS: Die Dissektion, um die Gonade zu extrudieren, ist notwendig, damit die auf Gonaden ausgerichtete PLA erfolgreich funktioniert. Dieser Ansatz kann auch Embryonen freisetzen, die auch mit diesem Protokoll für PLA funktionieren (weitere Informationen finden Sie unter Diskussion). Nach der Zerlegung werden sowohl die Negativkontroll- als auch die Versuchsproben fixiert und parallel für PLA behandelt. Es wird auch vorgeschlagen, einen zusätzlichen Satz von Proben für den Zweck der fluoreszierenden Co-Immunostaining²³ vorzubereiten, um Expressionsmuster der Proteinpartner von Interesse zu demonstrieren.

1. Wählen Sie 30-40 junge erwachsene Würmer in eine Uhrglasschale mit 500 l 1x M9 + Levamisol (2,5 mM Endkonzentration). Nach dem Sammeln der Würmer, entfernen und entsorgen Sie sorgfältig die meisten Medien, um Bakterien zu entfernen, die zusammen mit den Würmern übertragen werden.
2. Fügen Sie frische 500 l von 1x M9 + Levamisol hinzu und verwenden Sie die Pipette, um das Medium sanft zu erstellen und auszugeben, um die Würmer zu spülen. Entfernen und entsorgen Sie sorgfältig die meisten Medien, um Bakterien zu löschen, die zusammen mit den Würmern übertragen werden.
   1. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x-3x, bis alle Bakterien entfernt sind. Nachdem die Wäbungen abgeschlossen sind, lassen Sie Würmer in etwa 100 L Medien, um hydratisiert zu halten.
      HINWEIS: Lassen Sie die Würmer nicht länger als 7 min in den Medien sitzen, da dies die Extrusion von Gonaden während der Zerlegung beeinträchtigt. Führen Sie Wähungen mit Hilfe eines Sezierensmikroskops durch, um die Entfernung von Medien zu überwachen, damit Würmer nicht verloren gehen.
3. Übertragen Sie Würmer mit einer Glas- oder Polyethylenpipette auf einen 25 mm x 75 mm Mikroskopschlitten, der mit 0,001 % Poly-L-Lysin beschichtet ist (die bei diesem Verfahren verwendeten Dias haben einen Epoxid-beschichteten Umfang, so dass drei Arbeitsbereiche mit jeweils 14 mm x 14 mm vorhanden sind). Entfernen Sie überschüssige Medien, so dass ca. 10-15 L Medien übrig bleiben.
4. Legen Sie mit Hilfe eines Sezierendes Mikroskops und mit zwei 261/2-Messnadeln eine Nadel über die andere, so dass die Enden eine Schere bilden. Schneiden Sie mit Nadeln, die auf diese Weise ausgerichtet sind, Würmer hinter dem Rachen, um die Keimbahnen freizusetzen. Sezieren Sie alle Würmer innerhalb von 5 Minuten.
   HINWEIS: Weitere Einzelheiten zur Durchführung von Sezierungen finden Sie in einer früheren Publikation von Gervaise und Arur³⁰.
5. Nachdem alle Würmer seziert sind, legen Sie vorsichtig einen 22 mm x 40 mm Deckel über den Schlitten, so dass er senkrecht zum Schlitten ist. Die Enden des Coverslips sollten an der Rutsche hängen.
6. Einfrieren Sie die Rutschen auf einem vorgekühlten Aluminiumblock, der mindestens 20 min auf Trockeneis gehalten wird. Legen Sie vorsichtig einen gekühlten Bleistift auf den Deckel, um zu verhindern, dass sich der Deckelrutsch durch Eisausdehnung löst.

4. Fixierung/Blockierung

1. Wenn Sie zur Fixierung bereit sind, die Abdeckungen mit einem Bleistift oder einem anderen stumpfkantigen Werkzeug abstreifen und das Dia sofort 1 min in ein Glas mit frischem, eiskaltem Methanol (gekühlt auf -20 °C) tauchen.
2. Wischen Sie die Ränder des Dias, die die Probe umgeben, vorsichtig ab, sodass das nächste Reagenz durch Oberflächenspannung um die Probe gehalten wird. 150 l fixativ (2% Formaldehyd in 100 mM KH₂PO_4, pH = 7,2) für 5 min bei RT auftragen.
   HINWEIS: Wir haben auch ein Methanol/Aceton-Fixierungsverfahren^31,32 getestet und festgestellt, dass es mit der PLA-Reaktion kompatibel ist.
3. Berühren Sie den Schlitten in einem senkrechten 90°-Winkel auf ein Papiertuch, um das Fixiergerät vom Schlitten laufen zu lassen und in das Papiertuch zu absorbieren. Block-Dias 2x für 15 min bei RT in einem Coplin-Glas mit 50 ml 1x PBS/1% Triton X-100/1% Rinderserumalbumin (PBT/BSA).
   HINWEIS: Coplin-Gläser oder andere Arten von Färbegläsern werden für diesen Sperrschritt und die Waschschritte unten in den Abschnitten 6-9 empfohlen. Diese bieten ausreichende Volumina für einen effizienten Austausch von Blockierungs- oder Waschpuffer mit der Probe.
4. Blockschlitten mit einer PBT/BSA-Lösung, die 10% normales Ziegenserum enthält. Wischen Sie die Kanten, die den Schlitten umgeben, vorsichtig ab und tragen Sie 100 l der Lösung auf die Folie auf. 1 h bei RT in einer feuchten Kammer inkubieren.
   ANMERKUNG: Dieser Schritt wird dringend empfohlen, um mit dem primärantikörper "FLAG" zu färben. Die feuchte Kammer wird durch Diesicherung von Glaspipetten mit Klebeband in der Schale für die Rutschen auf zu legen, wie sie inkubieren. Gedämpfte Aufgabentücher (Materialtabelle) werden in das Fach gelegt, um die innere Feuchtigkeit des Fachs zu erhöhen, um Verdunstung zu verhindern. Der Deckel und die Schale sind mit Folie abgedeckt, um die Proben während der lichtempfindlichen Schritte vor Licht zu schützen.
5. Legen Sie das Dia auf ein Papiertuch, damit die PBT/BSA/10%NGS-Lösung vom Schlitten abläuft und die Ränder des Schlittens sanft abwischen. Verwenden Sie das blockierende Reagenz (Materialtabelle), um Folien zu blockieren. Tragen Sie einen Tropfen auf den Raum von 14 mm x 14 mm auf. Inkubieren Sie für 1 h bei 37 °C in einer feuchten Kammer.

5. Primäre Antikörperinkubation

HINWEIS: Um die besten PLA-Ergebnisse und minimalen Hintergrund zu erhalten, kann der Verdünnungsfaktor der primären Antikörper optimiert werden müssen (weitere Details finden Sie unter Diskussion). Darüber hinaus sollten die primären Antikörper in verschiedenen Hosts ausgelöst werden, die der Spezifität der sekundären Antikörper entsprechen, die für PLA verwendet werden.

1. Legen Sie das Dia auf ein Papiertuch, damit das blockierende Reagenz von der Folie abläuft und die Ränder sanft abwischen. Verwenden Sie das Antikörperverdünnungsmittel (Materialtabelle), um die primären Antikörper zu verdünnen. Tragen Sie 40 l Primärantikörperlösung pro 14 mm x 14 mm Raum auf.
2. Inkubieren gleitet in einer feuchten Kammer über Nacht bei 4 °C.

6. PLA-Sonde (sekundärer Antikörper) Inkubation

HINWEIS: Verwenden Sie für die Schritte 6-9 die Waschpuffer A und B bei RT. Wenn die Puffer bei 4 °C gelagert werden, lassen Sie sie vor der Verwendung auf RT erwärmen.

1. Waschen Sie Dias 2x für 5 min mit 50 ml 1x Waschpuffer A (Materialtabelle) bei RT in einem Coplin Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm.
2. Legen Sie das Dia auf ein Papiertuch, um den Waschpuffer von der Folie laufen zu lassen und die Kanten vorsichtig abzuwischen. Bereiten Sie eine 40-L-Lösung mit PLUS- und MINUS-Sonden (verdünnt 1:5 mit Antikörperverdünnung) vor. Tragen Sie die Lösung auf jeden Raum von 14 mm x 14 mm auf.
3. Inkubieren Sie in einer feuchten Kammer für 1 h bei 37 °C.

7. Ligation

1. Schlitten 2x für 5 min mit 50 ml 1x Waschpuffer A bei RT in einem Coplin-Glas waschen. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm.
2. Verdünnen Sie den Ligationspuffer (Materialtabelle) 1:5 mit Reinstwasser. Verwenden Sie diesen Puffer, um die Ligase (Tabelle der Materialien) 1:40 zu verdünnen, um einen Arbeitsbestand der Ligationslösung vorzubereiten.
   1. Legen Sie die Folie auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer von der Folie abläuft und die Kanten sanft abwischen. Tragen Sie 40 l der Ligationslösung auf jeden Raum von 14 mm x 14 mm auf.
3. Inkubieren Sie in einer feuchten Kammer für 30 min bei 37 °C.

8. Verstärkung

HINWEIS: Die Verwendung von Detektionsreagenzien mit roten Fluorophoren (Materialtabelle) führt zu der geringsten Menge an Hintergrund im C. elegans Gewebe.

1. Schlitten 2x für 5 min mit 50 ml 1x Waschpuffer A bei RT in einem Coplin-Glas waschen. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm.
2. Den Amplifikations-Rotpuffer (Materialtabelle) 1:5 mit Reinstwasser verdünnen. Verwenden Sie diesen Puffer, um die Polymerase (Materialtabelle) 1:80 zu verdünnen, um einen Arbeitsbestand an Amplifikationslösung vorzubereiten und vor Licht zu schützen.
   1. Legen Sie die Folie auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer von der Folie abläuft und die Kanten sanft abwischen. Tragen Sie 40 l der Amplifikationslösung auf jeden Raum von 14 mm x 14 mm auf.
3. Inkubieren Sie in einer feuchten Kammer für 1 h und 40 min bei 37 °C. Stellen Sie sicher, dass die feuchte Kammer mit Folie bedeckt ist, um die Proben vor Licht zu schützen.

9. Letzte Wähungen

1. Schlitten 2x für 10 min mit 50 ml 1x Waschpuffer B (Materialtabelle) bei RT in einem Coplin Glas waschen. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm.
2. Schlitten 1x für 1 min mit 50 ml 0,01x Waschpuffer B bei RT in einem Coplin Glas waschen. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm. Dieser Puffer wird durch Verdünnen von Waschpuffer B mit Reinstwasser hergestellt.

10. Coverslip-Montage

1. Lassen Sie den überschüssigen Waschpuffer von der Rutsche auf ein Papiertuch laufen und wischen Sie den verbleibenden Restpuffer auf dem epoxybeschichteten Umfang des Dias ab.
2. Fügen Sie 10 L Desmontagemedium(Materialtabelle) zur Probe hinzu und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf darauf, so dass sich das Montagemedium ausbreiten kann.
3. Malen Sie um den Rand des Coverslip mit Nagellack, um den Deckelschlupf zu versiegeln und zu gleiten. Seien Sie sanft mit der Anwendung von Nagellack, um zu vermeiden, dass der Deckelrutsch bewegt wird, was die Keimbahnen beschädigen wird. Lassen Sie den Nagellack mindestens 20 min bei RT aushärten, während die Dias vor Licht geschützt sind, bevor Sie ihn unter dem Mikroskop betrachten.
4. Lagern Sie Dias in einem dunklen Behälter oder Diahalter, da PLA-markierte Proben lichtempfindlich sind. Der Hersteller schlägt vor, dass Dias bei -20 °C für die Langzeitlagerung oder bei 4 °C für die kurzfristige Lagerung gelagert werden können. Die mit diesem Protokoll erstellten Folien halten mindestens 2 Monate, wenn sie bei 20 °C gelagert werden.

11. Bildaufnahme

1. Verwenden Sie zur Quantifizierung ein konfokales Mikroskop, um Bilder von extrudierten Keimlinien zu erfassen, die sich in freier Sicht, unbeschädigt und ungehindert befinden. Erfassen Sie einen Z-Stack der Keimbahn, der die gesamte Keimbahn in der Z-Ebene überspannt, und erzeugen Sie ein maximales Projektionsbild, das für die Quantifizierung verwendet werden kann.
   HINWEIS: Die konfokale Mikroskopie ist ideal für die Gewinnung und Quantifizierung von PLA-Bildern mit weniger Hintergrund im Vergleich zu denen, die mit einem Epifluoreszenzmikroskop erhalten wurden.
   1. Wenn die Keimbahn nicht in ein Sichtfeld passt, erfassen Sie die überlappenden Sichtfelder nach Bedarf, um die gesamte Keimbahn abzubilden. Maximale Projektionen dieser Bilder können in FIJI zusammengenäht werden.
2. Achten Sie darauf, die Bildbedingungen zwischen Kontroll- und Versuchsproben gleich zu halten, um einen fairen und angemessenen Schwellenwert für die Identifizierung von Brennpunkten während der Bildanalyse festzulegen.
   HINWEIS: Erfassen Sie mindestens 8-10 Keimlinien aus jeder Probe pro Replikation, um die statistische Analyse der PLA-Quantifizierung zu erleichtern. Mindestens drei biologische Repliken werden für PLA empfohlen, um zuverlässige und konsistente quantitative Ergebnisse zu erzielen.

12. Bildanalyse und Quantifizierung mit FIJI/ImageJ

HINWEIS: Der folgende Workflow basiert auf Bildern, die mit dem 40-fachen Objektiv auf einem konfokalen Mikroskop aufgenommen wurden, in dem Bilder im .czi-Format gespeichert werden. Diese .czi-Bilder und die dazugehörigen Metadaten, einschließlich Der Dimensionen, können in FIJI/ImageJ zur weiteren Analyse abgerufen und geöffnet werden. Es sollte geprüft werden, ob FIJI das Format der konfokalen Dateien aus dem konfokalen akzeptiert, das dem jeweiligen Benutzer zur Verfügung steht. Wenn dies nicht der Fall ist, können Bilder im .tiff-Format alternativ für die Analyse verwendet werden, aber der Benutzer muss den Maßstab des Bildes manuell in FIJI/ImageJ (Analyze | Set-Skala). Es wird empfohlen, alle negativen Kontrollbilder zuerst zusammen zu analysieren, um die Hintergrundebene zu ermitteln.

1. Starten Sie den Analyseworkflow, indem Sie zuerst alle negativen Kontrollbilder analysieren und dann zu den experimentellen Beispielen übergehen. Öffnen Sie ein maximales Projektionsbild in FIJI/ImageJ, um es zu analysieren (Abbildung 2A). Wenn Sie eine .czi-Datei verwenden, wird ein Feld Bio-Formats Import Options aufgefordert.
   1. Fügen Sie die folgenden Optionen hinzu, um Ihr Bild zu öffnen: Ansichtsstapel mit Datenbrowser; Farbmodus = Koloriert. Ein Fenster mit dem Bild sollte nun mit einer Schiebeleiste geöffnet werden, um zwischen verschiedenen Kanälen umzuschalten, die von konfokalen Kanälen erfasst werden (z. B. DAPI oder PLA).
   2. Wenn Bilder genäht werden müssen, erstellen Sie Duplikate jedes Kanals aus jedem Bild, indem Sie das Bild mit der Maus rechts auswählen und Duplizieren auswählen, um das Fenster Duplizieren zu öffnen. Geben Sie nur die Kanalnummer (c) an, die dem PLA- oder DAPI-Kanal entspricht (z. B. 2), und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für Duplicate Hyperstack.
   3. Wenn beide Bilder geöffnet werden sollen, wählen Sie Plugins | Nähte | Veraltet | 2D-Nähte. Ein Stitching of 2D Images-Fenster wird geöffnet. Wählen Sie aus, welche Bilder zum Heften verwendet werden sollen, und verwenden Sie die Standardparameter, die im Fenster voreingestellt sind, und wählen Sie dann Okaus. Das resultierende Bild ist ein zusammengesetztes Graustufenbild.
      HINWEIS: Wenn die Unterbilder nicht perfekt ausgerichtet sind, passen Sie die Parameter an (d. h. die Anzahl der zu überprüfenden Spitzen von 5 auf 500 erhöhen oder die Fusionsmethode von Linear Blending auf Max ändern. Intensität) kann helfen, das gewünschte Bild zu erhalten. Während andere Nähwerkzeuge zur Verfügung stehen, behält dieser Ansatz die Dimensionalität des Bildes bei, was für die Quantifizierung wichtig ist.
2. Öffnen Sie den ROI-Manager (Region of Interest), indem Sie T auf der Tastatur drücken. Ein neues Fenster mit dem Namen ROI Manager wird geöffnet.
3. Wählen Sie das Polygonwerkzeug aus dem Feld FIJI-Toolset aus. Drop-Punkte um die Keimbahn, um sie zu skizzieren und einen ROI zu generieren (Abbildung 2B). Verbinden Sie den letzten Punkt mit dem ersten Punkt, um einen vollständigen ROI zu generieren.
   HINWEIS: Bei dunkleren Bildern ist es hilfreich, den Kontrast anzupassen, um die Sichtbarkeit der Keimbahn (die reversibel ist) zu verbessern, damit sie genauer umrissen werden kann.
   1. Gehen Sie unmittelbar nach Abschluss des ROI zum ROI-Manager, und wählen Sie Hinzufügen [t] aus, um den ROI zu speichern. Es ist zwingend erforderlich, dass alle Änderungen am ROI, einschließlich hinzufügen/entfernen von Punkten oder Bewegung des ROI und der Punkte aktualisiert werden (wählen Sie Aktualisieren vom ROI-Manager), bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren, oder sie gehen verloren. Weitere Details zur Manipulation von ROIs und deren Punkten finden Sie im FIJI/ImageJ-Benutzerhandbuch.
4. Sobald die ROI-Ausrichtung festgelegt ist, kann sie für eine spätere Referenz gespeichert werden, indem Sie den ROI-Namen im ROI-Manager gefolgt von Mehr | Speichern | (Namensdatei und Angabe des Ziels, wo gespeichert werden soll). Gespeicherte ROIs können im ROI-Manager geöffnet werden, indem Sie Mehr | Öffnen | (wählen Sie die Datei aus).
5. Messen Sie den Bereich innerhalb des ROI, indem Sie den ROI-Namen aus dem ROI-Manager auswählen und dann die Schaltfläche Messen im ROI-Manager auswählen. Ein Ergebnisfenster wird mit Informationen über den ROI geöffnet, einschließlich des²Bereichs, den er im Bild abdeckt (Einset von Abbildung 2B). Zeichnen Sie diese Informationen in einer Kalkulationstabelle für nachfolgende Berechnungen auf.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Maßstab des Bildes richtig eingestellt wurde, damit die richtigen Abmessungen des ROI erfasst werden. Die im Feld Ergebnisse gemeldeten Messtypen können geändert werden, indem Sie zu Analysieren | Messen festlegen....
6. Öffnen Sie ein doppeltes Bild nur des PLA-Kanals, indem Sie das PLA-Bild rechts auswählen und Duplizieren auswählen (Abbildung 2C). Ein Duplikatfenster wird geöffnet. Geben Sie nur die Kanalnummer (c) an, die dem PLA-Kanal entspricht (z. B. 2), und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für Duplicate Hyperstack. Es wird empfohlen, dieses Bild zu duplizieren, damit das Originalbild nicht geändert wird.
   HINWEIS: Diese Optionen werden nur angezeigt, wenn die Bilder angezeigt werden, die mehrere Kanäle auf FIJI/ImageJ enthalten. Ein alternativer Ansatz besteht darin, die Kanäle zu teilen Image | Farbe | Split Channels, aber dies ändert Ihre ursprüngliche Bilddatei.
7. Wenn nur das Bild des PLA-Kanals ausgewählt ist, gehen Sie zu Bild | Anpassen | Schwellenwert. Ein Schwellenwertfenster für das Bild wird geöffnet. Wählen Sie Standard als Schwellenwertmethode, Rot als Farbe und das Kontrollkästchen Dunkles Hintergrundaktivieren aus. Schieben Sie die Leiste mit der oberen Spur im Fenster nach rechts, bis alle PLA-Brennpunkte im Bild deutlich hervorgehoben sind.
   1. Zeichnen Sie den Wert im Feld rechts von der oberen Spur auf, und notieren Sie, welcher Wert zum Festlegen des Schwellenwerts verwendet wurde. Wählen Apply Sie Im Fenster Schwellenwert anwenden aus, um den Schwellenwert zu finalisieren, und das Bild wird in einen weißen Hintergrund konvertiert, wobei nur die Schwellenwerte als schwarze Punkte sichtbar sind (Abbildung 2D). Testen Sie den Schwellenwert für mehrere Negative-Kontrollbilder, um sicherzustellen, dass er für die Erfassung aller PLA-Brennpunkte von Bild zu Bild vor der Quantifizierung geeignet ist.
      ANMERKUNG: Um Schwellenwert-Brennpunkte als schwarze Punkte auf weißem Hintergrund anzuzeigen, gehen Sie zu Prozess | Binär | Optionen... und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen "Schwarzer Hintergrund". Ein Schwellenwert zwischen 30-40 ist ein guter Ausgangspunkt für die Identifizierung von PLA in der Keimbahn; Der ideale Wert kann jedoch je nach Hintergrund variieren.
8. Um die PLA-Schwerpunkte zu quantifizieren, wenden Sie den roi aus den Schritten 12.3-12.3.1 auf das Schwellenwertbild an, indem Sie den ROI-Namen aus dem ROI-Manager-Fenster auswählen. Die Umrisslinie des ROI sollte auf dem Bild an der gleichen Stelle wie aus dem Quellbild angezeigt werden (Abbildung 2E).
   1. Gehen Sie zu Analysieren | Analysieren von Partikeln. Das Fenster Partikel analysieren öffnet sich und wählt die folgenden Parameter aus: Größe (Mikron 2) = 0-Unendlichkeit, Zirkularität = 0,00-1,00, anzeigen = Nichts. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zusammenfassen.
   2. Wählen Sie Okaus, und eine Zusammenfassungstabelle wird mit Informationen über den ROI (d. h. die Gesamtzahl der PLA-Brennpunkte, die Gesamtfläche, die von den PLA-Brennpunkten im ROI belegt wird, die durchschnittliche Größe der PLA-Brennpunkte und den Prozentsatz der fläche, die von PLA-Brennpunkten im Verhältnis zur Größe des ROI belegt wird) angezeigt (Einset von Abbildung 2E). Zeichnen Sie diese Messungen in einer Kalkulationstabelle auf.
9. Wiederholen Sie die Schritte 12.1-12.8 für mehrere Negative-Kontrollbilder mit demselben Schwellenwert.
   1. Nachdem alle negativen Kontrollbilder analysiert wurden, wiederholen Sie die Schritte 12.1-12.8 für alle experimentellen Proben mit demselben Schwellenwert, der durch die negative Kontrolle bestimmt wurde, um PLA-Brennpunkte zu identifizieren und zu quantifizieren.

Ergebnisse

Co-Immunostaining beider 3xFLAG::DLC-1; GFP und 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP-Keimbahnen mit FLAG- und GFP-Antikörpern zeigten ihre Expressionsmuster in der Keimbahn (Abbildung 3Aii-iii,3Bii-iii). Während GFP in der gesamten Keimbahn exprimiert wurde (Abbildung 3Aiii), war die OMA-1::GFP-Expression auf die späten Pachyten und Eizellen beschränkt (Abbildung 3Biii<...

Diskussion

Bei der Untersuchung von PPI in der C. elegans Keimbahn ermöglicht die höhere Auflösung, die PLA im Vergleich zur Co-Immunostainierung bietet, die Visualisierung und Quantifizierung von Orten, an denen Wechselwirkungen in der Keimbahn auftreten. Es wurde zuvor berichtet, dass DLC-1 direkt mit OMA-1 interagiert, indem ein in vitro GST Pulldown-Assay²⁶verwendet wird; Diese Wechselwirkung wurde jedoch nicht durch einen In-vivo-Pulldown wiederhergestellt. Die fluoreszierende Co-Immun...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
16% Paraformaldehyd-Lösung	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	15710	zur Herstellung von 4% Arbeitslösung
verwendet 1M KH2PO4	Sigma	P0662	Bereiten Sie ein 1M Arbeitsmaterial
vor 1x M9	verschiedene		verschiedene vorbereitet als 10x Stoff verwendet bei 1x; siehe wormbook.org für Protokoll
1x PBS	verschiedene		verschiedene siehe wormbook.org für Protokoll
26,5 Gauge Nadel	Exel International	26402	Nadeln zum Sezieren
BSA	Lampire	7500802
Zentrifugenröhrchen	Thermo Scientific	05-529C	50ml Oak Ridge Zentrifugenröhrchen zur Synchronisation
Konfokalmikroskop	Zeiss	880
Coplin Jar	PolyLab	62101
Deckglas zum Einfrieren von Proben	Globe Scientific	1411-10	22x40mm, Nr. 1
Deckglas zum Einfrieren des Objektträgers	Globe Scientific	1404-15	22x22mm, Nr. 1,5
DAPI Eindeckmedium für Immunfluoreszenzvektor		H-1200
Ligase	Sigma-Aldrich	DUO82029	Duolink 1x Ligase, kommt als Teil des Duolink In Situ Detektionsreagenzien Red Kit DUO92008
Amplifikation roter Puffer	Sigma-Aldrich	DUO82011	Duolink 5x Amplifikation Roter Puffer, Kommt als Teil des Duolink In Situ Detection Reagents Red Kit DUO92008
Ligation Buffer	Sigma-Aldrich	DUO82009	Duolink 5x Ligation Puffer, Kommt als Teil des Duolink In Situ Detection Reagents Red Kit DUO92008
Antikörper-Verdünnungsmittel	Sigma-Aldrich	DUO82008	Duolink-Antikörperverdünnungsmittel, Kommt mit DUO92004 und DUO92002, Hinweis: Eine 1x PBS/1% BSA-Lösung kann auch als Ersatz verwendet werden, um den Antikörper zu verdünnen.
Blockierungslösung	Sigma-Aldrich	DUO82007	Duolink Blockierungslösung, Lieferung mit DUO92004 und DUO92002
Eindeckmedium für PLA	Sigma-Aldrich	DUO82040	Duolink In-Situ-Eindeckmedium mit DAPI
MINUS Sonde	Sigma-Aldrich	DUO92004	Duolink In-Situ-Sonde Anti-Maus MINUS
PLUS Sonde	Sigma-Aldrich	DUO92002	Duolink In-Situ-Sonde Anti-Rabbit PLUS
Waschpuffer A	Sigma-Aldrich	DUO82046	Duolink In Situ Waschpuffer A
Waschpuffer B	Sigma-Aldrich	DUO82048	Duolink In Situ Waschpuffer B
Polymerase	Sigma-Aldrich	DUO82030	Duolink Polymerase, kommt als Teil des Duolink In Situ Detektionsreagenzien Rotes Kit DUO92008
Epifluoreszenzmikroskop	Leica		DFC300G Kamera, DM5500B Mikroskop
Ziege Anti-Maus Alexa 594	JacksonImmuno	115-585-146	Verwendung bei 1:500
Ziege Anti-Kaninchen Alexa 488	JacksonImmuno	111-545-144	Verwendung bei 1:200
Bildbearbeitungssoftware	Adobe		Adobe Photoshop + Illsutrator CS3
Glaspipette	Corning	7095B-5X
Levamisol	ACROS Organische Stoffe	187870100	Bereiten Sie ein 250mM Arbeitsmaterial
vor Methanol	Fisher Scientific	A454
Maus Anti-FLAG	Sigma	F1804	Bei 1:1000 für Immunfluoreszenz und PLA verwenden, mit normalem Ziegenserum vorblockieren
empfohlen Nagellack	L.A. Farben	CNP195
Nematode Growth Medium (NGM)verschiedenes			Siehe wormbook.org für Protokoll
Normales Ziegenserum	JacksonImmuno	005-000-121
Polyethylen-Pasteur-Pipette	Globe Scientific	135030
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich	P1524	Hergestellt als 0,1%ige Stammlösung in Wasser, gelagert bei -20 °C und 1:100 in Wasser verdünnt, um Objektträger zu beschichten
Petrischalen	Tritech	PD7060	60 mm Durchmesser
Anti-GFP	Thermo Fisher	G10362	Verwendung bei 1:200 für Immunfluoreszenz, 1:4000 für PLA-Objektträger
	Thermo Fisher	30-2066A-Braun	Dreiquadratische autoklavierbare Objektträger mit 14x14 mm werden über Fisher Scientific bestellt. Poly-L-Lysin wird Objektträgern im Labor zugesetzt
Natriumhypochlorit-Lösung	Fisher Scientific	SS290-1
Arbeitstücher	Kimtech	34120	4,4 x 8,4 Zoll Arbeitstücher
Tabletts (242 x 241 x 20 mm)	Thermo Fisher	240845	Wird zur Herstellung von Feuchtkammern
verwendet Triton X-100	ACROS Organics	327372500
Reinstwasser	Milli-Q		Reinstwasser gewonnen aus Milli-Q Integral Wasseraufbereitungssystem
Uhrglas	Carolina Biological	742300-20
° C Gefrierschrank-80
&Grad; C Gefrierschrank
Aluminiumfolie
OP50 Stamm E. coli
Orbital Shaker
Tape
Nematodenstämme, die in dieser Studie verwendet wurden (beide auf Anfrage erhältlich)
mntSi13[pME4.1] II; unc-119(ed3) III; teIs1 [pRL475]		UMT 376	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP; Referenz 24
mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III		UMT 422	dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+); Referenz: diese Studie