In Situ Detektion von Ribonucleoprotein Complex Assembly in der C. elegans Germline mit Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay ermöglicht es Benutzern, Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ zu erkennen, und zeigt räumliche und zeitliche Muster der Wechselwirkungen auf. Diese Technik kann helfen, wichtige Fragen zur Regulierung der C.elegans Entwicklung zu beantworten. Diese Technik bietet eine vergleichbare Empfindlichkeit für den Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen ohne die Komplexität anderer Techniken wie FRET und BiFC.

Personen, die noch nie Würmer seziert haben, um die Gonaden zu befreien, können mit diesem Schritt kämpfen. Üben Sie das Sezieren von Würmern und verwenden Sie sie für die Immunfluoreszenz, um die Handhabungs- und Seziertechniken zu perfektionieren, bevor Sie zu PLA übergehen. Zunächst sollten 30 bis 40 junge würmer in eine Uhrenglasschale mit 500 Mikrolitern 1x M9 und Levamisol gepflücken.

Nach dem Sammeln der Würmer, entfernen und entsorgen Sie sorgfältig die meisten Medien, um Bakterien zu entfernen, die zusammen mit den Würmern übertragen werden. Fügen Sie frische 500 Mikroliter 1x M9 und Levamisol hinzu und verwenden Sie die Pipette, um die Medien sanft zu erstellen und zu verteilen, um die Würmer zu spülen. Entfernen und verwerfen Sie die meisten Medien sorgfältig.

Wiederholen Sie die Wäsche zwei- bis dreimal. Lassen Sie die Würmer nach dem Einwälten nicht länger als acht Minuten in etwa 100 Mikroliter Medien. Übertragen Sie die Würmer mit einer Glas- oder Polyethylenpipette auf einen 25-Millimeter-x-75-Millimeter-Mikroskopschlitten, der mit 001%poly-L-Lysin beschichtet ist.

Entfernen Sie das überschüssige Medium, so dass ca. 15 Mikroliter Medien auf der Folie verbleiben. Das Entfernen des überschüssigen Puffers ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die sezierten Würmer und Gonaden an der Folie haften. Unter einem Sezieren des Mikroskops, mit zwei 26 1/2-Spurnadeln, legen Sie eine Nadel über die andere, so dass die Enden eine Schere bilden.

Schneiden Sie die Würmer hinter dem Rachen mit den auf diese Weise orientierten Nadeln, um die Keimbahnen freizusetzen. Sezieren Sie alle Würmer innerhalb von fünf Minuten. Nachdem alle Würmer seziert sind, legen Sie vorsichtig einen 22-Millimeter-mal-40-Millimeter-Deckel über den Schlitten, so dass er senkrecht zum Schlitten ist.

Die Enden des Coverslips sollten an der Rutsche hängen. Einfrieren Der Rutschen auf einem vorgekühlten Aluminiumblock, der mindestens 20 Minuten auf Trockeneis gehalten wird. Legen Sie vorsichtig einen gekühlten Bleistift auf den Deckelschlupf, um zu verhindern, dass sich der Deckelrutsch durch Eisausdehnung löst.

Wenn Sie zur Fixierung bereit sind, streichen Sie die Abdeckungen mit einem Bleistift ab und tauchen Sie das Dia sofort für eine Minute in ein Glas mit frischem, eiskaltem Methanol. Wischen Sie dann vorsichtig die Ränder des Dias um die Probe herum ab und wenden Sie 150 Mikroliter Formaldehyd fixativ bei Raumtemperatur an, um sie fünf Minuten lang zu fixieren. Berühren Sie die Folie auf ein Papiertuch in einem senkrechten 90-Grad-Winkel, um das Fixativ von der Rutsche laufen zu lassen und in das Papiertuch zu absorbieren.

Blockieren Sie die Dias zweimal für 15 Minuten bei Raumtemperatur in einem Coplin-Glas mit 50 Milliliter PBT/BSA. Blockieren Sie dann die Dias mit einer PBT/BSA-Lösung, die 10% normales Ziegenserum enthält. Wischen Sie die Kanten, die die Folie umgeben, vorsichtig ab, und tragen Sie 100 Mikroliter der Lösung auf jede Folie auf.

Und rühren Sie sanft die Rutsche, um die Lösung zu verbreiten. Eine Stunde bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubieren. Legen Sie die Folie auf ein Papiertuch, damit die Lösung von der Folie abläuft, und wischen Sie die Kanten vorsichtig ab.

Um die Dias zu blockieren, wenden Sie einen Tropfen des blockierenden Reagenzes auf den 14-Millimeter-mal-14-Millimeter-Raum an. Inkubieren Sie die Rutschen für eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einer feuchten Kammer. Legen Sie die Dias auf ein Papiertuch, damit das blockierende Reagenz von der Folie abläuft, und wischen Sie die Ränder vorsichtig ab.

Verwenden Sie das Antikörperverdünnungsmittel, um die primären Antikörper zu verdünnen. Tragen Sie 40 Mikroliter der verdünnten Primärantikörperlösung pro 14 mal 14 Millimeter Raum auf die Dias auf. Die Rutschen in eine feuchte Kammer geben und über Nacht bei vier Grad Celsius bebrüten.

Morgens die Dias zweimal für fünf Minuten waschen, jeweils mit 50 Millilitern 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur in einem Coplin-Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm. Legen Sie die Dias auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer von der Folie abläuft, und wischen Sie die Kanten vorsichtig ab.

Bereiten Sie eine 40-Mikroliter-Lösung mit Plus- und Minussonden vor. Fügen Sie die Lösung zu jedem 14 mal 14 Millimeter großen Raum hinzu. Inkubieren Sie die Rutschen in einer feuchten Kammer für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie die Dias zweimal für jeweils fünf Minuten mit 50 Millilitern 1x Waschpuffer A bei Raumtemperatur in einem Coplin-Glas. Stellen Sie das Coplin-Glas auf einen Orbital-Shaker auf 60 Rpm. Den Ligationspuffer eins bis fünf mit Reinstwasser verdünnen.

Verwenden Sie diesen Puffer, um die Ligase eins bis 40 zu verdünnen, um einen Funktionierenbestand an Ligationslösung vorzubereiten. Legen Sie die Folie auf ein Papiertuch, damit der Waschpuffer von den Seiten abläuft, und wischen Sie die Kanten vorsichtig ab. Fügen Sie 40 Mikroliter der Ligationslösung zu jedem 14-mal-14-Millimeter-Raum hinzu.

Inkubieren Sie die Rutschen in einer feuchten Kammer für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach dem Waschen und Trocknen der Dias, wie zuvor beschrieben, 40 Mikroliter frisch zubereitete, lichtgeschützte Verstärkungslösung auf jeden 14 mal 14 Millimeter großen Raum hinzufügen. Inkubieren Sie die Rutschen in der feuchten, dunklen Kammer für eine Stunde und 40 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Waschen Sie die Dias zweimal für 10 Minuten mit 50 Milliliter 1x 1x Waschpuffer B, und waschen Sie die Dias einmal für eine Minute mit 50 Milliliter 01x Waschpuffer B. Nach dem Trocknen des epoxy-beschichteten Umfangs des Dias, fügen Sie 10 Mikroliter Montagemedium zu jeder Probe hinzu und legen Sie vorsichtig einen Deckelaufschub auf die Oberseite, so dass sich das Montagemedium ausbreiten kann. Malen Sie um den Rand des Coverslip mit Nagellack, um den Deckelschlupf zu versiegeln und zu gleiten. Vermeiden Sie es, den Deckelzuschlag zu verschieben.

Lassen Sie den Nagellack mindestens 20 Minuten bei Raumtemperatur aushärten, vor Licht geschützt. Die Ko-Immunostainierung der Keimbahnen mit FLAG- und GFP-Antikörpern zeigte ihr Ausdrucksmuster in der Keimbahn. Während GFP in der gesamten Keimbahn ausgedrückt wurde, war OMA-1:GFP-Expression auf die späten Pachyten und Eizellen beschränkt.

DIE FLAG-Immunostainierung zeigt, dass 3xFLAG:DLC-1 in beiden Stämmen in der Keimbahn exprimiert wurde. Das Fürppdummeis für die PLA-Quantifizierung in der Keimbahn interessierte sich um das späte Pachyten durch die Eizellen in allen Keimlinien. Dies ist die Region des OMA-1-Ausdrucks.

3xFLAG:DLC-1, OMA-1:GFP Keimbahnen schienen eine größere Menge an PLA-Brennpunkten in dieser Region zu haben als die 3xFLAG:DLC-1, GFP Keimbahnen. Stellen Sie sicher, dass genügend Wasser vorhanden ist, um die Feuchtigkeit in der Kammer zu erhöhen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Dias innerhalb der Kammer eben sind, um den Ablauf von Reagenzien zu verhindern.

Nach dem Proximity-Ligationstest können die extrudierten Gonaden auf einem konfokalen Mikroskop abgebildet und mit Demobfiji, ImageJ-Workflow, quantifiziert werden. Diese Quantifizierung kann helfen, festzustellen, ob die Wechselwirkung statistisch signifikant ist. PLA ermöglichte es uns, In-situ-Wechselwirkungen zwischen kritischen Regulatoren der Nematodenkeimbahnentwicklung zu bewerten.