Bestimmung der chemischen Inhibitor-Effizienz gegen intrazelluläre toxoplasma Gondii Wachstum mit einem Luziferase-basierten Wachstumstest

Melanie Key; Amy Bergmann; Chiara Micchelli; L. Brock Thornton; Sophie Millard; Zhicheng Dou

doi:10.3791/60985

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Methodenartikel

Bestimmung der chemischen Inhibitor-Effizienz gegen intrazelluläre toxoplasma Gondii Wachstum mit einem Luziferase-basierten Wachstumstest

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DOI:

10.3791/60985

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29. April 2020

Melanie Key^*¹^,² , Amy Bergmann^*¹^,² , Chiara Micchelli¹^,² , L. Brock Thornton¹^,² , Sophie Millard¹^,² , Zhicheng Dou¹^,²

¹Department of Biological Sciences, Clemson University, ²Eukaryotic Pathogens Innovation Center, Clemson University

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Präsentiert hier ist ein Protokoll zur Bewertung der Hemmungswirksamkeit chemischer Verbindungen gegen in vitro intrazelluläres Wachstum von Toxoplasma gondii mit einem luziferase-basierten Wachstumstest. Die Technik wird verwendet, um die Hemmungsssspezifität durch genetische Deletion des entsprechenden Zielgens zu bestätigen. Die Hemmung von LHVS gegen TgCPL-Protease wird als Beispiel bewertet.

Zusammenfassung

Toxoplasma gondii ist ein Protozoen-Erreger, der die menschliche Bevölkerung stark betrifft. Die aktuellen Antibiotika zur Behandlung der klinischen Toxoplasmose sind begrenzt. Darüber hinaus zeigen sie Nebenwirkungen in bestimmten Gruppen von Menschen. Daher ist die Entdeckung neuartiger Therapeutika für die klinische Toxoplasmose unerlässlich. Der erste Schritt der neuartigen Antibiotikaentwicklung besteht darin, chemische Verbindungen zu identifizieren, die eine hohe Wirksamkeit bei der Hemmung des Parasitenwachstums zeigen, indem eine Screening-Strategie mit hohem Durchsatz verwendet wird. Als obligate intrazellulärer Erreger kann sich Toxoplasma nur innerhalb von Wirtszellen replizieren, was die Verwendung optischer Absorptionsmessungen als schneller Wachstumsindikator verbietet. Hier wird ein detailliertes Protokoll für einen luziferase-basierten Wachstumstest vorgestellt. Als Beispiel wird diese Methode verwendet, um die Verdoppelungszeit von Toxoplasma-Parasiten des Typs Wildtyp zu berechnen und die Wirksamkeit von Morpholinurea-Leucyl-Homophenyl-Vinyl-Sulfonphenyl (LHVS, einer Cystein-Protease-targeting-Verbindung) in Bezug auf die Hemmung des intrazellulären Parasitenwachstums zu messen. Ebenfalls beschrieben ist ein CRISPR-Cas9-basiertes Gen-Löschprotokoll in Toxoplasma unter Verwendung von 50 bp homologen Regionen für homologieabhängige Rekombination (HDR). Durch die Quantifizierung der Hemmungswirksamkeiten von LHVS in Wildtyp und TgCPL (Toxoplasma cathepsin L-like protease)-defizienten Parasiten wird gezeigt, dass LHVS das Wildtyp-Parasitenwachstum effizienter hemmt als das Wachstum von Cpl, was darauf hindeutet, dass TgCPL ein Ziel ist, an das LHVS in Toxoplasmabindet. Die hohe Empfindlichkeit und einfache Operation dieses luziferase-basierten Wachstumstests machen es geeignet für die Überwachung der Toxoplasma-Proliferation und die Bewertung der Arzneimittelwirksamkeit in einer hohen Durchsatz-Weise.

Einleitung

Toxoplasma gondii ist ein sehr erfolgreicher obligate intrazellulärer Parasit, der etwa ein Drittel der menschlichen Bevölkerung infiziert. Seine hohe Übertragungsrate ist vor allem auf seine vielfältigen Übertragungswege zurückzuführen, einschließlich des Verzehrs von untergekochtem Fleisch, der Exposition gegenüber Säugetierreservoirs und der angeborenen Übertragung während der Geburt. T. gondii verursacht hauptsächlich opportunistische Infektionen, die zu schwerer Morbidität und Mortalität bei immungeschwächten Personen führen können¹^,²^,³^,