Diese Arbeit beschreibt zwei Methoden zur Untersuchung der Organentwicklung, eine verbesserte Xenotransplantation auf chorioallantoischer Membran (CAM) aus Aviären Embryonen, die eine Vaskularisation kultivierter embryonaler Organe und Organoide ermöglicht, und eine neuartige feste Z-Richtung. Organkulturmethode mit modifizierten experimentellen Bedingungen, die eine hochauflösende Zeitraffer-Konfokalbildgebung ermöglicht.
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Methodenartikel
Optimierung der Renalorganoid- und Organotypischen Kultur für Vaskularisation, erweiterte Entwicklung und verbesserte Mikroskopie-Bildgebung
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Embryonale Nierenorganotypische Kulturen, insbesondere pluripotente Stammzell-abgeleitete Nierenorganoide, sind ausgezeichnete Werkzeuge, um Entwicklungsprozesse zu verfolgen und Nierenerkrankungen zu modellieren. Die Modelle sind jedoch durch einen Mangel an Vaskularisation und Funktionalität eingeschränkt. Um diesem Problem zu begegnen, wurde ein verbessertes Protokoll für die Methode der Xenogtransplantation von Zellen und Geweben an die chorioallantoische Membran (CAM) eines Aviären Embryos entwickelt, um Vaskularisation und Wiederherstellung des Blutflusses zu erhalten. Die Transplantate sind mit maßgeschneiderten Minireservoirs überzogen, die die Proben am CAM fixieren und mit einem Kulturmedium versorgen, das die Transplantate vor dem Trocknen schützt. Die verbesserte Kulturmethode ermöglicht xenografts bis zu 9 Tage lang zu wachsen. Das Manuskript beschreibt auch, wie optimale Bedingungen für die langfristige konfokale Bildgebung von Renalorganoiden und organotypischen Kulturen mit der zuvor veröffentlichten Fixed Z-Direction (FiZD)-Methode zur Verfügung gestellt werden können. Diese Methode komprimiert sanft ein embryonales Organ oder Organoid zwischen einem Glasdeckel und einer Membran in einer großen Menge an Medium und bietet hervorragende Bedingungen für die Bildgebung für bis zu 12 Tage. Zusammen ermöglichen diese Methoden Vaskularisation und Blutfluss zu Nierenorganoiden und organotypischen Nierenkulturen mit verbesserter konfokaler Bildgebung. Die hier beschriebenen Methoden sind sehr vorteilhaft für die Untersuchung grundlegender und angewandter Funktionen der Nieren ex vivo. Beide Methoden sind auf verschiedene Arten von Geweben und Organoiden anwendbar.
Einleitung
Organotypische Kultur der embryonalen Nieren wurde ein wichtiges Modell zur Studie Nephrogenese vor Jahrzehnten1,2,3. Nierenorganoide stellen ein fortschrittliches Modellsystem zur Untersuchung der Entwicklung gesunder und kranker Nierendar 4. Der Hauptnachteil für beide Methoden ist jedoch, dass keine der beiden Methoden die Hauptfunktion der Niere rekapituliert: Blutfiltration. Nephronen und Renalvaskulatur entwickeln sich in Renalorganoiden und organotypischen Kulturen ähnlich wie im frühen Stadium der In-vivo-Entwicklung; die in vitro gebildeten Glomeruli bleiben jedoch avaskulär5. Die Vaskularisation von ex vivo embryonalen Nieren und Nierenorganoiden wurde zuvor in Transplantationsexperimenten nur unter in vivo-Bedingungen nachgewiesen. Zum Beispiel ermöglicht die Transplantation von menschlichen pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Nierenorganoiden unter einer Mausnierenkapsel die Entwicklung der Nephone im Organoid zu einem funktionellen Stadium6.
Ein Zwischenansatz zwischen reinen In-vitro-Kulturen und In-vivo-Transplantationsmethoden ist die Xenotransplantation in das CAM von Vogelembryonen. Die Vaskularisation der intakten Mausnierenprimordie wurde zuvor mit diesem System7,8demonstriert. Es wurde jedoch auch gezeigt, dass die Renalvaskulatur in der xenotransplantierten murinen Niere vom Wirtenendothel und nicht vom Transplantat9abgeleitet wurde. Diese Beobachtung reduzierte signifikant das Potenzial von chimären (avian-mammalian) Modellen der embryonalen Niere, die Entwicklung der Nierenvaskulatur zu untersuchen, da die experimentellen Bedingungen für das Überleben von spenderabgeleiteten Endothelzellen nicht freizügig waren.
Im ersten Teil dieses Protokolls wird eine verbesserte Methode für die Kultivierung von Maus-Embryonalnieren auf CAM von Aviären Eiern vorgestellt, die mikroökologische Bedingungen der organotypischen Kultur und Xenotransplantation kombiniert. Die wichtigste Verbesserung gegenüber früheren Methoden ist, dass statt der Maus embryonale Nieren und Nierenorganoide direkt auf dem CAM, der Implantationsbereich mit durchlässigen Minireservoirs gefüllt mit Kulturmedium, die das transplantierte Gewebe liefern überlagert werden mit Nährstoffen und schützen Sie sie vor dem Trocknen. Die Erfolgsrate der Experimente steigt deutlich an und die Bedingungen für die Entwicklung der von Spendern abgeleiteten Vaskulatur verbessern sich. Die Anwendung dieser Methode auf Xenotransplant-Kulturen führt zur Entwicklung einer glomerulären Vaskulatur, die aus endogenen Endothelzellen aus Spendernieren besteht.
Die detaillierte Analyse der zellulären Morphogenese ist eine weitere wichtige Anwendung von Nierenkulturmodellen. Zuvor berichtete Methoden der Zeitraffer-Bildaufnahme von Nierenkulturen reichen nur für die Analyse der Gesamtmorphologie und DerMusterung der embryonalen Niere aus, nicht aber für die Verfolgung einzelner Zellen10. Kürzlich wurde eine neuartige Fixed Z-Direction (FiZD) Methode beschrieben, die auf eine hochauflösende konfokale 3D-Zeitraffer-Bildgebung von Renalorganoiden und organotypischen Kulturen abzielte11. Bei diesem Verfahren werden die Organoide und embryonalen Organe sanft zwischen einem Glasdeckel und einer durchlässigen Membran eines Transwell-Einsatzes in einer kundenspezifischen Platte zusammengedrückt, bis die Dicke der Probe 70 m erreicht, was optimale optische Bedingungen für die Bildgebung bietet. Im zweiten Teil der Methoden wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung einer kundenspezifischen Platte und zur Einrichtung von FiZD-Experimenten für die langfristige organoide Bildgebung beschrieben.
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Protokoll
Die Tierpflege und -verfahren entsprachen den finnischen rechtsvorschriften Vorschriften für die Verwendung von Labortieren, dem Europäischen Übereinkommen zum Schutz von Wirbeltieren, die für versuchs- und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden (ETS 123), und der EU-Richtlinie 86/609/EWG.
1. Herstellung von Minireservoirs für die Kultivierung von mausembryonalen Nieren und Nierenorganoiden auf Hühner-CAM und Einrichtung von Xenotransplantationsexperimenten
- Verwenden Sie Transwell-Zellkultureinsätze für 6 Well- oder 12-Well-Platten.
HINWEIS: Je nach Experiment können große oder kleine Minireservoirs verwendet werden. Es ist am besten, kleine Minireservoirs für Xenografting bis zu acht embryonale Nieren oder wenn mehrere Minireservoirs auf demselben Hühnerembryon platziert werden (z. B. Experimentier- und Kontrollproben an demselben Hühner-CAM) zu verwenden. - Schneiden Sie die Seiten der Einsätze mit einem Rotierenden Multitool mit einem Kreissägeblatt oder einer Handsäge ab, um einen 2 mm hohen Kunststoffring mit einer durchlässigen Membran zu erzeugen.
- Polieren Sie die Ränder dieser Minireservoirs mit einem Skalpell oder einem scharfen Messer.
- Sterilisieren Sie die Minireservoirs in 70% Ethanol für mindestens 1 h.
- Waschen Sie die Minireservoirs in autoklaviertem doppelt destilliertem Wasser und lassen Sie sie in einer laminaren Haube trocknen.
- Spülen Sie die Minireservoirs in PBS und Kulturmedium (hochglucoseiert DMEM/10% FBS/1% Penicillin-Streptomycin).
- Legen Sie das Reservoir in eine Petrischale, auf einem Tropfen (600 l/400 l) Kulturmedium mit der Membran nach oben.
- Mit Hilfe einer Pipette oder eines Glaskapillarrohrs sezierte ex vivo embryonale Nieren oder Renalorganoide gleichmäßig auf der Membran anordnen. Vermeiden Sie es, viel Flüssigkeit um die Nieren zu lassen.
- Lassen Sie die Proben für 2–24 h in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2an der Membran befestigen.
HINWEIS: Bis zu acht E11.5 embryonale Mausnieren oder Nierenorganoide können auf dem kleinen Einsatz angeordnet werden. Der große Einsatz wird empfohlen, wenn entweder größere Stücke embryonalen Gewebes für Xenotransplantat oder ein Zell-Hydrogel-Gemisch auf einer größeren Fläche des CAM verwendet werden. - Nehmen Sie 8 Tage alte ex ovo kultivierte embryonale Hühner, die nach zuvor veröffentlichten Methoden aus dem Zellkultur-Inkubator12,13hergestellt wurden.
- Übertragen Sie die Minireservoirs auf das CAM, so dass die Transplantate dem CAM zugewandt sind und die Membran sie überlagert. Legen Sie die Minireservoirs in die Peripherie des CAM, damit sie den Hühnerembryon nicht abdecken.
HINWEIS: Bei Verwendung der kleineren Minireservoirs, die aus Transwell-Einsätzen für 12 Well-Platten hergestellt werden, können bis zu drei Minireservoirs auf einem CAM platziert werden. - Fügen Sie den Minireservoirs 500 l (6 Well Insert) oder 300 l (12 Well insert) des Kulturmediums hinzu.
- Kultivieren Sie die Proben auf Huhn CAM für maximal 9 Tage. Ersetzen Sie das Kulturmedium in den Minireservoirs täglich.
HINWEIS: Die Vaskularisation der Proben kann bereits nach 24–48 h nach der Transplantation beobachtet werden.
2. Herstellung von kundenspezifischen Platten und Einrichten von FiZD-Kulturen
- Bohren Sie Löcher mit 20 mm Durchmesser in den Boden einer 6-Well-Platte.
HINWEIS: Für FiZD-Experimente verwenden Sie 6 Wellplatten mit einer Welltiefe von 16 mm (siehe Materialtabelle). - Polieren Sie die Felgen der Löcher (vor allem auf der Oberseite) mit einem elektrischen Bohrer mit einem Senkmittelbohrer, einem Skalpell oder einem scharfen Messer.
- Sterilisieren Sie die Platten in 70% Ethanol für mindestens 1 h.
- Waschen Sie die Platten in autoklaviertem doppeldestilliertem Wasser und lassen Sie sie unter sterilen Bedingungen trocknen.
- 22 mm x 22 mm Glasabdeckungen mit 70% Ethanol gründlich waschen oder nach dem veröffentlichten Protokoll von Saarela et al.11reinigen.
- Kleben Sie die Abdeckungen an der Oberseite der Löcher in 6 Brunnenplatten mit einem ungiftigen Gewebekleber. Tragen Sie Kleber um das Loch auf und legen Sie den Deckel vorsichtig auf, um es zu bedecken. Lassen Sie den Kleber trocknen.
- Prüfen Sie die Platten unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie bei Bedarf überschüssigen getrockneten Kleber von der Oberfläche der Abdeckungen.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass sich kein Kleber über dem Deckelbeleg befindet, um eine gleichmäßige Kompression der Proben zu gewährleisten. - Mischen Sie Polystyrolperlen (70 m Partikelgröße) mit einem gleichen Hydrogelvolumen. Ein Volumen von 50–100 l pro Brunnen ist ausreichend.
HINWEIS: Halten Sie die Mischung aus Hydrogel und Polystyrol perlen auf Eis. - Legen Sie einen Transwell-Einsatz unter ein Sezierendes Mikroskop mit der Membran nach oben.
- Ordnen Sie die Proben (z. B. ex vivo embryonale Nieren oder Renalorganoide) gleichmäßig auf der Membran an.
- Fügen Sie das Hydrogel/Polystyrol-Perlengemisch neben den Proben sorgfältig hinzu, um Schäden an empfindlichen Geweben zu vermeiden.
- Drehen Sie den Transwell-Einsatz so um, dass die Membran mit den darauf montierten Proben nach unten gerichtet ist.
- Legen Sie den Einsatz vorsichtig in einen Brunnen der modifizierten 6 Well-Platte und drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, so dass die Proben auf das Niveau der Perlen komprimiert werden.
HINWEIS: Verfolgen Sie den Fortschritt der Kompression mit einem Mikroskop. - Halten Sie den Einsatz mit einer Hand leicht auf den Brunnen gedrückt und fixieren Sie ihn an der Platte, indem Sie Kunststoff mit einem Lötkolben an drei Stellen am Rand des Einsatzes schmelzen.
- Wenn der Einsatz an der Platte befestigt ist, fügen Sie 2 ml Kulturmedium (DMEM/10% FBS/1% Penicillin-Streptomycin) in den Brunnen und setzen Sie die Montage der verbleibenden Brunnen in der Platte auf die gleiche Weise fort.
- Übertragen Sie die fertige Platte auf einen inder Inkubator eines invertierten Mikroskops für die Zeitraffer-Bildgebung.
- Führen Sie die Zeitraffer-Bildgebung der Proben mit den entsprechenden experimentellen Einstellungen durch.
HINWEIS: Eine Änderung des Kulturmediums in den Blechen während Zeitrafferexperimenten ist nicht erforderlich, kann aber leicht durch die Löcher an den Seiten des Einsatzes durchgeführt werden.
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Ergebnisse
Das hier vorgestellte CAM-Kulturprotokoll ermöglichte eine hocheffiziente Vaskularisation von Nierenorganoiden und embryonalen Nieren als Folge einer Xenotransplantation am Hühner-CAM (Abbildung 1, Film 1). Minireservoirs, die Kulturmedium enthalten, versorgten das Spendergewebe mit Nährstoffen und schützten es während des Zeitraums vor der eigentlichen Vaskularisation vor dem Trocknen. Diese Methode bot freizügige Bedingungen für Spender-abgeleitete Endothelzellen zu wachse...
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Diskussion
Es werden zwei detaillierte Protokolle vorgestellt, die die klassische renale organotypische Kulturmethode verfeinern und Vaskularisation, erweiterte Entwicklung und optimale 4D-Bild- und Zeitbildgebung von ex vivo embryonalen Nieren und Organoiden ermöglichen. In diesem Abschnitt werden die wichtigen Schritte in den Methoden erläutert und die Fehlerbehebung erläutert.
Der signifikante Unterschied zwischen anderen CAM-Kulturmethoden und dieser verbesserten Hühner-CAM-Kulturmethode ist die Verw...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der Suomen Akatemia (Akademie Finnlands) (206038, 121647, 250900, 260056) finanziell unterstützt; Centre of Excellence Grant 2012-2017 251314), Munuaissäätiö - Finnischer Nieren- und Leberverein, Sigrid Juseliuksen Säätiö, Victoriastiftelsen, Schwedische Kulturstiftung in Finnland, Novo Nordisk, Syöpäjärjestöt (Krebsgesellschaft Finnlands), das Siebte Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (RP7/2007-2013; Stipendium FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608) und H2020 Marie Sklodowska-Curie Innovative Actions Training Network "RENALTRACT" Project ID 642937. Die Autoren danken Paula Haipus, Johanna Kekolahti-Liias und Hannele Härkman für die technische Unterstützung.
Die Abbildungen 3, 4 und Movie 2 werden mit Genehmigung von Developmentnachgedruckt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Verstellbarer Spatenbohrer | Bosch | 2609255277 | Zum Bohren von Löchern mit einem Durchmesser von 20 mm |
| Automatischer Eierwender | OLBA B.V., Niederlande | AT-42 | Zum Inkubieren von Eiern vor der Ex-Ovo-Aufstellung. |
| Zelleninkubator | Panasonic | 13090543 | Temperatur eingestellt auf 37°; C, 90% Luftfeuchtigkeit, 5% CO2 |
| Cell Inkubator | SANYO | 10070347 | Hühner-CAM-Kultur-Inkubator. Temperatur eingestellt auf 37°; C, 90 % Luftfeuchtigkeit, 5 % CO2 |
| Cellstar 6-Well-Platte | Greiner | M9062 | 16 mm Tiefe der Wells passend zu den Einsätzen |
| Kreissägeblatt für Dremel Rotationswerkzeug | Dremel | SC690 | |
| Konfokalmikroskop | Zeiss | LSM780 | |
| Corning Transwell Multi-Well-Platte mit durchlässigen Polycarbonat-Membraneinsätzen | Corning | 10301031 | Für 6-Well-Platten. 40 & Mikro; m Porengröße |
| Senkbohrer | Craftomat, Bauhaus | 22377902 | Zum Polieren (20,5 mm, 1/4", HSS) |
| Einweg-Glas-Kapillarrohr | Blaubrand | 7087 33 | |
| Einweg-Skalpell | Swann-Morton | 0501 | |
| Präpariermikroskop | Olympus | SZ61 | |
| Bohrmaschine | Bosch | GSR 18 V-EC Professioneller | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma | D777 | High |
| Glucose Eierbrutkasten Compact S84 | Grumbach, Deutschland | 8012 | Für die Inkubation von Eiern vor dem ex ovo Setup. Temperatur eingestellt auf 38°; C mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von über 60 |
| %Ethanol (70 %) | VWR | ||
| befruchtete Eier | Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finnland | Hy-Line White und Nick Chick | |
| Fetal Rinderserum | HyClone | SH3007003HI Thermo Scientific | |
| Pinzette DUMONT #5 | Dumont | #5SF | |
| Glasdeckgläser | Menzel-Glä ser | Menzel BBAD02200220#A1TBCMNZ#0## | 22x22 mm |
| Histoacryl Glue | Braun | 1050052 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| On-Stage Inkubator | Okolab | Boldline, Sonderanfertigung | |
| PBS -/- | Corning | 20-031-CV | |
| PBS +/+Biowest | X0520-500 | Waschen der Mini-Reservoirs. | |
| Penicillin und Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Polystyrol Perlen | Korpuskulär | 1000263-10 | 70 µ m im Durchmesser |
| Rotations-Multitool-System | Dremel | 4000 | |
| Lötkolben | Weller | TCP S | Beheizte Glaskapillare kann auch verwendet werden |
| Thincert 12-Well-Zellkultureinsätze mit 0,4 &; Mikro; m-pore Polystyrol Membran | Greiner Bio-One | 665641 | |
| Thincert 6-Well-Zellkultureinsätze mit 0,4 &; Mikro; m-pore Polystyrol-Folie | Greiner Bio-One | 657610 |
Referenzen
- Saxen, L., Wartiovaara, J. Cell contact and cell adhesion during tissue organization. International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).
- Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. Untersuchungen über die tubulogenese der niere. Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).
- Saxen, L. Organogenesis of the Kidney. 1st ed. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 536 (7615), 238(2016).
- Halt, K. J., et al. CD146+ cells are essential for kidney vasculature development. Kidney International. 90, 311-324 (2016).
- van den Berg, C. W., et al. Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
- Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane. Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).
- Sariola, H. Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli. Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).
- Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. The origin of the glomerular endothelium. Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).
- Short, K. M., et al. Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney. Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).
- Saarela, U., et al. Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging. Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).
- Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications. Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).
- Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts. Stem Cells International. 2013, 960958(2013).
- Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract. Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).
- Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice. Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
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