Hier charakterisieren wir zelluläre proteotoxische Stressreaktionen in der Nematode C. elegans, indem wir die Aktivierung fluoreszierender Transkriptionsreporter messen und die Empfindlichkeit gegenüber physiologischem Stress beobachten.
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Methodenartikel
Messung physiologischer Stressreaktionen in C. Elegans
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Organismen sind oft schwankenden Umgebungen und Veränderungen der intrazellulären Homöostase ausgesetzt, die sich nachteilig auf ihr Proteom und ihre Physiologie auswirken können. So haben Organismen gezielte und spezifische Stressreaktionen entwickelt, um Schäden zu reparieren und Homöostase aufrechtzuerhalten. Zu diesen Mechanismen gehören die entfaltete Proteinreaktion des endoplasmatischen Retikulums (UPRER), die entfaltete Proteinreaktion der Mitochondrien (UPRMT), die Hitzeschockreaktion (HSR) und die oxidative Stressreaktion (OxSR). Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben Methoden zum Nachweis und charakterisieren der Aktivierung dieser Bahnen und ihrer physiologischen Folgen im Nematode, C. elegans. Zunächst wird die Verwendung von signalspezifischen fluoreszierenden Transkriptionsreportern für eine schnelle zelluläre Charakterisierung, ein Arzneimittelscreening oder ein groß angelegtes genetisches Screening (z. B. RNAi oder mutierte Bibliotheken) beschrieben. Darüber hinaus werden ergänzende, robuste physiologische Assays beschrieben, die zur direkten Beurteilung der Empfindlichkeit von Tieren gegenüber bestimmten Stressoren verwendet werden können und als funktionelle Validierung der Transkriptionsreporter dienen. Zusammen ermöglichen diese Methoden eine schnelle Charakterisierung der zellulären und physiologischen Wirkungen interner und externer proteotoxischer Störungen.
Einleitung
Die Fähigkeit eines Organismus, auf Veränderungen in der intra- und extrazellulären Umgebung zu reagieren, ist entscheidend für sein Überleben und seine Anpassung. Dies wird auf zellulärer Ebene durch zahlreiche Schutzwege erreicht, die die Integrität der Zelle gewährleisten. Während zahlreiche zelluläre Komponenten stressassoziierten Schäden ausgesetzt sind, ist eine wichtige Beteiligung an zellulären Stressreaktionen die Reparatur und der Schutz der Homöostase des zellulären Proteoms. Die Abschottung von Proteinen in spezielle Strukturen, sogenannte Organellen, stellt jedoch eine Herausforderung für die Zelle dar, da sie sich nicht auf eine zentralisierte Form der P....
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Protokoll
1. Standard-Wachstumsbedingungen von Temperaturen & OP50 vs HT115
- Standardwachstum und Expansion
- Wachsen Sie eine Kultur von OP50 in LB (Tabelle 1) oder gleichwertige Medien der Wahl für 24-48 h bei Umgebungstemperatur (ca. 22-25 °C). Wachsen Sie Bakterien bei Raumtemperatur, da OP50 ein Uracil-Auxotroph ist und es eine höhere Inzidenz von Revertanten (z. B. Suppressormutanten) gibt, wenn sie bei 37 °C angebaut werden. Eine Langzeitlagerung von OP50-Kulturen wird nicht empfohlen (max. 1 Woche bei 4 °C).
- Säen Sie ein Volumen von 100-200 l gesättigter OP50-Kultur auf eine 60-mm-NGM-Platte (Tabelle 1) zur Erh....
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Ergebnisse
Verwenden von Transkriptionsreportern zur Messung der Aktivierung von Stressreaktionen
Hier kommen fluoreszierende Transkriptionsreporter zum Einsatz, die als robuste Werkzeuge dienen, um die Aktivierung der meisten Stressreaktionen in C. eleganszu messen. Die GFP-Expression wird unter dem Träger kanonischer Ziele von Master-Transkriptionsregulatoren angetrieben, die an der Reaktion auf fachspezifische Belastungen beteiligt sind. Eine umfassende Liste der häuf.......
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Diskussion
Hier werden Methoden zur Abhörung zellulärer Stressreaktionen in C. elegans,mit fluoreszierenden Transkriptionsreportern und physiologischen Stressüberlebenstests beschrieben. Die Reporter nutzen alle GFP-Expression, die unter dem Promotor eines nachgelagerten Transkriptionsziels der Transkriptionsfaktoren angetrieben wird, die an der Erhöhung zellulärer Stressreaktionen beteiligt sind. Die Verwendung von hsp-4p::GFP moduliert durch XBP-1s-vermittelte UPRER, hsp-6p::GFP gesteuert dur.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
R.BZ. wird von der EMBO-Stipendium und der Larry L. Hillblom Foundation unterstützt. R.H.S. wird durch das Stipendium 5F32AG032023-02 durch das National Institute of Aging (NIA) und das Glenn Foundation for Medical Research Postdoctoral Fellowship unterstützt. A.F. wird durch den Zuschuss F32AG051355 durch die NIA unterstützt. H.K.G. wird durch das Stipendium DGE1752814 durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program unterstützt. M.G.M. wird von 1F31AG060660-01 bis NIA unterstützt. A.D. wird von der Thomas and Stacey Siebel Foundation, dem Howard Hughes Medical Institute und 4R01AG042679-04 und 5R01AG055891-02 von NIA und 5R01ES021667-09 von....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | für mitochondrialen Stress |
| Bacto Pepton | Fisher | Scientific DF0118072 | für NGM-Platten |
| BD Difco granulierter Agar | VWR | 90000-782 | für NGM-Platten |
| Calciumchlorid-Dihydrat | VWR | 97061-904 | für NGM-Platten |
| Carbenicillin | BioPioneer | C0051-25 | für RNAi |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | für NGM-Platten |
| COPAS Biosorter | Union Biometrica | 350-5000-000 | ausgestattet mit einer 488 nm Lichtquelle. |
| COPAS Reinigungslösung | Union Biometrica | 300-5072-000 | zur Verwendung mit COPAS |
| COPAS Scheidenlösung | Union Biometrica | 300-5070-100 | zur Verwendung mit COPAS |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | Lösungsmittel für Arzneimittel |
| IPTG dioxanfrei | Denville Scientific | CI8280-4 | für RNAi |
| LB Bouillon Miller | Fisher Scientific | BP1426500 | für |
| Stereoskop LB M205FA | Leica | 10450040 | ausgestattet mit einer monochromatischen Leica DFC3000G CCD-Kamera, Standard-Leica GFP-Filter (ex 395-455, EM 480 LP) und LAS X Software |
| Magnesiumsulfate Heptahydrate | VWR | EM-MX0070-3 | für NGM-Platten, M9 |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 36541 | für oxidativen/mitochondrialen Stress |
| Kaliumchlorid | Fisher | P217-500 | für Bleichlösung |
| Kaliumphosphat zweibasig | VWR | EM-PX1570-2 | für NGM-Platten |
| Kaliumphosphat monobasisch | VWR | EM-PX1565-5 | für M9 |
| Revolve | ECHO | 75990-514 | ausgestattet mit einem Olympus 4x Plan Fluorite NA 0,13 Objektiv, Standard Olympus FITC Filter (ex 470/40; em 525/50; DM 560) und ein iPad Pro für Kamera und zur Steuerung der ECHO-Software |
| Natriumazid | Sigma-Aldrich | 71289-50G | für die Bildgebung |
| Natriumchlorid | EMD Millipore | SX0420-5 | für NGM-Platten, M9 |
| Natriumphosphat dibasisch | VWR | 71003-472 | für M9 |
| Tert-Butylhydroperoxid | Sigma-Aldrich | 458139 | für oxidativen Stress |
| Tetracyclinhydrochlorid | Sigma-Aldrich | T7660-5G | für RNAi |
| Tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-50MG | für ER-Stress |
Referenzen
- Higuchi-Sanabria, R., Frankino, P. A., Paul, J. W., Tronnes, S. U., Dillin, A. A Futile Battle? Protein Quality Control and the Stress of Aging. Developmental Cell. 44 (2), 139-163 (2018).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
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Nachdrucke und Genehmigungen
