Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

Martijn van de Locht; Josine  M. de Winter; Dilson E. Rassier; Michiel H.B. Helmes; Coen  A.C. Ottenheijm

doi:10.3791/61002

Methodenartikel

Isolieren von Myofibrils von Skelettmuskelbiopsien und Bestimmung der Kontraktilenfunktion mit einem Nano-Newton Resolution Force Transducer

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DOI:

10.3791/61002

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7. Mai 2020

Martijn van de Locht¹ , Josine M. de Winter¹ , Dilson E. Rassier² , Michiel H.B. Helmes¹^,³ , Coen A.C. Ottenheijm¹

¹Department of Physiology, Amsterdam UMC, ²Department of Kinesiology and Physical Education, Faculty of Education, McGill University, ³IONOptix BV

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Bewertung der kontraktilen Eigenschaften von gestreiften Muskelmyofibrils mit Nano-Newton-Auflösung vorgestellt. Das Protokoll verwendet ein Setup mit einer Interferometrie-basierten optischen Kraftsonde. Dieses Setup erzeugt Daten mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis und ermöglicht die Beurteilung der kontraktilen Kinetik von Myofibrils.

Zusammenfassung

Gestreifte Muskelzellen sind für die Aktivität von Mensch und Tier unverzichtbar. Einzelne Muskelfasern bestehen aus Myofibrillen, die aus seriell verbundenen Sarkomen bestehen, den kleinsten kontraktilen Einheiten im Muskel. Sarkomische Dysfunktion trägt zur Muskelschwäche bei Patienten mit Mutationen in Genen bei, die für sarkomerische Proteine kodieren. Die Untersuchung der Myofibril-Mechanik ermöglicht die Beurteilung von Actin-Myosin-Wechselwirkungen ohne mögliche verwirrende Auswirkungen von beschädigten, benachbarten Myofibrils bei der Messung der Kontraktilität einzelner Muskelfasern. Ultrastrukturelle Schäden und Fehlausrichtung von Myofibrils können zu einer beeinträchtigungen Kontraktilität beitragen. Wenn strukturelle Schäden in den Myofibrils vorhanden sind, brechen sie wahrscheinlich während des Isolationsverfahrens oder während des Experiments. Darüber hinaus liefern Studien an Myofibrils die Beurteilung von Actin-Myosin-Wechselwirkungen in Gegenwart der geometrischen Zwänge der Sarkome. Beispielsweise können Messungen in Myofibrils klären, ob myofibrillare Dysfunktion die primäre Wirkung einer Mutation in einem sarkomischen Protein ist. Darüber hinaus ist die Perfusion mit Calciumlösungen oder Verbindungen aufgrund des geringen Durchmessers des Myofibrils fast sofort. Dies macht myofibrils hervorragend geeignet, um die Aktivierungs- und Entspannungsraten während der Kraftproduktion zu messen. Das in diesem Papier beschriebene Protokoll verwendet eine optische Kraftsonde, die auf dem Prinzip eines Fabry-Pérot-Interferometers basiert, das kräfte im Nano-Newton-Bereich messen kann, gekoppelt an einen Piezolängenmotor und ein Schnellschritt-Perfusionssystem. Dieses Setup ermöglicht das Studium der myofibril Mechanik mit hochauflösenden Kraftmessungen.

Einleitung

Gestreifte Muskelzellen sind für den Alltag unverzichtbar. Die Bewegung der Gliedmaßen, die Atemfunktion und die Pumpbewegung des Herzens verlassen sich auf die Kraft, die von Muskelzellen erzeugt wird. Skelettmuskel besteht aus Muskelfascicles, die Bündel von einzelnen Muskelfasern enthalten (Abbildung 1A). Diese Muskelfasern bestehen aus Myofibrillen, die durch seriell verknüpfte Sarkome gebildet werden (Abbildung 1B,D). Die Sarkome enthalten dünne und dicke Filamente. Diese bestehen in erster Linie aus Ketten von Aktin- bzw. Myosinmolekülen (Abbildung 1B). Act....