Wir beschreiben eine intrazisternale Injektion, die eine an der Spitze gebogene Nadel verwendet, die zum Schädel stabilisiert werden kann, wodurch das Risiko einer Schädigung des darunter liegenden Parenchyms beseitigt wird. Der Ansatz kann für die genetische Schicksalskartierung und Manipulation von Leptomeningealzellen und für die Verfolgung der Bewegung von Zerebrospinalflüssigkeit verwendet werden.
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Methodenartikel
Induktion von Leptomeningealzellen Modifikation über intrazisternale Injektion
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das hier skizzierte Protokoll beschreibt, wie man Lösungen sicher und manuell durch die Zisterne magna injiziert und gleichzeitig das Risiko einer Beschädigung des zugrunde liegenden Parenchyms eliminiert. Zuvor veröffentlichte Protokolle empfehlen die Verwendung von geraden Nadeln, die von der Duraloberfläche auf maximal 1-2 mm abgesenkt werden sollten. Der plötzliche Rückgang des Widerstands, sobald die Duralmembran durchlöchert wurde, macht es schwierig, die Nadel in einer stabilen Position zu halten. Unsere Methode verwendet stattdessen eine an der Spitze gebogene Nadel, die gegen den okzipitalen Knochen des Schädels stabilisiert werden kann, wodurch verhindert wird, dass die Spritze nach perforation der Duralmembran in das Gewebe eindringt. Das Verfahren ist einfach, reproduzierbar und verursacht keine lang anhaltenden Beschwerden bei den operierten Tieren. Wir beschreiben die intrazisternale Injektionsstrategie im Kontext der genetischen Schicksalskartierung von vaskulären Leptomeningealzellen. Die gleiche Technik kann darüber hinaus verwendet werden, um eine breite Palette von Forschungsfragen zu beantworten, wie die Untersuchung der Rolle von Leptomeningen in der Neuroentwicklung und die Verbreitung von bakteriellen Meningitis, durch genetische Ablation von Genen, die angeblich in diese Phänomene involviert sind. Darüber hinaus kann das Verfahren mit einem automatisierten Infusionssystem für eine konstante Abgabe kombiniert und zur Verfolgung der Bewegung von Zerebrospinalflüssigkeit durch Injektion fluoreszierender Moleküle verwendet werden.
Einleitung
Leptomeningeale Zellen sind eine fibroblastenartige Population von Zellen, die in einer dünnen Schicht organisiert sind, die das Gehirn überlagert und Gene exzessiiert, die in kollagenvernetzung (z. B. Dcn und Lum) und bei der Etablierung einer Hirn-Meningealbarriere (z. B. Cldn11)1,2beteiligt sind. Leptomeningeale Zellen sind in eine breite Palette von physiologischen Funktionen involviert, von der strengen Kontrolle über die Zerebrospinalflüssigkeit Drainage3, um Führung der neuronalen Vorläufer im sich entwickelnden Gehirn4,
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Protokoll
Die hiermit vorgestellten chirurgischen Verfahren wurden von der Stockholmerin Norra Djurförsöksetiska Nämnd genehmigt und in Übereinstimmung mit den Spezifikationen des Forschungsinstituts (Karolinska-Institut, Schweden) durchgeführt.
HINWEIS: Die intrazisternale Injektion kann flexibel für mehrere Forschungszwecke angepasst werden. Wir stellen im Folgenden ein Verfahren vor, das entwickelt wurde, um Leptomeningealzellen effizient für die Schicksalskartierung auf der Grundlage der Injektion von Endoxifen in eine transgene Mauslinie mit R26R-tdTomato12 und CreER zu kennzeichnen, letztere unter dem Cx....
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Ergebnisse
Die intrazisternale Injektion von Endoxifen bei transgenen Mäusen, die CreER unter dem Cx30-Promotor13 exzieren, und einem induzierbaren fluoreszierenden Reporter ermöglicht eine spezifische Rekombination von Leptomeningealzellen, ohne die benachbarte Cx30-exezierende Oberfläche und parenchymale Astrozyten im Kortex zu kennlassen (Abbildung 1). Um Zugang zur Zisterne magna zu erhalten, wird das anästhesierte Tier mit seinem Körper und .......
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Diskussion
Das hier skizzierte Protokoll stellt ein einfaches und reproduzierbares Verfahren zur Kennzeichnung von Leptomeningealzellen für die Schicksalskartierung dar. Wir verwenden die intrazisternale Injektion von Endoxifen, einem aktiven Metaboliten von Tamoxifen, um die Expression von tdTomato fluoreszierendem Reporter in Cx30-CreER zu induzieren; R26R-tdTomatenmäuse12,13.
Im Vergleich zu anderen Protokollen, die für den Zugang zur Zerebros.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.
Danksagungen
Diese Studie wurde durch Stipendien des Schwedischen Forschungsrats, der Schwedischen Krebsgesellschaft, der Schwedischen Stiftung für Strategische Forschung, Knut och Alice Wallenbergs Stiftelse und des Strategischen Forschungsprogramms für Stammzellen und Regenerative Medizin am Karolinska Institutet (StratRegen) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Anästhesiegerät | Univentor 410 | 8323102 | Komplett aus Verdampfer, Kammer und Schlauch, der mit der Kammer und dem Mauskopfhalter verbunden |
| ist Anästhesie (Isofluran) | Baxter Medical AB | 000890 | |
| Betadine | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| Carprofen | Orion Pharma AB | 014920 | Handelsname Rymadil |
| Cyanoacrylat-Kleber | Carl Roth | 0258.1 | Verwenden Sie Seide 5-0 Nähte, alternativ |
| Medbond Tissue Glue | Stoelting | 50479 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Endoxifen | Sigma-Aldrich | E8284 | |
| Ethanol 70% | Histolab | 01370 | |
| Hamilton Spritze (30 G abgeschrägte Nadel) | Hamilton | 80300 | |
| Lidocaine | Aspen Nordic | 520455 | |
| Mauskopfhalter | Narishige International | SGM-4 | Mit Mundstück für inhalative Anhestetika. Alternativ können Sie eine stereotaktische |
| Schere verwenden Schere | Fine Science Tools | 15009-08 | |
| Rasierer | Aesculap | GT420 | |
| Sterile Absorptionsspeere | Fine Science Tools | 18105-01 | Sterile Wattestäbchen sind auch eine gute Option |
| Chirurgischer Separator | World Precision Instrument | 501897 | |
| Pinzette | Dumont | 11251-35 | |
| Viscotears | Bausch& Lomb Nordic AB | 541760 |
Referenzen
- Vanlandewijck, M., et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).
- Whish, S., et al. The inner CSF-brain barrier: developmentally controlled access to t....
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Nachdrucke und Genehmigungen
