Induktion von Leptomeningealzellen Modifikation über intrazisternale Injektion
7. Mai 2020
Wir beschreiben eine intrazisternale Injektion, die eine an der Spitze gebogene Nadel verwendet, die zum Schädel stabilisiert werden kann, wodurch das Risiko einer Schädigung des darunter liegenden Parenchyms beseitigt wird. Der Ansatz kann für die genetische Schicksalskartierung und Manipulation von Leptomeningealzellen und für die Verfolgung der Bewegung von Zerebrospinalflüssigkeit verwendet werden.
Unser chirurgisches Verfahren ermöglicht es der spezifischen Genbearbeitung von Leptomeningealzellen, ihre Funktion unter vielen physiologischen und pathologischen Bedingungen wie der Neuroentwicklung und der Ausbreitung der bakteriellen Meningitis zu untersuchen. Um Schäden während der intrazisternalen Abgabe von Endoxifen zu minimieren, verwenden wir eine gebogene Nadel, die gegen die kaudale Kante des Schädels gesichert werden kann, um zu verhindern, dass sie tiefer in das Gewebe eindringt. Das Verfahren kann verwendet werden, um die Rolle von Genen zu untersuchen, die Leptomeningealzellen durch Verlust und Gewinn von Funktionsexperimenten exzieren.
Es kann auch angenommen werden, um den zerebrospinalen Flüssigkeitsfluss zu verfolgen. Die visuelle Demonstration dieser Methode wird eine erfolgreiche Identifizierung der Injektionsstelle für die intrazisternale Injektion und Verständnis dafür gewährleisten, wie die Nadel gegen den okzipitalen Knochen gesichert werden kann. Beginnen Sie mit der Vorbereitung einer Hamilton-Spritze mit einer 30 Gauge abgeschrägten Nadel für die Injektion.
Verwenden Sie Zangen, um die Nadel auf 30 Grad drei Millimeter von der Spitze zu biegen. Als nächstes Endoxifen in 10% DMSO auf eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter verdünnen und die Spritze verstauen. Anästhesisieren Sie das Tier in der Isofluran-Kammer.
Stellen Sie dann den Mauskopfhalter so ein, dass sich das Mundstück etwa in einem 30-Grad-Winkel von der Oberfläche des OP-Tischs befindet, und fixieren Sie den Kopf des Tieres auf den Halter. Um die Zugänglichkeit zur Zisterne magna zu verbessern, positionieren Sie den Körper des Tieres etwa 30 Grad von der Oberfläche des Tisches mit dem Nachdruck nach unten geneigten Kopf, der einen Winkel von 120 Grad mit dem Rest des Körpers festlegt und den Nackenrücken ausdehnt, um den Zugang zur Cisterna magna zu erleichtern. Sobald das Tier richtig positioniert ist, ophthalmologische Salbe auftragen, den Nacken rasieren und den Bereich mit Alkoholtüchern und Betadine desinreinigen.
Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen Mittellinienschnitt zu machen, der auf der Ebene des okzipitalen Knochens beginnt und sich nach trägig ausdehnt. Trennen Sie vorsichtig das oberflächliche Bindegewebe und die Nackenmuskulatur, indem Sie seitlich von der Mittellinie mit feiner Spitzenpinzette ziehen, die die Duralmembran über der Zisternenmagnafreilage aussetzt. Positionieren Sie einen kleinen chirurgischen Separator, um die Visualisierung der Zisterne magna während des gesamten Verfahrens zu ermöglichen.
Identifizieren Sie das kaudale Ende des Okzipitalknochens und setzen Sie die zuvor gebogene Nadel direkt darunter ein. Sobald die Dura perforiert ist, lassen Sie die gebogene Spitze der Nadel unter die Oberfläche eindringen, indem Sie die Spritze sanft nach oben und parallel zum Körper des Tieres ziehen, was für eine bessere Stabilität sorgt. Injizieren Sie die Verbindung langsam, um Interferenzen mit dem natürlichen Fluss der Zerebrospinalflüssigkeit zu vermeiden.
Nach der Injektion die Nadel für eine Minute im Inneren ruhen lassen, dann vorsichtig mit Hilfe von feinen Spitzenzangen entfernen. Schließen Sie die Haut mit ein paar Tropfen Cyanoacrylat-Klebstoff und wenden Sie Lokalanästhetikum an der Injektionsstelle an. Entfernen Sie das Tier aus dem Halter und legen Sie es in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen.
Dann stellen Sie sicher, das Tier zu überwachen, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die intrazisternale Injektion von Endoxifen bei transgenen Mäusen, die CreER unter dem Cx30-Promotor exzieren, ermöglicht eine spezifische Rekombination von Leptomeningealzellen, ohne die benachbarten Cx30-Exzessen von Oberflächenastrozyten und parenchymalen Astrozyten im Kortex zu kennzeichnen. Dieses Injektionsprotokoll nutzt die physiologische Bewegung der Zerebrospinalflüssigkeit, so dass die Endoxifen-Lösung über den Subarachnoidenraum verteilt ist, um Leptomeningealzellen effizient neu zu kombinieren, die die Olfaktor-Lampen, Denkrinnen und Kleinhirnüberlagerungen überlagern.
Die Lösung überschreitet nicht die Hirnmeningealbarriere oder kommt in Kontakt mit astroglialen Zellen des Parenchyms im Gegensatz zur systemischen Verabreichung durch orale Gavage. Die Rekombination von Leptomeningealzellen nach intrazisternaler Injektion wurde durch Pdgfr-alpha-Reaktivität identifiziert, während Oberflächen- und parenchymale Astrozyten, die Gfap exdrücken, unbeschriftet blieben. Beim Versuch dieses Experiments ist es wichtig, die Injektionsstelle für die intrazisternale Abgabe zu lokalisieren.
Diese visuelle Demonstration bietet das technische Know-how, um das Verfahren durchzuführen und gleichzeitig das Risiko einer Beschädigung des neuronalen Gewebes unter ihm zu minimieren. Mit dieser Technik können Genablationsstudien durchgeführt werden, um die Rolle von Leptomeningealzellen bei der Kortikogenese und der Regulation der Zerebrospinalflüssigkeitsbildung zu untersuchen und zusätzliche Standorte für die Ausbreitung von Bakterien im Subarachnoidenraum zu identifizieren.
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Übersicht
Diese Studie beschreibt eine neuartige intrazisternale Injektionstechnik unter Verwendung einer gebogenen Nadel, die darauf abzielt, die Injektionsstelle zu stabilisieren und Schäden an darunterliegenden Geweben zu minimieren. Die Methode ermöglicht präzise genetische Eingriffe in Leptomenigealzellen und liefert Erkenntnisse über die Dynamik der Zerebrospinalflüssigkeitsbewegung in verschiedenen physiologischen und pathologischen Kontexten.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Gentechnik
- Chirurgische Techniken
Hintergrund
- Studien zur Rolle der Leptomenigealzellen bei der Neuroentwicklung und Pathologie sind entscheidend für das Verständnis verwandter Erkrankungen.
- Herkömmliche Methoden zur Injektion von Substanzen in den Liquor cerebrospinalis bergen das Risiko einer Schädigung des darunterliegenden Nervengewebes.
- Die Entwicklung stabiler Applikationstechniken kann die Zuverlässigkeit genetischer Studien und Verfolgungsmechanismen verbessern.
Zweck der Studie
- Eine sichere Methode für intrazisternale Injektionen unter Verwendung einer fixierten gebogenen Nadel vorstellen.
- Die genetische Fate-Mapping und gezielte Manipulation von Leptomeningealzellen erleichtern.
- Die Bewegung des Liquor cerebrospinalis effizient verfolgen.
Verwendete Methoden
- Die Studie verwendet ein chirurgisches Verfahren, das für die intrazisternale Applikation von Endoxifen mittels einer speziell gebogenen Nadel konzipiert ist.
- Das zentrale biologische Modell umfasst transgene Mäuse, die CreER unter dem Cx30-Promotor exprimieren und dadurch eine gezielte genetische Manipulation ermöglichen.
- Zu den kritischen Schritten gehören die präzise Positionierung des Tieres und eine sorgfältige Handhabung der Injektionstechnik, um Gewebetraumata zu minimieren.
- Die Injektions- und Überwachungsverfahren werden detailliert beschrieben, um eine erfolgreiche Anwendung sowie die Erholung des Tieres nach der Operation sicherzustellen.
Hauptergebnisse
- Die Technik ermöglicht eine gezielte Ansteuerung von Leptomenigealzellen, ohne benachbarte Astrozyten zu beeinflussen.
- Injektionen führten erfolgreich zu einer Genrekombination, bestätigt durch die Reaktivität gegenüber Pdgfr-alpha, wodurch die Wirksamkeit der Methode validiert wurde.
- Die Verteilung der Endoxifenlösung im Liquor cerebrospinalis war optimal und verbesserte so die Präzision der Genbearbeitung.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie demonstriert eine verfeinerte Technik für intrazisternale Injektionen, die das Risiko einer Schädigung des Nervengewebes minimiert und gleichzeitig genetische Untersuchungen erleichtert.
- Die Ergebnisse unterstreichen das Potenzial, die Rolle von Leptomenigealzellen in verschiedenen Krankheitsmodellen und physiologischen Prozessen zu erforschen.
- Die Implikationen reichen bis zur Verbesserung von Methoden in der Neurobiologie und legen den Grundstein für zukünftige Forschungsarbeiten in verwandten Bereichen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht eine präzise genetische Manipulation von Leptomeninxzellen mittels intracisternaler Injektion und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in Modellen der Neuroentwicklung und der Meningitis. Durch die Minimierung von Gewebeschäden und eine reproduzierbare Applikation erhöht es das Vorhersagevertrauen in präklinischen Studien von Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Die Methode erleichtert die mechanistische Risikominderung, indem sie die Funktion der Leptomeninxzellen von störenden parenchymalen Effekten abgrenzt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Funktion von Leptomenigealzellen bei der neurologischen Entwicklung und bei bakteriellen Meningitiswegen.
- Operationaler Wert: Bietet reproduzierbare genetische Fate-Mapping-Analysen, ohne angrenzende Astrozyten zu markieren.
- Strategischer Wert: Unterstützt die Absicherung von Zielstrukturen, indem zelltypspezifische Rekombination über die Reaktivität gegenüber Pdgfr-alpha bestätigt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte Leptomenigealsysteme für die nachgeschaltete Wirkstoff-Screening in Modellen mit Zerebrospinalflüssigkeitsexposition vor.
- Operationaler Wert: Gewährleistet standardisierte Applikation durch Stabilisierung einer gebogenen Nadel am Hinterhauptsbein.
- Strategischer Wert: Ermöglicht skalierbares Tracking der Zerebrospinalflüssigkeit mithilfe fluoreszenzmarkierter Moleküle für die Bereitschaft zu Assays.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die modellbasierte Untersuchung krankheitsrelevanter Funktionen der Leptomeninx bei der Kortikogenese und der Regulation des Liquors.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Kombination mit automatisierten Infusionssystemen für eine kontinuierliche Substanzapplikation.
- Strategischer Wert: Erleichtert die translationale Durchgängigkeit von der genetischen Ablation bis zur Bewertung funktioneller Endpunkte.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in Entdeckungsworkflows, indem sie eine frühe Hypothesenprüfung des Targets in leptomeningealen Systemen vor der Identifizierung von Leitverbindungen ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die mechanistische Entrisikobewertung durch zellspezifische Genbearbeitung in den Hirnhäuten.
- Screening: Ermöglicht quantitative Aussagen zur Verteilung von Liquor cerebrospinalis für die Beurteilung der Substanzexposition.
- Analytik: Bietet Rekombinationsmetriken basierend auf Pdgfr-alpha, um die Zielstrukturenbindung zu validieren.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die Anbindung an die präklinische Validierung durch Verfolgung der Ausbreitung von Bakterien im Subarachnoidalraum.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Übertragbar auf verschiedene genetische Modelle und Substanzen zur Plattformwiederverwendung bei der Validierung von ZNS-Zielstrukturen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem leptomeningeale Effekte von kortikalen Astrozyten isoliert werden.
- Operativer Wert: Stellt Reproduzierbarkeit durch standardisierte Nadelpositionierung und Injektionstechnik sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Zielgenauigkeit in den Meningen validiert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf der Modulation des leptomeningealen Signalwegs.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Mikrochirurgie und Liquoranatomie für einen genauen Zugang zur Zisterna magna.
- Benötigt präzise Instrumentierung, einschließlich Hamilton-Spritzen und der Herstellung gebogener Nadeln.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Teams hinsichtlich der Tierpositionierung und Injektionsgeschwindigkeit voraus.
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen modellspezifische Anpassungen des Liquorvolumens und der Flussdynamik.
- Praktische Einschränkungen bestehen in der Abhängigkeit von technischem Geschick und möglicher Variabilität bei der Konsistenz des Biegewinkels der Nadel.
