Untersuchung des Xenobiotika-Stoffwechsels in Salix alba-Blättern mittels Massenspektrometrie-Bildgebung

Xenobiotika sind aufgrund menschlicher Aktivitäten auf der ganzen Welt weit verbreitet. Einige dieser Verbindungen sind wasserlöslich und werden vom Boden¹absorbiert und gelangen in die Nahrungskette, wenn sie sich in Pflanzengeweben^{anreichern 2,3,4}. Die Pflanzen werden von Insekten und Pflanzenfressern gefressen, die anderen Organismen zum Opfer stehen. Die Einnahme einiger Xenobiotika und ihre Auswirkungen auf die Gesundheit einer Pflanze wurden^{beschrieben 5,6,7,8}, aber erst kürzlich auf Gewebeebene⁹. Daher ist noch unklar, wo oder wie der Stoffwechsel von Xenobiotika auftritt oder ob bestimmte Pflanzenmetaboliten mit der xenobiotischen Akkumulation in bestimmten Geweben korrelieren¹⁰. Darüber hinaus haben die meisten Forschungen den Stoffwechsel von Xenobiotika und ihren Metaboliten in Pflanzen übersehen, so dass wenig über diese Reaktionen in Pflanzengewebe bekannt ist.

Hier wird eine Methode zur Untersuchung enzymatischer Reaktionen in biologischen Proben vorgeschlagen, die mit der Gewebelokalisation von Substraten und Produkten der Reaktionen in Verbindung gebracht werden können. Die Methode kann das vollständige Stoffwechselprofil einer biologischen Probe in einem Experiment zeichnen, da die Analyse nicht zielgerichtet ist und mit benutzerdefinierten Listen von Analyten von Interesse untersucht werden kann. Bereitgestellt wird eine Liste der Kandidaten, die im ursprünglichen Datensatz verfolgt wurden. Werden in der Probe ein oder mehrere interessierende Analyten notiert, kann die spezifische Gewebelokalisation wichtige Informationen über die damit verbundenen biologischen Prozesse liefern. Die interessierenden Analyten können dann in silico unter Verwendung relevanter biologischer Gesetze modifiziert werden, um nach möglichen Produkten/Metaboliten zu suchen. Die Liste der erhaltenen Metaboliten wird dann verwendet, um die ursprünglichen Daten zu analysieren, indem die beteiligten Enzyme identifiziert und die Reaktionen in den Geweben lokalisiert werden, um so die auftretenden Stoffwechselprozesse zu verstehen. Keine andere Methode liefert Informationen über die Arten von Reaktionen, die in den biologischen Proben auftreten, die Lokalisation der interessierenden Verbindungen und ihre verwandten Metaboliten. Diese Methode kann auf jeder Art von biologischem Material angewendet werden, sobald frisches und intaktes Gewebe verfügbar ist und die interessierenden Verbindungen ionisiert werden können. Das vorgeschlagene Protokoll wurde in Villette et al.¹² veröffentlicht und ist hier für die Verwendung durch die wissenschaftliche Gemeinschaft detailliert beschrieben.

1. Probenvorbereitung

1. Erhalten Sie die biologische Probe und halten Sie sie entweder frisch und intakt (z. B. nicht in ein Röhrchen zwingen) oder frieren Sie sie ein. Das vorgeschlagene Protokoll gilt für jede Art von fester biologischer Probe (d. H. Pflanzliches, tierisches oder menschliches Gewebe), um Verbindungen in bestimmten Geweben zu lokalisieren.
2. Kühlen Sie ein Kryomikrotom auf -20 °C ab. Halten Sie den Probenhalter und die Klinge auf der gleichen Temperatur.
3. Betten Sie das Objekt bei Bedarf in das M1-Einbettungsmedium ein, um es während des Schneidens zu erhalten.
   1. Gießen Sie etwas Matrix in eine Kunststoffform, die in der Kryomikrotomkammer platziert ist. Fügen Sie die Probe schnell hinzu und gießen Sie etwas mehr Einbettungsmedium, um sie abzudecken. Halten Sie die Probe in der Mitte der Form, während die Matrix beim Abkühlen erstarrt.
      HINWEIS: Die Einbettung ist nicht für alle biologischen Objekte erforderlich. Homogene Objekte wie Mausgehirne benötigen kein Einbettmedium und können eingefroren geschnitten werden.
4. Legen Sie die eingebettete oder gefrorene Probe auf den Kryomicrotomhalter und schneiden Sie sie mit einer scharfen Klinge. Eine Dicke von 5–30 μm eignet sich gut für Pflanzenproben, die aufgrund ihrer Heterogenität schwer zu schneiden sind. Passen Sie die Schnittdicke und -temperatur an die Probe an und machen Sie mehrere Schnitte, um die besten Bedingungen zu finden. Im angegebenen Beispiel wurde die Probe bei -20 °C geschnitten. Erwägen Sie, die Probe unter 0 °C zu halten, um einen Probenabbau zu vermeiden.
   HINWEIS: Die Verwendung eines binokularen Mikroskops, das neben dem Kryomikrotom platziert wird, kann helfen, die Qualität der Scheiben zu bestimmen. Das Gewebe muss intakt bleiben.
5. Bewegen Sie die Scheibe vorsichtig mit einer Zette oder einem kleinen Pinsel zu einem ITO-beschichteten Objektträger und legen Sie dann einen Finger unter den Dia, um die Probe aufzuwärmen und zu trocknen. Halten Sie den Objektträger in der Kryomikrotomkammer, bis alle Proben fertig sind. Nehmen Sie den Schieber langsam aus der Kammer, um einen Hitzeschock zu vermeiden.
   HINWEIS: Um zu überprüfen, welche Seite der Rutsche ITO-beschichtet ist, legen Sie einen Wassertropfen bei Raumtemperatur (RT) auf die Rutsche. Der Tropfen bleibt auf der ITO-beschichteten Seite rund oder flacht auf der unbeschichteten Seite ab.
6. Zeichnen Sie Markierungen auf dem Dia mit einem dünnen Markerstift oder einer Korrekturflüssigkeit und scannen Sie es vor der Matrixabscheidung mit einem hochauflösenden Scanner. Die Markierungen werden verwendet, um die genaue Position der Probe auf dem Objektträger zu bestimmen, wenn sie sich im Massenspektrometer befindet. Der beste Weg, um genaue Bezugspunkte zu erhalten, ist das Zeichnen eines Kreuzes.

2. Matrixabscheidung

1. Bereiten Sie die MALDI-Matrix vor: Wiegen Sie 70 mg α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (HCCA) -Matrix und verdünnen Sie sie in 10 ml einer Wasser- und Methanollösung (50:50) mit 0,2% TFA. Beschallen Sie die Matrix für 10 Minuten bei RT. Nach der Beschallung kann zusätzliche feste Matrix vorhanden sein.
   HINWEIS: Je nach den interessierenden Analyten können verschiedene Arten von MALDI-Matrizen verwendet werden.
2. Reinigen Sie den Matrixabscheideroboter mit 100% Methanol.
3. Reinigen Sie den Schlitten mit Methanol und einem Präzisionstuch, halten Sie die Proben fest, ohne sie zu berühren und ohne die Markierungen zu entfernen. Fügen Sie einen sauberen Abdeckr über den Dia in einem Bereich ohne Probe hinzu. Dieser Teil des Objektträgers wird dann über den optischen Detektor gelegt, um die Matrixablagerung zu verfolgen.
   HINWEIS: Um die Matrixdicke optisch zu verfolgen, müssen der Schlitten und der Abdeckr sehr sauber sein.
4. Verwenden Sie den Roboter für die Matrixabscheidung: Legen Sie nur 6 ml der Matrixlösung in das Reservoir und fügen Sie 2 ml 100% Methanol für ein Gesamtvolumen von 8 ml hinzu.
   HINWEIS: Die Aufzeichnung der Matrixdicke entlang der Abscheidung erfolgt automatisch und kann mit einem USB-Stick wiederhergestellt werden. Die Entwicklung einer Sprühmethode wird hier nicht näher erläutert.

3. Datenerfassung

1. Legen Sie 1 μL der Matrix auf eine MALDI-Platte, um das Massenspektrometer mit den Matrixpeaks als Referenzen zu kalibrieren. Die Entwicklung einer Erfassungsmethode am Massenspektrometer wird hier nicht näher erläutert.
   1. Setzen Sie die MALDI-Platte in die Quelle ein, klicken Sie in der ftmsControl-Software auf "Load Target" und warten Sie, bis die Platte geladen ist.
   2. Wählen Sie die Position des Matrixspots aus, indem Sie auf den Spot im Bild klicken, der die MALDI-Platte darstellt.
   3. Geben Sie den Beispielnamen und den Ordner auf der Registerkarte "Beispielinformationen" der Software an.
   4. Starten Sie die Erfassung, indem Sie auf "Akquisition" klicken.
   5. Bewegen Sie die Platte während der Aufnahme mit dem Mauszeiger auf der Registerkarte "MALDI-Video" leicht, so dass der Laser auf verschiedene Stellen zeigt.
   6. Wenn die Erfassung abgeschlossen ist, gehen Sie zur Registerkarte "Kalibrierung", wählen Sie die HCCA-Kalibrierungsliste im quadratischen Modus und klicken Sie auf Automatisch. Das globale Kalibrierungsergebnis wird im Fenster "Calibration Plot" angezeigt und sollte für eine SolariX XR 7T weniger als 0,2 ppm betragen.
   7. Wenn die Kalibrierung gut ist, klicken Sie auf "Akzeptieren" und speichern Sie die Methode.
2. Sobald die Matrixabscheidung auf den Proben abgeschlossen ist, legen Sie den Dia in einen Diaadapter und rufen Sie die Position der Markierungen mit einer Kunststoffabdeckung ab.
3. Richten Sie in der flexImaging-Software einen neuen Imaging-Lauf mit dem ersten Fenster ein, das sich mit der Software öffnet.
   1. Benennen Sie den Imaging-Lauf, wählen Sie das Ergebnisverzeichnis aus,und klicken Sie auf Weiter.
   2. Geben Sie die Rastergröße an (d. h. den benutzerdefinierten Messbereich), wählen Sie die zu verwendende Methode aus (kalibriert in Abschnitt 3.1), und klicken Sie auf Weiter.
   3. Laden Sie das optische Bild des Dias, das Sie in Schritt 1.6 erhalten haben, nach dem Scannen des Dias und klicken Sie auf Weiter.
   4. Das Bild wird in einem breiteren Fenster geöffnet. Verwenden Sie die Markierungen auf der Folie, um die Position der Folien zu lehren: Platzieren Sie in ftmsControldas Ziel des MALDI-Videofensters auf der genauen Position einer Markierung, kehren Sie dann zu felxImaging zurück und klicken Sie auf genau den gleichen Punkt auf dem optischen Bild. Wiederholen Sie dies für drei unabhängige Punkte. Die Kunststoffabdeckung mit den Markierungen wird auf eine MALDI-Platte gelegt, um ihre Position wiederherzustellen und den Unterricht zu erleichtern.
      HINWEIS: Wenn die Markierungen mit einem Marker gemacht wurden, kann das Hinzufügen von weißer Korrekturflüssigkeit auf der Rückseite der Folie dazu führen, dass sie während des Unterrichts hervorstechen.
4. Zeichnen Sie die interessierenden Bereiche in den Proben in der flexImaging-Software mit den Werkzeugen "Messbereiche hinzufügen".
5. Speichern Sie den Imaging-Lauf und eine "AutoXecute-Sequenz", wenn mehrere Proben analysiert werden sollen.
6. Starten Sie eine Sequenz mit" AutoXecute Batch Runner", wenn mehrere Proben analysiert werden.
   HINWEIS: Synchronisieren Sie die Daten regelmäßig an einen sicheren Ort.

4. Datenverarbeitung

1. Importieren Sie die Rohdaten in die Visualisierungssoftware (SCiLS Lab) und erstellen Sie einen Datensatz. Dies geschieht in dieser Software in zwei separaten Schritten.
   1. Verwenden Sie das Werkzeug "Batch Importer" und wählen Sie die Rohdaten aus, geben Sie das Zielverzeichnis an und klicken Sie auf "Importieren".
   2. Nach dem Import können mehrere Datensätze zur weiteren Analyse kombiniert werden. Um Datensätze zu kombinieren, verwenden Sie die "Datei| Neu| Datensatz" Werkzeug.
   3. Wählen Sie den für die Erfassung verwendeten Instrumententyp aus, fügen Sie die importierten Datensätze hinzu, indem Sie auf "+" klicken, und ordnen Sie die Bilder an, indem Sie auf die Objekte klicken und sie ziehen.
   4. Überprüfen Sie die Massenbereichseinstellungen oder ändern Sie sie bei Bedarf, indem Sie den interessierende Bereich angeben. Klicken Sie auf Weiter, um die Importzusammenfassung anzuzeigen und den Import zu starten.
2. Visualisieren Sie das m/z von Interesse in den verschiedenen Geweben einer Probe und/oder in verschiedenen Proben. Klicken Sie einfach auf die Spektren, um das gewünschte m/z auszuwählen, oder geben Sie den Wert in das Feld m/z ein.
   1. Führen Sie bei Bedarf statistische Tests durch, um nach kolokalisierten oder unterscheidenden Werten zwischen verschiedenen Geweben und / oder verschiedenen Proben zu suchen, um die interessierenden m / z zu bestimmen. Die Werkzeuge sind im Menü "Tool" verfügbar und werden in diesem Protokoll nicht beschrieben.
3. Exportieren Sie die interessierenden m/z.B. kolokalisierten, diskriminativen Verbindungen) als .csv Datei aus der Registerkarte Objekt. Der gesamte Datensatz kann auch exportiert werden, wenn er nicht zu groß ist (d.h. maximal 60.000 Zeilen). Klicken Sie auf das Symbol "Exportieren" auf der rechten Seite der Region, die durch einen roten Pfeil gekennzeichnet ist.
4. Importieren Sie die .csv Datei, um einen neuen Datensatz in der Anmerkungssoftware (Metaboscape) zu erstellen. Klicken Sie auf "Projekte | CSV-Projekt importieren". Beachten Sie, dass nur das genaue m/z berücksichtigt wird und das Isotopenprofil verloren geht.
   HINWEIS: Die Softwareversion 5.0 ermöglicht den direkten Import von Daten aus der Visualisierungssoftware, was eine genauere Annotation ermöglicht, da das Isotopenprofil berücksichtigt werden kann.
5. Kommentieren Sie mit maßgeschneiderten Analytenlisten, die aus öffentlich zugänglichen Datenbanken abgeleitet werden können. Eine Vorlage wird von der Software zur Erstellung von Analytenlisten gegeben.
6. Verwenden Sie die Vorhersagesoftware (Metabolite Predict), um eine In-silico-Vorhersage der Metaboliten der annotierten Verbindungen durchzuführen. Die entwickelte Formel des Zinseszinses wird benötigt, entweder vom Benutzer in der Software gezeichnet oder als .mol-Datei importiert. Dann ist die Methode ein einfaches Schritt-für-Schritt-Protokoll.
7. Stellen Sie die Liste der Metaboliten wieder her, erstellen Sie eine Analytenliste und verwenden Sie sie in der Annotationssoftware, um die Rohdaten mit vorhergesagten Metaboliten zu kommentieren. Alternativ, wenn die Liste der Metaboliten kurz ist, suchen Sie manuell in Schritt 4.8 danach.
8. Visualisieren Sie die Gewebeverteilung der Metaboliten in den Rohdaten in der Visualisierungssoftware.
9. Stellen Sie die Namen der Enzyme wieder her, die an den Stoffwechselprozessen beteiligt sind, indem Sie mit der rechten Maustaste auf den vorhergesagten Metaboliten von Interesse klicken.

Dieses Protokoll wurde auf frische Blätter angewendet, die von einem S. alba-Baum entnommen wurden, der Xenobiotika in der Umwelt ausgesetzt war. Der Prozess ist in Abbildung 1dargestellt. Der erste Schritt besteht darin, dünne Scheiben der interessierenden Probe vorzubereiten. Pflanzenproben sind oft schwieriger zu schneiden als Tierproben, da die Gewebe heterogen sind und Wasser und/oder Luft enthalten können. Diese Schwierigkeit wird mit dem Einbettungsmedium bewältigt, das einen homogenen Block um die Probe bildet. Die Matrixabscheidung wird durch den Einsatz eines Roboters erleichtert, wodurch Handmanipulationen vermieden und reproduzierbare Ergebnisse sichergestellt werden. Die MALDI-Matrixschichtdicke wird während des gesamten Prozesses verfolgt und kann aufgezeichnet werden. Die Datenerfassung erfordert das Erlernen des Umgangs mit einem hochauflösenden Massenspektrometer und die Anpassung der Methode an die Art der untersuchten Proben und Verbindungen. Rohdaten werden in eine Visualisierungssoftware importiert, um nach den interessierenden Verbindungen zu suchen und deren Gewebelokalisierung anzuzeigen. Diskriminative oder kolokalisierte Verbindungen können mit statistischen Werkzeugen gefunden werden, die in der Software verfügbar sind. In diesem Schritt sind nur die genauen m/z der Verbindungen bekannt. Die Zinseszinsen werden dann in die Annotationssoftware exportiert, die das genaue m / z mit einer benutzerdefinierten Liste von Zinseszinsen vergleichen kann, die vom Benutzer definiert wurden. Wenn das genaue m/z mit dem m/z eines Zinseszinses übereinstimmt, wird es kommentiert. Im Rahmen einer Stoffwechselprofiluntersuchung werden die annotierten Verbindungen zur In-silico-Vorhersage von Metaboliten ausgewählt. Die Arten biologischer Reaktionsregeln, die zur Erzeugung von Metaboliten verwendet werden, können vom Benutzer leicht ausgewählt werden, ebenso wie die Anzahl der Generationen, über die die Metaboliten vorhergesagt werden. Die Liste der vorhergesagten Metaboliten kann in der Annotationssoftware verwendet werden, um nach Übereinstimmungen zwischen Rohdaten exakt m/z und vorhergesagten Metaboliten m/z zu suchen (Abbildung 1). Die annotierten Metaboliten können in der Visualisierungssoftware gesucht werden, um ihre Gewebelokalisierung zu erhalten (Abbildung 2). Die Enzyme, die am Stoffwechsel der ursprünglichen Verbindungen von Interesse beteiligt sind, können zurückgewonnen werden, um die in der biologischen Probe auftretenden Stoffwechselreaktionen zu zeichnen (Abbildung 3).

In diesem Beispiel wurde das Medikament Telmisartan in den Pflanzenblättern identifiziert; es war im gesamten Gewebe verteilt. Telmisartans Metaboliten wurden vorhergesagt und in den Rohdaten gesucht. Die Annotationen zeigten, dass ein Metabolit der ersten Generation (I) in den inneren Geweben der Blätter nachgewiesen und weiter zu Metaboliten der zweiten Generation (II) abgebaut wurde, die in inneren Geweben lokalisiert oder allgemeiner in allen Blattgeweben verteilt waren (Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten auf eine aktive Stoffwechselreaktion in den Blättern hin, um Telmisartan abzubauen. Der Prozess wurde auf mehrere interessante Verbindungen angewendet, die in den Blättern annotiert waren, und die an den Reaktionen beteiligten Enzyme wurden wiederhergestellt, um ihre Rolle bei der Reaktion der Pflanze auf die Ansammlung von Xenobiotika zu untersuchen. Dies gibt einen Überblick über die Enzyme, die am Xenobiotika-Stoffwechsel in S. alba-Blättern beteiligt sind (Abbildung 3).

Abbildung 1. Allgemeiner Aufbau der Methode. Eine frische Probe wird geschnitten und auf einen ITO-beschichteten Objektträger gelegt, der mit der entsprechenden MALDI-Matrix besprüht wird. Die MALDI-Erfassung liefert Rohdaten, aus denen die Lokalisation im Gewebe mit der Software SCiLS Lab beobachtet werden kann. Metaboscape wird für die Annotation verwendet, und Metabolite Predict wird für die Vorhersage von Metaboliten (dh Kataboliten und Konjugaten) verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Beispiel für die Ergebnisse, die an S. alba-Blättern erzielt wurden, die Xenobiotika ausgesetzt waren. Telmisartan wurde in den Pflanzenblättern identifiziert und in allen Geweben visualisiert. Telmisartan-Metaboliten wurden vorhergesagt und auf den Rohdaten annotiert, um ihre Gewebelokalisierung zu visualisieren. Der MetabolitC33 H32N4O3der ersten Generation (I) war hauptsächlich im inneren Gewebe lokalisiert, während Metaboliten der zweiten Generation (II) teilweise allgemeiner verteilt waren. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Villette et al.12angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. Globales enzymatisches Profil vorgeschlagen für mögliche Reaktionen, die in S. alba-Blättern als Reaktion auf Xenobiotika-Exposition auftreten. Die Metabolitenvorhersage und -annotation auf dem interessierenden Objekt deutete auf die möglichen enzymatischen Reaktionen hin, die für den Stoffwechsel der interessierenden Verbindung verantwortlich sind. Diese Figur wurde mit Genehmigung von Villette et al.12angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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