Summary
Este método usa imagens de espectrometria de massa (MSI) para entender processos metabólicos nas folhas de S. alba quando expostos a xenobióticos. O método permite a localização espacial de compostos de interesse e seus metabólitos previstos dentro de tecidos específicos e intactos.
Abstract
O método apresentado utiliza imagens de espectrometria de massa (IM) para estabelecer o perfil metabólico das folhas de S. alba quando expostas a xenobióticos. Usando uma abordagem não direcionada, metabólitos vegetais e xenobióticos de interesse são identificados e localizados em tecidos vegetais para descobrir padrões específicos de distribuição. Em seguida, na previsão silico de metabólitos potenciais (ou seja, catabólitos e conjugados) dos xenobióticos identificados é realizada. Quando um metabólito xenobiótico está localizado no tecido, o tipo de enzima envolvida em sua alteração pela planta é registrado. Esses resultados foram utilizados para descrever diferentes tipos de reações biológicas ocorridas nas folhas de S. alba em resposta ao acúmulo xenobiótico nas folhas. Os metabólitos foram previstos em duas gerações, permitindo a documentação de sucessivas reações biológicas para transformar xenobióticos nos tecidos da folha.
Introduction
Xenobióticos são amplamente distribuídos ao redor do mundo devido às atividades humanas. Alguns desses compostos são solúveis em água e absorvidos pelo solo1, e entram na cadeia alimentar quando se acumulam em tecidos vegetais2,3,4. As plantas são comidas por insetos e herbívoros, que são presas de outros organismos. A ingestão de alguns xenobióticos e seu impacto na saúde de uma planta foram descritos5,6,7,8, mas apenas recentemente em um nível de tecido9. Portanto, ainda não está claro onde ou como o metabolismo dos xenobióticos ocorre, ou se metabólitos vegetais específicos estão correlacionados ao acúmulo xenobiótico em tecidos específicos10. Além disso, a maioria das pesquisas tem negligenciado o metabolismo dos xenobióticos e seus metabólitos nas plantas, tão pouco se sabe sobre essas reações nos tecidos vegetais.
Proposto aqui é um método para investigar reações enzimáticas em amostras biológicas que podem estar associadas à localização tecidual de substratos e produtos das reações. O método pode desenhar o perfil metabólico completo de uma amostra biológica em um experimento, uma vez que a análise não é direcionada e pode ser investigada usando listas personalizadas de analitos de interesse. Desde que seja uma lista de candidatos rastreados no conjunto de dados original. Se um ou vários analitos de interesse forem observados na amostra, a localização específica do tecido pode fornecer informações importantes sobre os processos biológicos relacionados. Os analitos de interesse podem então ser modificados em sílico usando leis biológicas relevantes para a busca de possíveis produtos/metabólitos. A lista de metabólitos obtidos é então utilizada para analisar os dados originais, identificando as enzimas envolvidas e localizando as reações nos tecidos, ajudando assim a compreender os processos metabólicos que ocorrem. Nenhum outro método fornece informações sobre os tipos de reações ocorridas nas amostras biológicas, a localização dos compostos de interesse e seus metabólitos relacionados. Este método pode ser usado em qualquer tipo de material biológico uma vez que tecidos frescos e intactos estão disponíveis e os compostos de interesse podem ser ionizados. O protocolo proposto foi publicado em Villette et al.12 e é detalhado aqui para uso da comunidade científica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação da amostra
- Obtenha a amostra biológica e mantenha-a fresca e intacta (por exemplo, não a force a um tubo) ou congele-a. O protocolo proposto aplica-se a qualquer tipo de amostra biológica sólida (ou seja, tecidos vegetais, animais ou humanos) para localização de compostos em tecidos específicos.
- Esfrie um criomicrotome a -20 °C. Mantenha o suporte da amostra e a lâmina na mesma temperatura.
- Se necessário, incorpore o objeto no meio de incorporação M1 para preservá-lo durante o corte.
- Despeje alguma matriz em um molde de plástico colocado na câmara de criomicrotome. Adicione rapidamente a amostra e despeje um pouco mais de incorporação de meio para cobri-la. Mantenha a amostra no centro do molde à medida que a matriz se solidifica enquanto esfria.
NOTA: A incorporação não é necessária para todos os objetos biológicos. Objetos homogêneos, como cérebros de camundongos, não precisam incorporar meios e podem ser cortados congelados.
- Despeje alguma matriz em um molde de plástico colocado na câmara de criomicrotome. Adicione rapidamente a amostra e despeje um pouco mais de incorporação de meio para cobri-la. Mantenha a amostra no centro do molde à medida que a matriz se solidifica enquanto esfria.
- Coloque a amostra embutida ou congelada no suporte de criomicrotome e corte-a com uma lâmina afiada. Uma espessura de 5-30 μm é boa para amostras de plantas, que são difíceis de cortar devido à sua heterogeneidade. Adapte a espessura e temperatura de corte à amostra, fazendo vários cortes para encontrar as melhores condições. No exemplo fornecido, a amostra foi cortada a -20 °C. Considere manter a amostra abaixo de 0 °C para evitar a degradação da amostra.
NOTA: O uso de um microscópio binóculo colocado ao lado do criomicrotome pode ajudar a determinar a qualidade das fatias. Os tecidos devem ficar intactos. - Mova cuidadosamente a fatia para um slide revestido de ITO usando fórceps ou um pequeno pincel, em seguida, coloque um dedo sob o slide para aquecer e secar a amostra. Mantenha o slide na câmara criomicrotome até que todas as amostras estejam prontas. Retire o deslizamento da câmara lentamente para evitar choque térmico.
NOTA: Para verificar qual lado do slide é revestido de ITO, coloque uma gota de água no escorregador à temperatura ambiente (RT). A queda permanecerá em volta do lado revestido da ITO ou achatará no lado não revestido. - Desenhe marcas no slide usando uma caneta ou fluido de correção de marcador fino e escaneie-o com um scanner de alta resolução antes da deposição da matriz. As marcas serão usadas para determinar a posição exata da amostra no slide quando ela estiver no espectrômetro de massa. A melhor maneira de obter pontos precisos de referência é desenhar um cruzamento.
2. Depoimento matricial
- Prepare a matriz MALDI: pese 70 mg de matriz de ácido hidroxicinâmico (HCCA) α de 70 mg de água e metanol (50:50) com 0,2% de TFA. Sonicate a matriz por 10 minutos na RT. Pode haver matriz extra sólida após a sônicação.
NOTA: Diferentes tipos de matrizes MALDI podem ser usados dependendo dos analitos de interesse. - Limpe o robô de deposição de matriz com 100% de metanol.
- Usando metanol e uma limpeza de precisão, limpe o slide, segurando as amostras sem tocá-las e sem remover as marcas. Adicione uma mancha de cobertura limpa sobre o slide em uma área sem amostra. Essa parte do slide é então colocada sobre o detector óptico para rastrear a deposição da matriz.
NOTA: Para rastrear opticamente a espessura da matriz, o deslizamento e a tampa devem estar muito limpos. - Use o robô para deposição matricial: coloque apenas 6 mL da solução matricial no reservatório, e adicione 2 mL de 100% de metanol para um volume total de 8 mL.
NOTA: A gravação da espessura da matriz ao longo da deposição é automática e pode ser recuperada usando um pendrive. O desenvolvimento de um método de pulverização não é detalhado aqui.
3. Aquisição de dados
- Coloque 1 μL da matriz em uma placa MALDI para calibrar o espectrômetro de massa usando os picos da matriz como referências. O desenvolvimento de um método de aquisição no espectrômetro de massa não é detalhado aqui.
- Insira a placa MALDI na fonte, clique em "Load Target" no software ftmsControl e aguarde que a placa seja carregada.
- Escolha a posição do ponto de matriz clicando no local na imagem representando a placa MALDI.
- Indique o nome da amostra e a pasta na guia " Informações deamostra" do software.
- Comece a aquisição clicando em "Aquisição".
- Mova a placa ligeiramente durante a aquisição usando o ponteiro do mouse na guia "VÍDEO MALDI" para que o laser aponte em diferentes pontos.
- Quando a aquisição estiver concluída, vá para a guia "Calibração", escolha a lista de calibração HCCA no modo quadrático e clique em Automático. O resultado de calibração global é indicado na janela "Gráfico de Calibração" e deve ser inferior a 0,2 ppm para um SolariX XR 7T.
- Se a calibração for boa, clique em "Aceitar" e salve o método.
- Uma vez terminado o depoimento da matriz nas amostras, coloque o slide em um adaptador de slides e recupere a posição das marcas usando uma tampa plástica.
- No software flexImaging, configure uma nova execução de imagem usando a primeira janela que se abre com o software.
- Nomeie a execução de imagens, selecione o Diretório de Resultadose clique em Next.
- Indique o tamanho do raster (ou seja, região de medição definida pelo usuário), escolha o método a ser utilizado (calibrado na seção 3.1) e clique em Next.
- Carregue a imagem óptica do slide obtida na etapa 1.6 após digitalizar o slide e clique em Next.
- A imagem se abre em uma janela mais ampla. Use as marcas no slide para ensinar a posição dos slides: no ftmsControl,coloque o alvo da janela de vídeo MALDI na posição exata de uma marca, depois volte para felxImaging e clique no mesmo ponto da imagem óptica. Repita isso por três pontos independentes. A tampa plástica com as marcas é colocada em uma placa MALDI para recuperar sua posição e facilitar o ensino.
NOTA: Se as marcas foram feitas com um marcador, adicionar fluido de correção branca na parte de trás do slide pode fazê-los se destacar durante o ensino.
- Desenhe as regiões de interesse nas amostras do software flexImaging usando as ferramentas "Adicionar regiões de medição".
- Salve a execução de imagem e uma "Sequência autoxecute" se várias amostras forem analisadas.
- Inicie uma sequência usando "AutoXecute Batch Runner" se várias amostras forem analisadas.
NOTA: Sincronizar os dados regularmente em um local seguro.
4. Processamento de dados
- Importe os dados brutos para o software de visualização (SCiLS Lab) e crie um conjunto de dados. Isso é feito em duas etapas separadas neste software.
- Use a ferramenta "Importador de lotes" e selecione os dados brutos, indique o diretório de destino e clique em "Importação".
- Após a importação, vários conjuntos de dados podem ser combinados para análise suplementar. Para combinar conjuntos de dados, use o arquivo"| Novo| Dataset" ferramenta.
- Selecione o tipo de instrumento usado para aquisição, adicione os conjuntos de dados importados clicando em "+", e organize as imagens clicando e arrastando os objetos.
- Verifique as configurações do intervalo de massa ou modifique se necessário, indicando o intervalo de juros. Clique em A seguir para ver o resumo da importação e iniciar a importação.
- Visualize o m/z de interesse nos diferentes tecidos de uma amostra e/ou em diferentes amostras. Basta clicar no espectro para selecionar o m/z de interesse ou digitar o valor na caixa m/z .
- Realize testes estatísticos se necessário para procurar valores colocalizados ou discriminatórios entre diferentes tecidos e/ou amostras diferentes para determinar o m/z de interesse. As ferramentas estão disponíveis no menu "Ferramenta" e não serão descritas neste protocolo.
- Exporte o m/z de juros (por exemplo, compostos discriminatórios e discriminatórios) como um arquivo .csv da guia Objeto. Todo o conjunto de dados também pode ser exportado se não for muito grande (ou seja, no máximo 60.000 linhas). Clique no ícone "Exportar" no lado direito da região de interesse indicado por uma seta vermelha.
- Importe o arquivo .csv para criar um novo conjunto de dados no software de anotação (Metaboscape). Clique em "Projetos | Importação projeto CSV". Esteja ciente de que apenas o m/z exato será considerado, e o perfil isotópico é perdido.
NOTA: A versão de software 5.0 permite a importação direta de dados do software de visualização, o que permite uma anotação mais precisa, pois o perfil isotópico pode ser considerado. - Anote com listas de analitos personalizadas, que podem ser derivadas de bancos de dados disponíveis publicamente. Um modelo é dado pelo software para criar listas de analitos.
- Use o software de previsão (Metabolite Predict) para executar na previsão de silico dos metabólitos dos compostos anotados. A fórmula desenvolvida do composto de interesse é necessária, seja desenhada pelo usuário no software ou importada como um arquivo .mol. Em seguida, o método é um protocolo passo-a-passo simples.
- Recupere a lista de metabólitos, crie uma lista de analitos e use-a no software de anotação para anotar os dados brutos com metabólitos previstos. Alternativamente, se a lista de metabólitos for curta, procure-a manualmente na etapa 4.8.
- Visualize a distribuição tecidual dos metabólitos nos dados brutos do software de visualização.
- Recupere os nomes das enzimas envolvidas nos processos metabólicos no software de previsão clicando com o botão direito do mouse no metabólito de interesse previsto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo foi aplicado a folhas frescas amostradas de uma árvore S. alba exposta a xenobióticos no ambiente. O processo é retratado na Figura 1. O primeiro passo é preparar fatias finas da amostra de juros. Amostras de plantas são muitas vezes mais difíceis de cortar do que amostras de animais, pois os tecidos são heterogêneos e podem conter água e/ou ar. Esta dificuldade é tratada usando meio de incorporação, que forma um bloco homogêneo ao redor da amostra. A deposição matricial é facilitada pelo uso de um robô, evitando manipulação das mãos e garantindo resultados reprodutíveis. A espessura da camada de matriz MALDI é seguida durante todo o processo e pode ser registrada. A aquisição de dados requer aprendizado para lidar com um espectrômetro de massa de alta resolução e adaptar o método ao tipo de amostras e compostos que estão sendo investigados. Os dados brutos são importados para um software de visualização para procurar os compostos de interesse e exibir sua localização tecidual. Compostos discriminativos ou colocalizados podem ser encontrados usando ferramentas estatísticas disponíveis no software. Nesta etapa, apenas os m/z exatos dos compostos são conhecidos. Os compostos de interesse são então exportados para o software de anotação, que pode comparar o m/z exato com uma lista personalizada de compostos de interesse definidos pelo usuário. Se o m/z exato corresponder ao m/z de um composto de juros, ele será anotado. No contexto de uma investigação de perfil metabólico, os compostos anotados são selecionados na previsão de silico de metabólitos. Os tipos de regras de reação biológica utilizadas para gerar metabólitos são facilmente escolhidos pelo usuário, bem como o número de gerações sobre as quais os metabólitos são previstos. A lista de metabólitos previstos pode ser usada no software de anotação para buscar correspondências entre dados brutos exatos m/z e metabólitos previstos m/z (Figura 1). Os metabólitos anotados podem ser pesquisados no software de visualização para obter sua localização tecidual (Figura 2). As enzimas envolvidas no metabolismo dos compostos originais de interesse podem ser recuperadas para desenhar as reações metabólicas ocorridas na amostra biológica(Figura 3).
Neste exemplo, o telmisartan da droga foi identificado nas folhas da planta; foi distribuído por todos os tecidos. Os metabólitos de Telmisartan foram previstos e pesquisados nos dados brutos. As anotações mostraram que um metabólito de primeira geração (I) foi detectado nos tecidos internos das folhas e ainda degradado em metabólitos de segunda geração (II), que foram localizados em tecidos internos ou foram mais geralmente distribuídos em todos os tecidos da folha(Figura 2). Estes resultados sugerem uma reação metabólica ativa nas folhas para degradar telmisartan. O processo foi aplicado a vários compostos de interesse anotados nas folhas, e as enzimas envolvidas nas reações foram recuperadas para investigar seu papel na resposta da planta ao acúmulo de xenobióticos. Isso dá uma visão geral das enzimas envolvidas no metabolismo xenobióticos nas folhas de S. alba (Figura 3).
Figura 1. Estrutura geral do método. Uma amostra nova é cortada e colocada em um slide revestido de ITO pulverizado com a matriz MALDI apropriada. A aquisição do MALDI fornece dados brutos dos quais a localização dentro do tecido pode ser observada com o software SCiLS Lab. Metaboscape é usado para anotação, e o Metabolite Predict é usado para previsão de metabólito (ou seja, catabólitos e conjugados). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Exemplo dos resultados obtidos em folhas de S. alba expostas a xenobióticos. Telmisartan foi identificado nas folhas da planta e visualizado em todos os tecidos. Metabólitos telisartan foram previstos e anotados nos dados brutos para visualizar sua localização tecidual. O metabólito de primeira geração (I) C33H32N4O3 foi localizado principalmente nos tecidos internos, enquanto os metabólitos de segunda geração (II) às vezes eram mais distribuídos. Este valor foi adaptado com permissão de Villette et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Perfil enzimático global proposto para reações potenciais que ocorrem em folhas de S. alba em resposta à exposição xenobiótica. A previsão metabólica e a anotação sobre o objeto de interesse sugeriram as potenciais reações enzimáticas responsáveis pelo metabolismo do composto de juros. Este valor foi adaptado com permissão de Villette et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A parte crítica deste protocolo é a preparação da amostra: a amostra deve ser macia e intacta. O corte é a parte mais difícil, pois a temperatura e a espessura da amostra podem variar dependendo do tipo de amostra estudada. Os tecidos animais são geralmente homogêneos e mais fáceis de cortar. As amostras de plantas geralmente incorporam estruturas diferentes e, portanto, são mais difíceis de manter intactas à medida que a lâmina encontra tecidos vasculares macios, duros ou vazios. É altamente recomendável usar tecidos frescos ao trabalhar com amostras de plantas para evitar a formação de gelo nos tecidos hidrofílicos e sua destruição. As fatias devem ser movidas suavemente quando depositadas no slide revestido de ITO. A matriz MALDI foi ligeiramente diluída para evitar o entupimento da folha de pulverização com cristais de matriz, o que pode acontecer se os 2 mL de 100% de metanol não forem adicionados na etapa 2.4.
Este método oferece um protocolo fácil de preparação de amostras de um dia que fornece resultados reprodutíveis devido ao uso de um robô para deposição matricial MALDI. O protocolo proposto requer competência no corte de tecidos e na imagem da espectrometria de massa e só se aplica a compostos que podem ser ionizados. No entanto, fornece identificação molecular sem a necessidade de rotulagem como usado na imunohistoquímica11. A alta sensibilidade é alcançada porque os compostos são diretamente ionizados nos tecidos ou células, evitando efeitos de diluição produzidos por um protocolo de extração12. As amostras são analisadas de forma não direcionada, o que permite um perfil em larga escala dos compostos endógenos ou xenóbios nas amostras. Portanto, podem ser seguidas respostas biológicas a compostos exógenos. A previsão em silico de metabólitos acoplados à análise não direcionada adiciona outra dimensão à imagem clássica da espectrometria de massa, pois as reações metabólicas podem ser monitoradas sem um conhecimento a priori dos compostos exógenos que se acumularão nos tecidos. Até o momento, apenas compostos conhecidos e alguns metabólitos foram seguidos com este método (por exemplo, drogas de interesse alimentadas a ratos)13. Com o protocolo proposto, os compostos originais e seus metabólitos podem ser localizados dentro dos tecidos, e as respostas biológicas ao acúmulo de compostos exógenos e/ou seus metabólitos podem ser seguidas.
Este protocolo não se aplica apenas à resposta das plantas aos xenobióticos, mas também pode ser usado para entender o metabolismo animal em resposta às drogas, para acompanhar interações vegetais/fungos, resposta vegetal a estresses bióticos ou abióticos, ou para entender a evolução das doenças, revelando os processos metabólicos nos tecidos de interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue e Régis Lavigne por suas dicas e truques sobre a preparação de amostras para a imagem MALDI de amostras de plantas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
- Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review. Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Prosser, R. S., Sibley, P. K. Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation. Environment International. 75, 223-233 (2015).
- Wang, J., et al. Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environment International. 121, 169-177 (2018).
- Marsik, P., et al. Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system. Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).
- He, Y., et al. Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation. Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).
- Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schröder, P. Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate. Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).
- Thomas, F., Cébron, A. Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).
- Villette, C., et al. In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves. Environment International. 126, 523-532 (2019).
- Sandermann, H. Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept. Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).
- Sula, B., Deveci, E., Özevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate. International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).
- Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging. Metabolomics. 15, 122 (2019).
- Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).
