Nachweis der Protein-S-Acylation mit Acyl-Resin Assisted Capture

S-Acylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation, bei der eine fetthaltige Acylkette zu einem internen Cysteinrückstand auf einem Zielprotein über eine labile Thioesterbindung¹verwendet wird. Es wurde zuerst als eine Modifikation von Proteinen mit Palmitat berichtet, eine gesättigte 16-Kohlenstoff-Fettsäure², und daher wird diese Modifikation oft als S-Palmitoylierung bezeichnet. Zusätzlich zu Palmitat können Proteine durch eine Vielzahl von längeren und kürzeren gesättigten (Myristate und Stearat), einfach ungesättigten (Oleat) und mehrfach ungesättigten (Arachidonate und Eicosapentanoat) Fettsäuren^3,4,5,6,7umkehrend modifiziert werden. In eukaryotischen Zellen wird die S-Acylierung von einer Familie von Enzymen katalysiert, die als DHHC-Protein-Acyltransferasen bekannt sind, und die umgekehrte Reaktion der Cystein-Deacylation wird durch Proteinthioesterasen katalysiert, von denen die meisten noch rätselhaft bleiben⁸.

Die Lability der Thioester-Bindung macht diese Lipidmodifikation reversibel, so dass sie Proteinclustering, Plasmamembranlokalisierung, intrazellulären Handel, Protein-Protein-Wechselwirkungen und Proteinstabilität^9,10dynamisch regulieren kann. Folglich wurde die S-Acylierung mit mehreren Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter die Huntington-Krankheit, die Alzheimer-Krankheit und verschiedene Krebsarten (Prostata, Magen, Blase, Lunge, Kolorektal), was die Entwicklung zuverlässiger Methoden zum Nachweis dieser posttranslationalen Proteinmodifikation erfordert¹¹.

Metabolische Etikettierung mit radioaktiver ([³H], [¹⁴C] oder [¹²⁵I]) Palmitat war einer der ersten Ansätze, die entwickelt wurden, um das Protein S-Acylation^12,13,14zu assayieren. Radiolabeling-basierte Methoden stellen jedoch gesundheitliche Bedenken dar, sind nicht sehr empfindlich, zeitaufwändig und erkennen nur lipidation von reichlich vorhandenen Proteinen¹⁵. Eine schnellere und nicht radioaktive Alternative zur Radioetikettierung ist die metabolische Etikettierung mit bioorthogonalen Fettsäuresonden, die routinemäßig zur Untersuchung der Dynamik der Protein-S-Acylation¹⁶verwendet wird. Bei dieser Methode wird eine Fettsäure mit einem chemischen Reporter (Alkyn- oder Azidgruppe) durch eine Proteinacyltransferase in das S-acylolate Protein eingearbeitet. Die Cycloadditionsreaktion Von Azid-Alkyn Huisgen (Klickchemie) kann dann verwendet werden, um eine funktionalisierte Gruppe, wie ein Fluorophor oder Biotin, an die integrierte Fettsäure zu binden, die den Nachweis des S-acyatierten Proteins^17,18,19ermöglicht.

Acyl-Biotin-Austausch (ABE) ist eine der ausgiebig verwendeten biochemischen Methoden zur Erfassung und Identifizierung von S-acyatierten Proteinen, die einige der Mängel der metabolischen Kennzeichnung wie Ungeeignetheit für Gewebeproben¹⁵umgeht. Diese Methode kann für die Analyse der S-Acylation in einer Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich Geweben und gefrorenen Zellproben^20,21, angewendet werden. Diese Methode basiert auf der selektiven Spaltung der Thioesterbindung zwischen der Acylgruppe und dem Cysteinrückstand durch neutrales Hydroxylamin. Die befreiten Thiolgruppen werden dann mit einem Thiol-reaktiven Biotinderivat erfasst. Die erzeugten biotinylierten Proteine werden dann mit Streptavidin-Agarose affinitätsgereinigt und durch Immunoblotting analysiert.

Ein alternativer Ansatz, der als Acyl-Harz-unterstützte Erfassung (Acyl-RAC) bezeichnet wird, wurde später eingeführt, um den Biotinylierungsschritt durch die direkte Konjugation freier Cysteins durch ein Thiol-reaktives Harz zu ersetzen^22,23. Diese Methode hat weniger Schritte im Vergleich zu ABE und kann in ähnlicher Weise verwendet werden, um Protein-S-Acylation in einer Vielzahl von Proben zu erkennen¹.

Acyl-RAC besteht aus 4 Hauptschritten (Abbildung 1),
1. Sperrung freier Thiolgruppen;
2. Selektive Spaltung der Cystein-Acyl-Thioester-Bindung mit neutralem Hydroxylamin (HAM) zur Belichtung von Cystein-Thiol-Gruppen;
3. Erfassung der lipidierten Cysteins mit einem Thiol-reaktiven Harz;
4. Selektive Anreicherung der S-acyatierten Proteine nach Elution mit reduzierendem Puffer.

Die eingefangenen Proteine können dann durch Immunoblotting analysiert oder einer Massenspektrometrie (MS) basierten Proteomik unterzogen werden, um das S-acylierte Proteom in einer Vielzahl von Arten und Geweben zu bewerten^22,24,25. Individuelle S-Acylierungsstellen können auch durch Trypsin-Verdauung der erfassten Proteine und Analyse der resultierenden Peptide durch LC-MS/MS²²identifiziert werden. Hier zeigen wir, wie Acyl-RAC zum gleichzeitigen Nachweis der S-Acylation mehrerer Proteine sowohl in einer Zelllinie als auch in einer Gewebeprobe eingesetzt werden kann.

Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet wurden, wurden gemäß den NIH-Richtlinien eingeschläfert. Das Animal Welfare Committee am University of Texas Health Science Center in Houston genehmigte alle Tierarbeiten.

1. Herstellung von Zelllysaten

1. Vorbereiten des Lysepuffers wie in Tabelle 1beschrieben . Auf 10 ml PBS 0,1 g n-Dodecyl-D-Maltosid-Waschmittel (DDM) geben und drehen, um sich aufzulösen. Fügen Sie 100 l Phosphatase-Inhibitor-Cocktail 2, ML211 (10 m), PMSF (10 mM) und Protease-Inhibitor-Cocktail (1x) hinzu und kühlen Sie den Puffer vor Gebrauch auf Eis.
2. Übertragen Sie benötigte Medien, die Zellen aus dem Inkubator enthalten, in 15 ml oder 50 ml konische Röhren und Spinzellen bei 350 x g für 5 min und aspirieren Sie, um Zellablagerungen loszuwerden.
   HINWEIS: Wir verwendeten 1 x 10⁷ Zellen für jede acyl-RAC-Reaktion, die durchgeführt werden sollte.
3. Waschen Sie das Pellet, indem Sie es in 5 ml PBS wieder aufhängen und bei 350 x g für 5 min drehen.
   HINWEIS: Führen Sie Schritt 1.3 schnell aus, um eine Zelllyse aufgrund einer längeren Inkubation in PBS zu vermeiden.
4. In Schritt 1.1 auf das Pellet 600 l Lysepuffer geben und durch Schütteln bei 1500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoshaker 30 min bei 4 °C lysieren.
5. Klare Lysate durch Zentrifugation bei 20.000 x g bei 4 °C für 30 min zu Pelletwaschmitteln unlöslichen Materialien. Gerodetes Lysat in vorgekühlten 1,5 ml Mikrofugenrohren sammeln und auf Eis halten.
6. Führen Sie einen Bradford/BCA-Test durch, um die Proteinkonzentration zu schätzen. Es ist wichtig, die gleiche Menge an Protein über verschiedene Proben zu gewährleisten, bevor das Experiment durchgeführt wird. Wir empfehlen die Verwendung von mindestens 500 g Protein pro Reaktion.
   HINWEIS: In den beschriebenen Experimenten verwendeten wir kultivierte (Jurkat) Zellen und primäre Splenozyten aus Mäusegewebe. Die oben beschriebene Lysemethode kann auch auf andere Zelltypen übernommen werden. Die durchschnittliche Proteinkonzentration für die oben genannten Zelltypen beträgt ca. 500 g pro 1 x 10⁷ Zellen. Jurkat-Zellen wurden in RPMI-1640 mittelmodifiziert gehalten, um 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 4.500 mg/L Glukose und 1.500 mg/L Natriumbicarbonat zu enthalten, ergänzt mit 10% FBS bei 37 °C mit 5%_CO2. Wir verwendeten 1 x 10⁷ Jurkat-Zellen pro Reaktion. Primäre Milzzyten wurden aus Mausmilzgewebe isoliert, wie^{beschrieben 26}. Kurz gesagt, Milzgewebe wurde auf Eis mazeriert, gefolgt von Lyse von Erythrozyten in hypotonischer Lösung und Trennung von den Lymphozyten durch Zentrifugation. Wir verwendeten 1 x 10⁷ Primärzellen pro Reaktion.

2. Acyl-RAC: Blockierung freier Thiolgruppen

HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte können bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden.

1. Lysat in ein frisches 1,5 ml Mikrofugenrohr übertragen und Chloroform-Methanol (CM)-Fällung wie unten beschrieben durchführen.
   1. Methanol (MeOH) und Chloroform (CHCl₃) in ein Endverhältnis von Lysat in das Lysat geben: MeOH: CHCl₃ von 2:2:1 und kräftig schütteln, um eine homogene Suspension zu erzeugen.
   2. Drehen Sie bei 10.000 x g für 5 min, um ein Pellet ("Pancake") in der Interphase zwischen wässrigen und organischen Phasen zu bilden.
   3. Neigen Sie das Rohr und aspirieren Sie so viel Lösungsmittel wie möglich mit einer Nadel oder einer Gel-Ladespitze.
   4. Trocknen Sie das Proteinpellet für ein paar Minuten und waschen Sie es vorsichtig, indem Sie 600 l MeOH hinzufügen und sanft mischen, um ein Aufbrechen des Pellets zu vermeiden.
   5. Entfernen Sie den restlichen MeOH vorsichtig und trocknen Sie das Proteinpellet ca. 5 min auf einer Tischplatte.
   6. (Optional) Führen Sie einen zusätzlichen Zentrifugationsschritt durch, um ein gebrochenes Pellet nach dem MeOH-Waschgang herunterzudrehen, um den Verlust der Probe zu vermeiden.
      HINWEIS: Das Experiment kann nach dem CM-Fällungsschritt beendet werden. Sobald das Pellet erhalten ist, kann es in 500 l MeOH in -20 °C bis zu einer Woche gelagert werden.
      1. Lösen Sie das Proteinpellet in 200 l 2SHB-Puffer, indem Sie bei 42 °C/1500 Rpm in einem thermischen Shaker wirbeln, bis sich das Pellet auflöst.
   7. (Optional) Inkubieren Sie für weitere 5–10 min in einem beschallenden Wasserbad, um das Pellet aufzulösen.
      HINWEIS: Die Länge der Beschallung variiert je nach Löslichkeit des Materials. Eine längere Beschallung kann jedoch zu proteinem Abbau führen.
2. Bereiten Sie 0,2 % Methylmethansthiosulfonat (MMTS) (v/v) in 2SHB vor, indem Sie 2 L MMTS zu 998 L 2SHB-Puffer hinzufügen.
   HINWEIS: Verwenden Sie für jedes Experiment frisch zubereitete 0,2% MMTS.
3. Fügen Sie jedem Rohr 200 l 0,2% MMTS in 2SHB zu einer Endkonzentration von 0,1% MMTS hinzu. 15 min bei 42 °C mit Schütteln bei 1500 Umdrehungen pro Minute in einem Thermoshaker inkubieren.

3. Acyl-RAC: Hydroxylamin (HAM) Spaltung und Erfassung von S-acyatierten Proteinen

1. Wiederholen Sie 3-4x CM-Ausfällungen wie oben beschrieben, um MMTS zu entfernen. Die Entfernung von MMTS kann durch den Mangel an ausgeprägtem Geruch von MMTS geschätzt werden. Nach jeder Ausfällung das Pellet in 100 L 2SHB-Puffer auflösen, indem man bei 42 °C/1500 Umdrehungen in einem thermischen Shaker wirbelt, bis sich das Pellet auflöst, und dann mit 300 l Puffer A verdünnen.
2. Nach der endgültigen Fällung Proben in 200 L 2SHB-Puffer wie oben beschrieben auflösen und mit 240 l Puffer A verdünnen.
3. Im Falle des Vergleichs von Veränderungen der S-Acylation als Reaktion auf mehrere Behandlungsbedingungen, messen Sie die Proteinkonzentration erneut und gehen Sie mit der gleichen Menge an Protein für jede Bedingung vor.
4. Bewahren Sie 40 l von jeder Probe als Eingabesteuerung auf.
5. Teilen Sie die Proben in zwei gleiche Teile von 200 l auf und markieren Sie Rohre als "+ HAM" und "- HAM". Fügen Sie 50 l frisch zubereitete neutrale 2 M HAM (pH 7.0-7.5) zu einer Endkonzentration von 400 mM in eines der Rohre (+ HAM) und 50 l neutrale 2 M NaCl in das zweite Rohr (- HAM) ein, das als Negativkontrolle verwendet wird. Fahren Sie mit der Zugabe von Thiopropyl-Sepharose (TS) Perlen fort.
   HINWEIS: Das Experiment kann nach einem der CM-Fällschritte beendet werden. Sobald das Pellet erhalten ist, kann es in 500 l MeOH in -20 °C bis zu einer Woche gelagert werden. Neutraler pH-Wert von 2 M HAM gewährleistet seine Selektivität für die Acyl-Cystein-Thioester-Bindung und sollte sorgfältig eingestellt werden. Bei der Handhabung von Proben im 2SHB-Puffer ist Vorsicht geboten, um probenverlust durch übermäßiges Schäumen zu vermeiden. Alle folgenden Schritte sind identisch für - HAM und + HAM Proben.
6. Fügen Sie jedem Rohr 30 L TS-Perlenschlämme hinzu und drehen Sie die Rohre bei RT um 1-2 h.
7. Waschen Sie die TS-Perlen 4x mit 1% SDS in Puffer A, um Rest-HAM zu entfernen.
   1. Drehen Sie alle Perlenproben vorsichtig mit einer Mikrofuge für 1 min und saugen Sie vorsichtig den Überstand an.
   2. Setzen Sie die Perlen in 500 l von 1% SDS in Puffer A wieder aus.
   3. Wiederholen Sie Schritt 3.7.1–3.7.2 dreimal.
      HINWEIS: Aktivierte Thiopropyl-Sepharose (TS) wird gefriergetrocknet in Gegenwart von Additiven geliefert, die vor der Kopplung bei neutralem pH-Wert weggewaschen werden müssen. Destilliertes Wasser wird zum Anschwellen und Waschen empfohlen. 0,1 g Perlen wiegen und in 1 ml destilliertem Wasser wieder aufhängen und beim Drehen von 30 min-1 h bei RT anschwellen lassen. Perlen 1x mit Puffer A waschen und eine Gülle mit Puffer A im Verhältnis von 50% mittel- zu 50% Puffer vorbereiten. Geschwollene TS können bis zu einer Woche bei neutralem pH-Wert in Gegenwart von 20% Ethanol bei 4 °C gelagert werden. Verwenden Sie Natriumazid nicht als bakteriostatisches Mittel, da Azidionen mit den 2-Pyridyldisulfidgruppen reagieren. Für eine höhere Effizienz, bereiten Sie frische Perlen. Beim Umgang mit den Perlen kann die Spitze einer P200 Pipettenspitze leicht geschnitten werden, um Schäden zu vermeiden.
      HINWEIS: Das Experiment kann in jeder Phase nach CM-Fällung gestoppt werden. Das Pellet kann in 500 l MeOH in -20 °C bis zu einer Woche gelagert werden.

4. Elution und Nachweis von S-acyatierten Proteinen

1. Nach der letzten Wäsche die Perlen wie oben beschrieben sanft herunterdrehen und so viel Überstand wie möglich ansaugen, ohne die Perlen zu stören.
2. Stellen Sie die Proteine aus Perlen mit 4x SDS-Probenpuffer mit DTT zurück.
   1. Fügen Sie den Perlen 50 L 4x SDS-Probenpuffer hinzu und brüten bei 80 °C, 1500 Umdrehungen pro Minute für 15 min in einem Thermoshaker. Lassen Sie die Rohre abkühlen.
   2. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 5.000 x g für 3 min, um die Perlen vollständig zu pellet und die eluierten Proteine mit einer Gel-Ladespitze in ein frisches 1,5 ml-Rohr zu übertragen.
3. Führen Sie SDS-PAGE aus und analysieren Sie die S-Acylierung der Proteine, die von Interesse sind, durch Western Blotting.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll verwendeten wir zunächst Acyl-RAC, um gleichzeitig die S-Acylierung mehrerer Proteine in Jurkat-Zellen zu erkennen, einer verewigten T-Zelllinie, die ursprünglich aus dem peripheren Blut eines T-Zell-Leukämiepatienten abgeleitet wurde27. Regulatorische T-Zellproteine, die zuvor als S-acylatierte9,28,29 identifiziert wurden, wurden ausgewählt, um den Nutzen dieser Methode zu demonstrieren. Wie in Abbildung 2Adargestellt, kann Tyrosinkinase Lck in Lysaten nachgewiesen werden, die mit neutralem 2 M Hydroxylamin behandelt werden, um die Thioesterbindung zwischen Cysteinrückständen und einer Fettsäuremoiety (+ HAM Lane) zu spalten. Die mit 2 M NaCl (- HAM-Spur) behandelte Probe stellt eine wichtige Negativkontrolle dar, die die Selektivität des Assays zur Detektion der Thioesterbindungen angibt. Die Eingangsspur bestätigt ferner die Spezifität des Signals und kann als positive Kontrolle dienen, wenn das Protein von Interesse nicht S-acylated ist. Die Membran wurde dann abgestreift und mit Antikörpern gegen die Proteine Fyn und LAT regetestet, um zu zeigen, dass der Acyl-RAC-Assay verwendet werden kann, um die S-Acylierung mehrerer Proteine gleichzeitig zu analysieren (Abbildung 2A).

Um den Nutzen dieser Methode zum Nachweis der Protein-S-Acylation in Gewebeproben zu demonstrieren, haben wir das Acyl-RAC-Protokoll auf die Mausmilz angewendet. Wie in Abbildung 2Bdargestellt, kann die S-Acylierung von Lck, Fyn und LAT leicht in primären Maussplenozyten nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass diese Modifikation zwischen zwei Arten konserviert wird.

Abbildung 1. Schematische Darstellung von acyl-RAC. Das Verfahren besteht aus 4 Hauptschritten: (1) Blockierung freier Thiolgruppen mit Methylmethansulfonat (MMTS), (2) selektive Spaltung der Cystein-Acyl-Thioester-Bindung mit neutralem Hydroxylamin (HAM), um Cystein-Thiol-Gruppen zu belichten, (3) Erfassung von Proteinen mit neu exponiertem Cysteinthiol durch direkte Konjugation mit einem Thiol-reaktiven Harz und (4) Rückgewinnung von eingefangenen Proteinen unter Verwendung eines reduzierenden Elutionspuffers, gefolgt von Immunoblotting oder MS-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Nachweis von S-acyatierten Proteinen. Ein Acyl-RAC-Assay wurde verwendet, um S-Acylation von T-Zell-Signalproteinen in Jurkat-T-Zellen (A) und murinem Milzgewebe (B) zu detektieren. Die Immunoblotting mit Lck-, Fyn- und LAT-spezifischen Antikörpern zeigt die S-Acylation dieser Proteine in der mit Hydroxylamin behandelten Probe (+ HAM Lane). Eine mit Natriumchlorid (- HAM-Spur) behandelte Probe dient als Negativkontrolle. Unbehandelte Lysate werden in der Eingabespur angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Pufferzusammensetzung der häufig verwendeten Puffer, die im Protokoll erforderlich sind. 2SHB-Puffer und Puffer A können im Voraus vorbereitet werden, aber ihr pH-Wert muss regelmäßig überprüft werden. Lysispuffer und HAM müssen am Tag des Experiments vorbereitet werden.

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.