Die Palmitoylierung beinhaltet die Umarbeitung einer 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moiety zu Cysteinrückständen von Zielproteinen in reversibler Weise. Hier beschreiben wir einen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay, um den Palmitoylierungszustand eines Proteins zu untersuchen, das für Maushirnlysate von Interesse ist.
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Methodenartikel
Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay zur quantitativen Bestimmung der Palmitoylierung von Gehirnmembranproteinen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Aktivitätsabhängige Veränderungen in den Konzentrationen von synaptischen AMPA-Rezeptoren (AMPARs) innerhalb der postsynaptischen Dichte (PSD) wird angenommen, um einen zellulären Mechanismus für das Lernen und Gedächtnis darstellen. Die Palmitoylierung reguliert die Lokalisierung und Funktion vieler synaptischer Proteine, einschließlich AMPA-Rs, Hilfsfaktoren und synaptischen Gerüste auf aktivitätsabhängige Weise. Wir identifizierten die Synapsendifferenzierunginduzierte Gen (SynDIG) Familie von vier Genen (SynDIG1-4), die hirnspezifische Transmembranproteine kodieren, die mit AMPARs assoziiert werden und die Synapsenstärke regulieren. SynDIG1 wird bei zwei Cysteinrückständen an den Positionen 191 und 192 in der für die aktivitätsabhängige Exzitatoren-Synapsenentwicklung wichtigen Region der Juxta-Transmembran palmitoyiert. Hier beschreiben wir einen innovativen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay, um den Palmitoylierungszustand eines beliebigen Proteins zu untersuchen und seinen Nutzen mit der SynDIG-Proteinfamilie in Maushirnlysaten zu demonstrieren.
Einleitung
S-Palmitoylierung ist eine reversible posttranslationale Modifikation von Zielproteinen, die eine stabile Membranverbindung, Proteinhandel und Protein-Protein-Wechselwirkungen reguliert1. Es beinhaltet die Zugabe einer 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moiety zu Cystein-Rückständen über Thioester-Verbindung, die durch Palmitoyl-Acyltransferase (PAT)-Enzyme katalysiert wird. Viele synaptische Proteine im Gehirn sind palmitoylated, einschließlich AMPA-Rs und PSD-95, in einer aktivitätsabhängigen Weise, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion2,,3,4zu regulieren. ....
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Protokoll
Alle tierischen Verfahren folgten den Richtlinien der National Institutes of Health (NIH) und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, Davis, genehmigt.
1. Vorbereitung von Maus-Gehirnmembranen
- Enthaupten Sie die Maus mit einem Guillotine-Apparat und sezieren Sie das Gehirn schnell (in <1 min, wenn möglich, um Palmitoylierungsänderungen zu minimieren, die während des Sezierens auftreten können). Homogenisieren Sie sofort in 10 ml Homogenisierungspuffer (Tabelle 1) in einem Glashomogenisator (ca. 12 Striche) auf Eis.
- Zentrifugenlysate für 15 min bei 1.400 x ....
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Ergebnisse
Die Immunoblotting mit Antikörpern gegen das Protein von Interesse zeigt den palmitoylated Zustand (nicht, singly, doppelt, etc.) in Maus Gehirnlysaten, wie durch Mobilitätsverschiebung im Vergleich zu Proben, in denen HAM nicht enthalten war bestimmt. Zuvor hatten wir gezeigt, dass SynDIG1 an zwei Standorten mit dem ABE-Assay6palmitoylated wurde; Wir konnten jedoch nicht feststellen, ob beide Standorte im Hirngewebe verändert wurden. Hier zeigen wir, dass SynDIG1,.......
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Diskussion
In unserer vorherigen Arbeit haben wir den ABE-Test verwendet, um zu zeigen, dass SynDIG1 bei zwei konservierten Juxta-Transmembran-Cys-Rückständen (in allen SynDIG-Proteinen) in einer aktivitätsabhängigen Weise palmitoyiert wird, um Stabilität, Lokalisierung und Funktion6zu regulieren. Eine Einschränkung ist, dass der ABE-Test eine Affinitätsreinigung mit Agaroseharzen erfordert, die als letzter Schritt im Verfahren mit Avidin-Moieties konjugiert werden, was zu einem signifikanten Signalverlust f.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Die Autoren danken K. Woolfrey für die Beratung und den Input zum APEGS-Assay. Diese Studien wurden durch Forschungsstipendien an E.D. von der Whitehall Foundation und dem NIH-NIMH (1R01MH119347) finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Hydroxylamin (HAM) | ThermoFisher | 26103 | |
| Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG) | NOF | ME-050MA | MW ~5000 kDa |
| Mikrofuge | Eppendorf | 5415R | oder gleichwertige |
| Ausrüstung N-Ethylmalemid (NEM) | Calbiochem | 34115 | Hochgiftig. |
| Optischer Imager für die Densitometrie | Azure Biosystems | Sapphire Biomolecular Imager | oder gleichwertige Geräte |
| Polypropylen-Röhrchen mit Kappe | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Serologische Pipetten (Glas) | Fisher Scientific | 13-678-27D | |
| Tischzentrifuge | Beckman | Allegra X-15R | oder gleichwertige Geräte |
| Tris(2-carboxyethyl)-phosphin-hydrochlorid (TCEP) | EMD Millipore | 580560 |
Referenzen
- Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. What does S-palmitoylation do to membrane proteins? FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).
- Fukata, Y., Fukata, M. Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity. Nature Reviews Neuroscience.
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Nachdrucke und Genehmigungen
