Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay zur quantitativen Bestimmung der Palmitoylierung von Gehirnmembranproteinen
29. März 2020
Die Palmitoylierung beinhaltet die Umarbeitung einer 16-Kohlenstoff-Palmitat-Moiety zu Cysteinrückständen von Zielproteinen in reversibler Weise. Hier beschreiben wir einen biochemischen Ansatz, den Acyl-PEGyl-Austausch-Gel-Shift (APEGS)-Assay, um den Palmitoylierungszustand eines Proteins zu untersuchen, das für Maushirnlysate von Interesse ist.
Diese biochemische Methode ermöglicht die Bestimmung des Palmitoylationszustands jedes Membranproteins, das im Gehirn exprimiert wird und für das ein geeigneter Antikörper zur Verfügung steht. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie keine Affinitätsreinigung erfordert und stattdessen Änderungen in der Gelmobilität nutzt, um die Anzahl der Modifikationen eines Proteins von Interesse zu bestimmen. Nach dem Aussezieren des Gehirns, homogenisieren Sie es sofort in 10 Milliliter Homogenisierungspuffer in einem Glas homogenisator auf Eis.
Mit ca. 12 Schlägen zentrifugieren Sie die Lysate 15 Minuten bei 1400 mal G und vier Grad Celsius. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre auf Eis. Das Pellet in 10 Milliliter Homogenisierungspuffer aussetzen.
Homogenisieren Sie es mit etwa sechs Strichen. Zentrifugieren Sie die Federung bei 710 mal G und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Kombinieren Sie die Überstand und Zentrifuge sie bei 40, 000 mal G und vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die pelletierte Membranfraktion in einem Homogenisierungspuffer wieder auf, indem Sie das Pellet mit einer Pipettenspitze aufbrechen und nach oben und unten pfeifen. Führen Sie ABCA-Assay durch, um den Proteinspiegel zu quantitieren. Um den APEGS-Test durchzuführen, legen Sie 470 Mikroliter Puffer A in eine 1,5-Milliliter-Röhre und fügen Sie etwa 100 bis 200 Milligramm Protein hinzu.
Sonicate die Röhre und dann trennen Sie das unlösliche Protein durch Zentrifugieren der Röhre bei 25 Grad Celsius und einem Minimum von 13.000 mal G für 10 Minuten. Übertragen Sie das lösliche Protein in eine neue 1,5-Milliliter-Röhre. Erstens, stören Sie die Disulfidbindungen, indem Sie das lösliche Protein in 25 Mikroliter TCEP für 60 Minuten bei 55 Grad Celsius inkubieren.
Dann blockieren Sie freie Cysteins, indem Sie die Lösung mit 12,5 Mikrolitern der Stammlösung von NEM für drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes beginnen Sie den Prozess der Chloroform Methanol Fällung. Übertragen Sie die Proteinlösung aus dem 1,5-Milliliter-Rohr auf ein Polypropylen- oder Glasrohr, das in einem schwingenden Schaufelrotor mit bescheidener Geschwindigkeit zentrifugiert werden kann.
Fügen Sie zwei Milliliter Methanol und Wirbel kurz hinzu. Fügen Sie einen Milliliter Chloroform und Wirbel kurz hinzu. Dann 1,5 Milliliter entionisiertes Wasser und Wirbel kurz wieder hinzufügen.
Falls erforderlich, invertieren Sie das Rohr, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Zentrifugieren Sie die Proben bei 3000 mal G und 25 Grad Celsius für 30 Minuten in einem schwingenden Schaufelrotor. Entfernen und entsorgen Sie die obere Phase der Lösung vorsichtig in einem Rohr.
1,5 Milliliter Methanol hinzufügen. Mischen Sie sanft, aber gründlich durch sanfte Umkehrung der Röhre, achten Sie darauf, nicht den undurchsichtigen Protein Pfannkuchen fragmentieren. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten in einem schwingenden Schaufelrotor.
Mit einer serologischen Glaspipette so viel wie möglich von der Obersten Phase der Lösung entfernen, ohne den Proteinpfannkuchen zu stören. Spülen Sie das Pellet vorsichtig mit einem Milliliter Methanol ab und lassen Sie es mindestens 10 Minuten trocknen. Wenn die Chloroform Methanol-Fällung abgeschlossen ist, beginnen Sie die Spaltung der Palmitoyl-Thioester-Verbindungen, indem Sie den Proteinauslauf in 125 Mikroliter Puffer A.Transfer in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr wieder aufsetzen.
Beschallen Sie das Rohr kurz und zentrifugieren Sie es dann bei 13 000 mal G oder höher und 25 Grad Celsius für 10 Minuten, um unlösliches Material zu entfernen. Übertragen Sie das lösliche Protein in neue 1,5-Milliliter-Röhren und fügen Sie 375 Mikroliter Puffer H oder Puffer T hinzu. Nach der Inkubation der Proben für 60 Minuten bei Raumtemperatur, wiederholen Sie die Chloroform Methanol-Ausfällung. Um m-PEG zu ungeschützten Cysteins hinzuzufügen, beginnen Sie mit dem Wiederaufsetzen des Pellets in 100 Mikroliter Puffer A, der 10 mil oder mehr TCEP enthält.
Dann die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Rohr geben. Fügen Sie 25 Mikroliter Der Vorrat m-PEG 5K Lösung und mischen durch Pipettieren. Bei Raumtemperatur mit End-over-End-Rotation inkubieren.
Entfernen Sie nach 60 Minuten Inkubation m-PEG 5K ohne Inkorporation, indem Sie erneut Chloroform-Methanol-Fällung durchführen. Zentrifuge bei mehr als 13.000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie vorsichtig die obere Phase wie zuvor, um den dicken, flockigen Pfannkuchen zu vermeiden.
Einen Milliliter Methanol dazugeben und schonend, aber gründlich mischen. Zentrifuge bei mehr als 13.000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und spülen Sie das Pellet mit einem Milliliter Methanol ab.
Wieder Zentrifuge bei mehr als 13.000 mal G und 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Nach dem Lufttrocknen des Pellets in 50 Mikroliter Puffer A ohne TCEP oder einem Reduktionsmittel wieder aufsetzen. Reservieren Sie 5 Mikroliter der Lösung für die BCA-Proteinquantitation.
Nach der Quantifizierung eine entsprechende Menge an 4x Laemmli-Probenpuffer hinzufügen. Laden Sie das Beispiel auf ein SDS-Seitengel. Verwenden Sie Standard-Trennübertragungs- und -erkennungsprotokolle für das Western-Blotting.
Um den Palmitoylierungszustand von SynDIG-Proteinen zu untersuchen, wurden P2-Membranfraktionen aus homogenisierten Maushirnen dem APEGS-Assay unterzogen. Die Trennung und Untersuchung mit Antikörpern zeigte, dass SynDIG1, SynDIG4 Prrt1 und Prrt2 im Mausgehirn palmitoylated sind. Der Zweck der Chloroform-Methanol-Ausfällung besteht darin, eine Chemikalie wie NEM zu verhindern, die den nächsten Schritt des Protokolls beeinträchtigt.
Eine richtige Chloroform Methanol Fällung entfernt unerwünschte Chemikalien und minimiert gleichzeitig den Proteinverlust. Diese Methode kann auf Gehirnlysate von Mäusen unterschiedlichen Alters oder aus verschiedenen Hirnregionen angewendet werden, um die räumlich-zeitlichen Vorschriften der Palmitoylierung zu untersuchen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine biochemische Methode zur Untersuchung des Palmitoylierungszustands von Proteinen in lysierten Maushirnen vor. Der Acyl-PEGyl-Exchange-Gelshift-Assay (APEGS) ermöglicht die Analyse von Membranproteinen ohne die Notwendigkeit einer Affinitätsreinigung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biokemie
- Proteinmodifikation
Hintergrund
- Die Palmitoylierung ist eine reversible Modifikation, bei der Palmitat an Cystein-Reste angehängt wird.
- Diese Modifikation spielt eine entscheidende Rolle bei der Funktion und Lokalisation von Membranproteinen.
- Das Verständnis der Palmitoylierung kann Einblicke in verschiedene neurologische Prozesse ermöglichen.
- Aktuelle Methoden zur Analyse der Palmitoylierung erfordern oft komplexe Reinigungsschritte.
Zweck der Studie
- Eine einfache Methode zur Beurteilung des Palmitoylierungszustands von Proteinen im Gehirngewebe entwickeln.
- Die Notwendigkeit einer Affinitätsreinigung bei der Analyse von Membranproteinen eliminieren.
- Forschern, die an Proteinmodifikationen in der Neurowissenschaft arbeiten, ein Werkzeug zur Verfügung stellen.
Verwendete Methoden
- Homogenisierung von Maushirngewebe in einem spezifischen Puffer.
- Zentrifugation zur Trennung des Überstandes, der die Proteine von Interesse enthält.
- Anwendung des APEGS-Assays zur Bestimmung der Palmitoylierungszustände basierend auf Mobilitätsverschiebungen im Gel.
- Verwendung geeigneter Antikörper zum Nachweis der Zielproteine.
Hauptergebnisse
- Der APEGS-Assay identifiziert erfolgreich die Palmitoylierungszustände verschiedener Membranproteine.
- Änderungen der Gelelektrophorese-Beweglichkeit korrelieren mit dem Grad der Palmitoylierung.
- Diese Methode bietet ein schnelles und effizientes Verfahren zur Analyse von Proteinmodifikationen.
- Die Ergebnisse demonstrieren die Vielseitigkeit des Assays bei verschiedenen Proteinen.
Schlussfolgerungen
- Der APEGS-Assay ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Palmitoylierung in der Neurowissenschaft.
- Diese Methode vereinfacht die Analyse von Proteinmodifikationen in Gehirngeweben.
- Zukünftige Anwendungen könnten unser Verständnis der Funktionen von Membranproteinen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Beurteilung der Palmitoylierungszustände in membranständigen Hirnproteinen unterstützt die Zielvalidierung für synaptische Signalwege. Der APEGS-Assay ermöglicht die quantitative Bestimmung von Lipidmodifikationen ohne Affinitätsreinigung und reduziert so den werkflussbedingten Aufwand. Dieser Ansatz liefert eine mechanistische Entlastung für die Wirkstoffforschung im ZNS, indem er posttranslationale Modifikationen mit Rezeptortransport und synaptischer Plastizität verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem der Palmitoylierungsstatus synaptischer Proteine wie SynDIG1 bestimmt wird, die den AMPAR-Transport regulieren.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch Gelmobilitätsverschiebungen, die mit den Modifikationszuständen in nativen Hirnlysaten korrelieren.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem aktivitätsabhängige Veränderungen der Palmitoylierung identifiziert werden, die für die Entwicklung erregbarer Synapsen relevant sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem die Palmitoylierungs-abhängige Lokalisation von Membranproteinen bestätigt wird.
- Operativer Wert: Schafft Standardisierung des Assays durch quantitative Gelelektrophorese-Ergebnisse, die die Stöchiometrie der Modifikation widerspiegeln.
- Plattform-Wert: Unterstreicht die Eignung für Screenings durch eine wiederverwendbare Methode, die auf mehrere Proteine der SynDIG-Familie im Maushirn anwendbar ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz, indem die Verknüpfung der SynDIG1-Palmitoylierung mit der aktivitätsabhängigen Bildung erregender Synapsen hergestellt wird, ein Prozess, der bei neuropsychiatrischen Erkrankungen verändert ist.
- Operativer Wert: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem eine räumlich-zeitliche Analyse der Palmitoylierung über verschiedene Hirnregionen und Altersstufen hinweg ermöglicht wird.
- Risikoadjustierte Fortentwicklung: Konzentriert sich auf prädiktive Entlastung, indem ein biomarkerbasiertes Messergebnis für die synaptische Proteinfunktion bereitgestellt wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der APEGS-Assay fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Target-Validierung bis zur präklinischen Bewertung ein, indem er Daten zum Modifikationszustand liefert, die Aufschluss über die Arzneimittelwirksamkeit des Targets und die Beteiligung des Signalwegs geben.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung unterstützt, indem sie die palmitoylierungsabhängige Regulation synaptischer Gerüstproteine aufdeckt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand quantitativer Gelaufwandverschiebungen, die den Vergleich von Modifikationszuständen unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Analytik: Betont Messungen wie Bandverschiebungen in der SDS-PAGE, die Teams dabei helfen, Palmitoylierungsniveaus zwischen experimentellen Gruppen zu vergleichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem sie die Beurteilung der Palmitoylierung in krankheitsrelevanten Modellen ermöglicht.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit dar, um jedes im Gehirn exprimierte Membranprotein mit einem geeigneten Antikörper zu analysieren.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Target-Validierung durch direkte Beurteilung der Palmitoylierungszustände in natives Gewebe.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Skalierbarkeit mittels eines gelförmigen Nachweises, der mit der Standard-Western-Blot-Infrastruktur kompatibel ist.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen durch Verringerung mechanistischer Unklarheiten bezüglich lipidabhängiger Proteinlokalisation.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierung durch frühzeitige Erkennung von Modifikationszuständen, die die synaptische Proteinfunktion und Eignung als Arzneimitteltarget beeinflussen.
Durchführungsüberlegungen
- Erforderliche wissenschaftliche Fachkenntnisse in der Proteinbiochemie und Western-Blot-Techniken.
- Zu den Anforderungen an Geräte und analytische Infrastruktur gehören Zentrifugen, Ultraschallzerreißer und Gelelektrophorese-Systeme.
- Standardisierungsanforderungen über mehrere Arbeitsgruppen hinweg für konsistente Chloroform-Methanol-Fällung und PEGylierungsschritte.
- Anpassungsüberlegungen bei verschiedenen Modellsystemen, wie unterschiedlichen Mausaltern oder Hirnregionen, zur Untersuchung der räumlich-zeitlichen Regulation.
- Zu den praktischen Einschränkungen zählen der Bedarf an hochwertigen Antikörpern und die Optimierung der Proteinbeladung für eine klare Auflösung von Gelverschiebungen.
