Dieses Protokoll beschreibt einen effektiven In-situ-Hybridisierungsansatz, um die mRNA-Expressionsniveaus und räumlichen Muster von Zielgenen in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu erkennen.
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Methodenartikel
In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine sehr informative Technik, um zelluläre Verteilungsmuster bestimmter Gene (z. B. mRNA und ncRNA) in Geweben darzustellen. Der Sipunculid-Wurm Sipunculus nudus ist eine wichtige Fischereiressource, da er hohe nährwert- und medizinische Werte hat. Derzeit steckt die Erforschung der Molekularbiologie von Sipunculus nudus noch in den Kinderschuhen. Der Zweck dieses Artikels ist es, eine empfindliche Methode zur Lokalisierung spezifischer mRNA in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu entwickeln. Das Protokoll enthält detaillierte Schritte der ISH, einschließlich Digoxigenin-markierter Antisense- und Sense-Riboprobe-Vorbereitung, coelomischer Flüssigkeitssammlung und Abschnittsvorbereitung, spezifischer Riboprobe-Hybridisierung, Antikörperinkubation, Färbung und Nachfärbungsbehandlungen. Die repräsentativen Ergebnisse eines erfolgreichen Experiments mit dieser Methode werden demonstriert. Das Protokoll sollte auch für andere Sipuncula-Arten gelten.
Einleitung
Die ISH ist mit Hilfe einer markierten Nukleinsäuresonde, um die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz von Interesse zu erkennen, eine nützliche Methode, um das räumliche Expressionsmuster von Zielgenen in morphologisch konservierten Geweben1,2,3zu beschreiben. Normalerweise wird die Zielsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt und dann als Vorlage zur Synthese der antisense/sense RNA-Sonde mit Digoxigenin-Uridin-5'-Triphosphat verwendet. Die Proben werden vor der Inkubation mit Riboprobe fixiert und permeabilisiert. Nach dem Abwaschen der überschüssigen Sonde wird d....
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Protokoll
Das Tierverfahren wurde vom Animal Care and Welfare Committee der Huaqiao University genehmigt.
1. Riboprobe Vorbereitung
- Primer-Design
- Öffnen Sie das Programm Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Kopieren Sie die dmrt1-Sequenz (GenBank: MK182259) in das Sequenzfenster.
- Grundierungslänge (23-25 bp), Schmelztemperatur (55-60 °C) und G/C-Gehalt (40-60%). Klicken Sie auf Primer auswählen.
HINWEIS: Die für die RNA-Sonde erforderliche Mindestgröße beträgt ca. 500 bp. Längere Sonden haben normalerweise eine höhere Spezifität. - Fügen Sie die T7-RNA-Polymerase-Pr....
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Ergebnisse
Abbildung 1ist eine Zusammenfassung der Schritte der ISH dargestellt. Antisense und entsprechende Sense-Ribosonden für dmrt1 wurden aus PCR-Produkten synthetisiert, die aus der coelomischen Flüssigkeit cDNAs verstärkt wurden. Die Echtheit der PCR-Produkte wurde durch direkte Sequenzierung überprüft. Riboprobes wurden mit T7-RNA-Polymerasen nach den Protokollen des Herstellers und einem früheren Bericht4 mit einigen geringfügigen Modifikationen synthetisiert. .......
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Diskussion
Frühere Studien zeigten, dass ISH zum Nachweis mehrerer Ziel-RNAs16,17,18geeignet ist. In diesem Protokoll haben wir eine hochauflösende ISH-Methode beschrieben, um die mRNA in coelomischer Flüssigkeit zu detektieren und die optimierten Hybridisierungsbedingungen in Sipunculus nudus hervorzuheben. Die offensichtlichen Signale von dmrt1, die wir beobachteten, zeigten die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom Young Scientists Fund der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), der Natural Science Foundation of Fujian Province, China (2016J01161), den Scientific Research Funds der Huaqiao University (15BS306) und dem Innovative Fund in Scientific Research der Huaqiao University unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmente | Roche | 11093274910 | |
| BCIP/NBT alkalische Phosphatase Farbentwicklungskit | Beyotime | C3206 | |
| Rinderserum Albumin | Sigma | B2064 | |
| Zentrifuge | Eppendorf | 5415R | |
| Zitronensäure | Sinopharm Chemisches Reagenz Co. | 5949-29-1 | |
| Zitronensäure-Trinatrium-Sinopharm-Chemikalienreagenz Co. | 03.04.6132 | ||
| Deckgläser | Beyotime | FCGF60 | |
| Deionisiertes Formamid | Amresco | 07.12.1975 | |
| Diethylpyrocarbonat, DEPC | Sigma | D5758 | Schädliche Substanz |
| Digoxigenin (DIG) RNA-Markierungsmischung | Roche | 11277073910 | |
| DNase I, RNase-freies | Invitrogen | 18047019 | |
| EDTA | Sigma | 431788 | |
| Elektrophorese Gel Imaging | Bio-Rad | Universal Hood III | |
| Ethanol | Sinopharm Chemisches Reagenz Co. | 64-17-5 | |
| Gel-Extraktionskits | Omega | D2500 | |
| Gel-Elektrophorese-Gerät | Beijing Liuyi Instrument Factory | DYY-6C | |
| Glycerin | Sinopharm Chemisches Reagenz Co. | 56-81-5 | |
| Glycin | Sigma | G5417 | |
| Heparin | Sigma | 01.08.9041 | |
| KCl | Sinopharm Chemisches Reagenz Co. | 7447-40-7 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemisches Reagenz Co. | 7778-77-0 | |
| LiCl | Sigma | 203637 | |
| Maleinsäure | Sinopharm Chemisches Reagenz Co. KG | 110-16-7 | |
| Methanol | Sinopharm Chemisches Reagenz Co. | 67-56-1 | Schädliche Substanz |
| MgCl2 | Sinopharm Chemisches Reagenz Co. | 7786-30-3 | |
| Na2HPO4 | Sinopharm Chemisches Reagenz Co. | 7558-79-4 | |
| NaCl | Biofount | JT0001 | |
| NaOH | Sinopharm Chemisches Reagenz Co. | 1310-73-2 | Ätzende |
| Paraffinfolie | Bemis Company, Inc. | PM-996 | |
| Paraformaldehyd, PFA | Sigma | 158127 | Schadstoffe |
| PCR Instrument | Life Technology | Proflex | |
| Pins | Deli | 16 | |
| Pipette | Eppendorf | plus G | |
| Poly-D-Lysin behandelte Objektträger | Liusheng | VER_A01 | |
| Proteinase K | Sigma | ||
| RNase freies Wasser | HyClone | SH30538. 02 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 3335399001 | |
| S. nudus | |||
| Schafsserum | Beyotime | C0265 | |
| Objektträger Färbeglas | Beyotime | FG010 | |
| Objektträger Aufbewahrungsbox | Beyotime | FBX011 | |
| Kleine autoklavierte Schere | Shuanglu | sku_8330 | |
| Spektralphotometer | Thermo Fisher | NanoDrop 2000/2000c | |
| T7 RNA-Polymerasen | Roche | 10881767001 | |
| Taq DNA-Polymerase-Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| Tris HCl | Sigma | RES3098T | |
| tRNA | Roche | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Wasserbad | Zhengzhou Große Mauer Wissenschaftlich Industrie | HH-S2 |
Referenzen
- Tsai, C. J., Harding, S. A. In situ hybridization. Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).
- Koshiba-Takeuchi, K. Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization. Methods in Cell Biology....
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Nachdrucke und Genehmigungen
