In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Die ISH ist mit Hilfe einer markierten Nukleinsäuresonde, um die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz von Interesse zu erkennen, eine nützliche Methode, um das räumliche Expressionsmuster von Zielgenen in morphologisch konservierten Geweben^1,2,3zu beschreiben. Normalerweise wird die Zielsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt und dann als Vorlage zur Synthese der antisense/sense RNA-Sonde mit Digoxigenin-Uridin-5'-Triphosphat verwendet. Die Proben werden vor der Inkubation mit Riboprobe fixiert und permeabilisiert. Nach dem Abwaschen der überschüssigen Sonde wird die Hybridisierung durch Immunhistochemie mit einem Anti-Digoxygenin-Antikörper visualisiert, der alkalische Phosphatase-konjugierte^3,4,5,6ist.

Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; Ordnung Sipunculida: Sipunculidae) ist ein unsegmentierter, koeloatischer und bilateral symmetrischer Meereswurm^7,8. Sipunculus nudus ist eine kosmopolitische Art, die in tropischen und gemäßigten Küstengewässern verbreitet ist. Es ist auch eine wichtige Meeresfischerei Ressource in Südchina wegen seiner hohen Nährwert und medizinische Werte^9,10. Sipunculus nudus in der Molekularbiologie steckt jedoch noch in den Kinderschuhen. Um die biologische Rolle von Genen vollständig zu verstehen, ist die Untersuchung von Genexpressionsmustern bei einer zellulären Auflösung von großem Interesse. Im Nichtmodellorganismus Sipunculus nudusist die ISH-Methode, die eine ideale Methode zum Nachweis der Genexpressionsmuster ist, noch nicht etabliert. Seine koelomische Flüssigkeit enthält mehrere Zelltypen, einschließlich Granulozyten, Urnenzellen, vesikuläre Zellen, Keimzellen, Erythrozyten, etc¹¹. Der Doppelsex/mab-3-bezogene Transkriptionsfaktor-1 (dmrt1), der als repräsentatives Gen bei dieser Methode verwendet wird, ist ein hochkonservierter Transkriptionsregulator für die Geschlechtsbestimmung und -differenzierung bei den meisten Arten, die von Wirbellosen bis zu Säugetieren reichen^12,13. In einer Reihe von Arten (z. B. schwarze Porgie, etc.) ¹⁴, dmrt1 wurde in den Sertoli-Zellen ausgedrückt, die die Keimzellen umgeben, deren Funktion den Trophoblastenzellen von Sipunculus nudusähnelt. Daher vermuteten wir, dass dmrt1 von Sipunculus nudus in Trophoblastenzellen von Spermatozeugmata exprimiert wird, und das Ergebnis der ISH-Methode bestätigte eindeutig die Hypothese.

Dieses Protokoll beschreibt zum ersten Mal die ISH mit digoxigenin-markierten Antisense/Sense mRNA-Sonden, um mRNA-Expressionsmuster in ihrem coelomischen Flüssigkeitsabstrich zu bestimmen. Es werden optimale Reaktionsbedingungen bereitgestellt, die eine sehr empfindliche Visualisierung der mRNA-Expression bei hoher Auflösung ermöglichen. Die entwickelte ISH-Methode könnte möglicherweise bei mehr Sipunculida-Arten außer Sipunculus nudus angewendet werden.

Das Tierverfahren wurde vom Animal Care and Welfare Committee der Huaqiao University genehmigt.

1. Riboprobe Vorbereitung

1. Primer-Design
   1. Öffnen Sie das Programm Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Kopieren Sie die dmrt1-Sequenz (GenBank: MK182259) in das Sequenzfenster.
   2. Grundierungslänge (23-25 bp), Schmelztemperatur (55-60 °C) und G/C-Gehalt (40-60%). Klicken Sie auf Primer auswählen.
      HINWEIS: Die für die RNA-Sonde erforderliche Mindestgröße beträgt ca. 500 bp. Längere Sonden haben normalerweise eine höhere Spezifität.
   3. Fügen Sie die T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz (5^, -TAATACGACTCACTATAGGG-3^,) zu einem der ausgewählten Primer hinzu. Die dmrt1 Primersequenzen für ISH sind in Tabelle 1dargestellt.
      HINWEIS: Bei Sinnessonden befindet sich der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende der Vorwärtsprimer. Bei Antisense-Sonden befindet sich der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende der Reverse-Primer.
2. PCR-Verstärkung
   1. Legen Sie die Mikrofugenrohre auf Eis und bereiten Sie den folgenden Reaktionsmix vor (für eine 50-L-Reaktion): 1x Taq-DNA-Polymerase-Mix, 1 g cDNA (die aus 100 l coelomischer Flüssigkeit hergestellt wird), 1 'M Vorwärtsprimer, 1 'M Reverse Primer und nukleasefreies Wasser.
   2. Mischen Sie die PCR-Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz.
   3. Legen Sie das Reaktionsrohr in einen thermischen Cycler und führen Sie die PCR unter folgenden Bedingungen aus: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 2 min, gefolgt von 36 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s, Glühen bei 55-60 °C für 30 s, Verlängerung bei 72 °C für 30 s und Endverlängerung bei 72 °C für 7 min.
      HINWEIS: Die Glühtemperatur sollte entsprechend den Primern optimiert werden.
3. PCR-Produktreinigung und -verifizierung
   1. Laden Sie die 50 l PCR-Mischung direkt auf ein 1% Agarose-Gel. Führen Sie das Agarose-Gel bei 150-180 V für 10 min in 0.5x TBE. Isolieren Sie die spezifischen DNA-Fragmente aus dem 1% Agarose-Gel.
      HINWEIS: DNA sollte als einzelnes Band und nicht als Abstrich erscheinen.
   2. Reinigen Sie die DNA-Fragmente mit einem Gel-Extraktions-Kit gemäß dem Herstellerprotokoll. Quantifizieren Sie die gereinigten Produkte durch Spektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 260 nm.
   3. Überprüfen Sie die Authentizität der PCR-Produkte durch Sequenzierung.
      HINWEIS: (Pausepunkt) Die gereinigten PCR-Produkte können mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.
4. Riboprobe-Synthese
   1. Legen Sie die RNase-freien Mikrofuge-Röhren auf Eis und fügen Sie dem Mikrofugenrohr Folgendes hinzu (für eine 10-L-Reaktion): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x Transkriptionspuffer, 0,5 l RNase-Inhibitoren, 1 L T7-RNA-Polymerasen, 1 g PCR-Produkt und RNase-freies Wasser. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz. 2 h bei 37 °C inkubieren.
   2. Fügen Sie 2 L RNase-freie DNase I hinzu. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz. 15 min bei 37 °C inkubieren.
   3. Fügen Sie 2 L 0,2 M EDTA (pH 8,0) hinzu. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz.
   4. Fügen Sie der obigen Reaktion 2,5 l 4 M LiCl und 75 l vorgekühltes Ethanol hinzu. Gut mischen. 30 min bei -70 °C lassen.
   5. Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C. Decant das Ethanol. 1 ml vorgekühltes 70% Ethanol (v/v) hinzufügen und den Niederschlag durch sanftes Mischen waschen.
   6. Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C. Das 70% Ethanol dekantieren und den Niederschlag kurz in der Nähe einer Alkohollampe trocknen. Lösen Sie den Niederschlag auf, indem Sie 30 l RNase-freies Wasser hinzufügen und sanft mischen.
   7. Laden Sie 2 l synthetisierte RNA auf ein 1% Agarose-Gel. Führen Sie das Agarose-Gel bei 180 V für 5-10 min in 0.5x TBE. Messen Sie die Konzentration der beschrifteten RNA mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm.
      1. Verwenden Sie RNase-freie Mikrofugenrohre und Filterspitzen, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden.
         HINWEIS: (Pausepunkt) Die mit Digoxygenin beschrifteten Sonden können mehrere Monate bei -70 °C gelagert werden.

2. Coelomic Flüssigkeitssammlung

1. Fixieren Sie den S. nudus auf dem Seziertisch mit Stiften. Öffnen Sie den Körper des S. nudus mit einer kleinen autoklaven Schere. Isolieren Sie die coelomische Flüssigkeit mit einer Pipette.
2. Sammeln und übertragen Sie 1 ml coelomische Flüssigkeit mit einer Pipette auf poly-D-Lysin behandelte Mikroskopschlitten. Tragen Sie die coelomische Flüssigkeit gleichmäßig mit einer Pipettenspitze auf. Die Schlitten 1 h bei 37 °C lufttrocknen.

3. In-situ-Hybridisierung

1. Tag 1
   1. Rehydrieren Sie die Dias in einem Dia-Färbeglas mit 100 ml 1x diethylpyrocarbonat behandelter Phosphat gepufferter Saline (DEPC-PBS). 3 mal mit 1x DEPC-PBS rehydrieren, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
   2. Permeabilisieren Sie den Abstrich von coelomischer Flüssigkeit durch Verdauung mit 10 g/mL-Proteinase K bei Raumtemperatur für 5 min. Inkubieren Sie die Dias in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min, um die Verdauung zu stoppen. Waschen Sie die Dias in 1x DEPC-PBS mit sanfter Rührung für 5 min 3 mal.
   3. Fügen Sie 50 l Hybridisierungsmix (HM) mit der Sense/Antisense-Riboprobe auf den Dias hinzu und fügen Sie einen Deckbedeckungsschlupf hinzu.
   4. Fügen Sie den Nasskastenpuffer in die Nassbox ein. Die Dias in die Nassbox stecken und mit Paraffinfolie gut versiegeln. Über Nacht (mindestens 16 h) bei 60 °C hybridisieren.
2. Tag 2
   1. Den Waschpuffer bei 65 °C vorheizen. Tauchen Sie die Folie in das Gleitfärbeglasmitglas ein, das den Waschpuffer enthält, und lassen Sie ihn stehen, bis der Deckelrutsch automatisch abrutscht. Es dauert ca. 5 min.
   2. 2 Mal mit Waschpuffer bei 65 °C waschen, 30 min pro Waschgang mit sanfter Rührung. 2 Mal mit 0,2x Saline-Natriumcitrat (SSC) bei 65 °C waschen, 30 min pro Wäsche mit sanfter Rührung. 2 Mal mit Maleinsäurepuffer mit Tween 20 (MABT) bei Raumtemperatur waschen, 30 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
   3. Inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur für 3-4 h im Sperrpuffer. Inkubieren Sie die Dias in 1 ml Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmentlösung bei 1/5000 mit dem Sperrpuffer bei 4 °C über Nacht verdünnt.
3. Tag 3
   1. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Dias kurz in MABT. 4 Mal mit MABT bei Raumtemperatur waschen, 25 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
   2. Inkubieren Sie die Dias mit alkalischen Phosphatasepuffer bei Raumtemperatur 3 mal, 5 min pro Wäsche. Entfernen Sie den alkalischen Phosphatasepuffer und fügen Sie 1 ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP)/Nitroblautetrazolium (NBT) Färbelösung hinzu. Halten Sie die Dias im Dunkeln.
   3. Beobachten Sie die Farbreaktion periodisch unter einem optischen Mikroskop. Wenn die Farbe vollständig entwickelt ist (Reaktionszeit im Bereich von 1-4 h), waschen Sie die Dias 2 mal mit MABT bei Raumtemperatur, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.
   4. 2 Mal mit Stop-Lösung bei Raumtemperatur waschen, 15 min pro Waschgang mit sanfter Rührung. Inkubieren Sie die Dias in Methanol, um überschüssige Flecken zu entfernen, bei Raumtemperatur für 30 min. Je nach Hintergrundfarbe kann die Methanolwäsche 2 oder 3 Mal durchgeführt und die Entfärbungszeit verlängert werden.
   5. 2 Mal mit MABT bei Raumtemperatur waschen, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung. Übertragen Sie die Dias auf ein frisches Filterpapier. Fügen Sie 50 l Glycerin hinzu. Fügen Sie die Abdeckungen hinzu und beobachten Sie mikroskopisch.
      HINWEIS: Die Lösungszusammensetzung ist in Tabelle 2dargestellt.

Abbildung 1ist eine Zusammenfassung der Schritte der ISH dargestellt. Antisense und entsprechende Sense-Ribosonden für dmrt1 wurden aus PCR-Produkten synthetisiert, die aus der coelomischen Flüssigkeit cDNAs verstärkt wurden. Die Echtheit der PCR-Produkte wurde durch direkte Sequenzierung überprüft. Riboprobes wurden mit T7-RNA-Polymerasen nach den Protokollen des Herstellers und einem früheren Bericht4 mit einigen geringfügigen Modifikationen synthetisiert. Die repräsentativen Signale der ISH sind in Abbildung 2dargestellt. ISH von Sipunculus nudus coelomic Fluid mit Antisense Riboprobe, die dmrt1 zielt zeigt lila Färbung konzentriert in Trophoblastzellen der Spermatozeugmata(Abbildung 2A, B,rote Pfeile). Eine Sense-Riboprobe wurde als Negativkontrolle verwendet, und die Sense-Riboprobe für dmrt1 erkannte kein Hybridisierungssignal (Abbildung 2C).

Abbildung 1. Flussdiagramm der ISH. Blaue Boxen sind die Schritte zur Synthese von Riboprobe. Hellgrüne Boxen sind Schritte für In-situ-Verfahren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Die Expression von dmrt1 in Sipunculus nudus coelomic Fluid von ISH nachgewiesen. (A, B) Hybridisierung mit dmrt1 Antisense-Riboprobe. (C) Hybridisierung mit dmrt1 Sinn Riboprobe. Die roten Pfeile stellen Hybridisierungssignale in Trophoblastzellen dar. sz, spermatozeugmata. Maßstabsleiste: 50 m. Diese Zahl wurde von Li et al.15geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1. Die dmrt1 Primersequenzen.

Tabelle 2. Die Zusammensetzung der im ISH-Protokoll verwendeten Lösungen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.