Name: In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Erfahren Sie die In-situ-Hybridisierung zur mRNA-Lokalisierung in der Coelomflüssigkeit von Sipunculus nudus. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung spezifischer Genexpressionsmuster für molekularbiologische Studien.

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Diese Arbeit wurde vom Young Scientists Fund der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31801034), der Natural Science Foundation of Fujian Province, China (2016J01161), den Scientific Research Funds der Huaqiao University (15BS306) und dem Innovative Fund in Scientific Research der Huaqiao University unterstützt.

Das Tierverfahren wurde vom Animal Care and Welfare Committee der Huaqiao University genehmigt.
1. Riboprobe Vorbereitung
<ol><li>Primer-Design<ol>
<li>Öffnen Sie das Programm Primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/). Kopieren Sie die dmrt1-Sequenz (GenBank: MK182259) in das Sequenzfenster.</li>
		<li>Grundierungslänge (23-25 bp), Schmelztemperatur (55-60 °C) und G/C-Gehalt (40-60%). Klicken Sie auf Primer auswählen. HINWEIS: Die für die RNA-Sonde erforderliche Mindestgröße beträgt ca. 500 bp. Längere Sonden haben normalerweise eine höhere Spezifität.</li>
		<li>Fügen Sie die T7-RNA-Polymerase-Promotorsequenz (5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3,) zu einem der ausgewählten Primer hinzu. Die dmrt1 Primersequenzen für ISH sind in Tabelle 1dargestellt. HINWEIS: Bei Sinnessonden befindet sich der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende der Vorwärtsprimer. Bei Antisense-Sonden befindet sich der T7-RNA-Polymerase-Promotor am 5'-Ende der Reverse-Primer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR-Verstärkung<ol>
<li>Legen Sie die Mikrofugenrohre auf Eis und bereiten Sie den folgenden Reaktionsmix vor (für eine 50-L-Reaktion): 1x Taq-DNA-Polymerase-Mix, 1 g cDNA (die aus 100 l coelomischer Flüssigkeit hergestellt wird), 1 'M Vorwärtsprimer, 1 'M Reverse Primer und nukleasefreies Wasser.</li>
		<li>Mischen Sie die PCR-Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz.</li>
		<li>Legen Sie das Reaktionsrohr in einen thermischen Cycler und führen Sie die PCR unter folgenden Bedingungen aus: anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 2 min, gefolgt von 36 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s, Glühen bei 55-60 °C für 30 s, Verlängerung bei 72 °C für 30 s und Endverlängerung bei 72 °C für 7 min. HINWEIS: Die Glühtemperatur sollte entsprechend den Primern optimiert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR-Produktreinigung und -verifizierung<ol>
<li>Laden Sie die 50 l PCR-Mischung direkt auf ein 1% Agarose-Gel. Führen Sie das Agarose-Gel bei 150-180 V für 10 min in 0.5x TBE. Isolieren Sie die spezifischen DNA-Fragmente aus dem 1% Agarose-Gel. HINWEIS: DNA sollte als einzelnes Band und nicht als Abstrich erscheinen.</li>
		<li>Reinigen Sie die DNA-Fragmente mit einem Gel-Extraktions-Kit gemäß dem Herstellerprotokoll. Quantifizieren Sie die gereinigten Produkte durch Spektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 260 nm.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Authentizität der PCR-Produkte durch Sequenzierung. HINWEIS: (Pausepunkt) Die gereinigten PCR-Produkte können mehrere Monate bei -20 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Riboprobe-Synthese<ol>
<li>Legen Sie die RNase-freien Mikrofuge-Röhren auf Eis und fügen Sie dem Mikrofugenrohr Folgendes hinzu (für eine 10-L-Reaktion): 1x Digoxygenin RNA Labeling Mix, 1x Transkriptionspuffer, 0,5 l RNase-Inhibitoren, 1 L T7-RNA-Polymerasen, 1 g PCR-Produkt und RNase-freies Wasser. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz. 2 h bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 2 L RNase-freie DNase I hinzu. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz. 15 min bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 2 L 0,2 M EDTA (pH 8,0) hinzu. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und Zentrifugen kurz.</li>
		<li>Fügen Sie der obigen Reaktion 2,5 l 4 M LiCl und 75 l vorgekühltes Ethanol hinzu. Gut mischen. 30 min bei -70 °C lassen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C. Decant das Ethanol. 1 ml vorgekühltes 70% Ethanol (v/v) hinzufügen und den Niederschlag durch sanftes Mischen waschen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 12.000 x g für 5 min bei 4 °C. Das 70% Ethanol dekantieren und den Niederschlag kurz in der Nähe einer Alkohollampe trocknen. Lösen Sie den Niederschlag auf, indem Sie 30 l RNase-freies Wasser hinzufügen und sanft mischen.</li>
		<li>Laden Sie 2 l synthetisierte RNA auf ein 1% Agarose-Gel. Führen Sie das Agarose-Gel bei 180 V für 5-10 min in 0.5x TBE. Messen Sie die Konzentration der beschrifteten RNA mit einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm.<ol>
<li>Verwenden Sie RNase-freie Mikrofugenrohre und Filterspitzen, um eine RNase-Kontamination zu vermeiden. HINWEIS: (Pausepunkt) Die mit Digoxygenin beschrifteten Sonden können mehrere Monate bei -70 °C gelagert werden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coelomic Flüssigkeitssammlung
<ol><li>Fixieren Sie den S. nudus auf dem Seziertisch mit Stiften. Öffnen Sie den Körper des S. nudus mit einer kleinen autoklaven Schere. Isolieren Sie die coelomische Flüssigkeit mit einer Pipette.</li>
	<li>Sammeln und übertragen Sie 1 ml coelomische Flüssigkeit mit einer Pipette auf poly-D-Lysin behandelte Mikroskopschlitten. Tragen Sie die coelomische Flüssigkeit gleichmäßig mit einer Pipettenspitze auf. Die Schlitten 1 h bei 37 °C lufttrocknen.</li>
</ol>3. In-situ-Hybridisierung
<ol><li>Tag 1<ol>
<li>Rehydrieren Sie die Dias in einem Dia-Färbeglas mit 100 ml 1x diethylpyrocarbonat behandelter Phosphat gepufferter Saline (DEPC-PBS). 3 mal mit 1x DEPC-PBS rehydrieren, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.</li>
		<li>Permeabilisieren Sie den Abstrich von coelomischer Flüssigkeit durch Verdauung mit 10 g/mL-Proteinase K bei Raumtemperatur für 5 min. Inkubieren Sie die Dias in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min, um die Verdauung zu stoppen. Waschen Sie die Dias in 1x DEPC-PBS mit sanfter Rührung für 5 min 3 mal.</li>
		<li>Fügen Sie 50 l Hybridisierungsmix (HM) mit der Sense/Antisense-Riboprobe auf den Dias hinzu und fügen Sie einen Deckbedeckungsschlupf hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie den Nasskastenpuffer in die Nassbox ein. Die Dias in die Nassbox stecken und mit Paraffinfolie gut versiegeln. Über Nacht (mindestens 16 h) bei 60 °C hybridisieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tag 2<ol>
<li>Den Waschpuffer bei 65 °C vorheizen. Tauchen Sie die Folie in das Gleitfärbeglasmitglas ein, das den Waschpuffer enthält, und lassen Sie ihn stehen, bis der Deckelrutsch automatisch abrutscht. Es dauert ca. 5 min.</li>
		<li>2 Mal mit Waschpuffer bei 65 °C waschen, 30 min pro Waschgang mit sanfter Rührung. 2 Mal mit 0,2x Saline-Natriumcitrat (SSC) bei 65 °C waschen, 30 min pro Wäsche mit sanfter Rührung. 2 Mal mit Maleinsäurepuffer mit Tween 20 (MABT) bei Raumtemperatur waschen, 30 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur für 3-4 h im Sperrpuffer. Inkubieren Sie die Dias in 1 ml Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmentlösung bei 1/5000 mit dem Sperrpuffer bei 4 °C über Nacht verdünnt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tag 3<ol>
<li>Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Dias kurz in MABT. 4 Mal mit MABT bei Raumtemperatur waschen, 25 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Dias mit alkalischen Phosphatasepuffer bei Raumtemperatur 3 mal, 5 min pro Wäsche. Entfernen Sie den alkalischen Phosphatasepuffer und fügen Sie 1 ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat (BCIP)/Nitroblautetrazolium (NBT) Färbelösung hinzu. Halten Sie die Dias im Dunkeln.</li>
		<li>Beobachten Sie die Farbreaktion periodisch unter einem optischen Mikroskop. Wenn die Farbe vollständig entwickelt ist (Reaktionszeit im Bereich von 1-4 h), waschen Sie die Dias 2 mal mit MABT bei Raumtemperatur, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung.</li>
		<li>2 Mal mit Stop-Lösung bei Raumtemperatur waschen, 15 min pro Waschgang mit sanfter Rührung. Inkubieren Sie die Dias in Methanol, um überschüssige Flecken zu entfernen, bei Raumtemperatur für 30 min. Je nach Hintergrundfarbe kann die Methanolwäsche 2 oder 3 Mal durchgeführt und die Entfärbungszeit verlängert werden.</li>
		<li>2 Mal mit MABT bei Raumtemperatur waschen, 5 min pro Wäsche mit sanfter Rührung. Übertragen Sie die Dias auf ein frisches Filterpapier. Fügen Sie 50 l Glycerin hinzu. Fügen Sie die Abdeckungen hinzu und beobachten Sie mikroskopisch. HINWEIS: Die Lösungszusammensetzung ist in Tabelle 2dargestellt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tsai, C. J., Harding, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization.</a> Methods in Cell Biology. 113, 339-359 (2013).</li>
<li>Koshiba-Takeuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+and+section+in+situ+hybridization+in+mouse+embryos+for+detecting+mRNA+expression+and+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Whole-mount and section in situ hybridization in mouse embryos for detecting mRNA expression and localization.</a> Methods in Cell Biology. 1752, 123-131 (2018).</li>
<li>Wu, J., Feng, J. Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+on+mouse+paraffin+sections+using+DIG-labeled+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization on mouse paraffin sections using DIG-labeled RNA probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1922, 163-171 (2019).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+in+situ+hybridization+on+whole-mount+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo.</a> Nature Protocols. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+in+situ+hybridization+for+Astyanax+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Wholemount in situ hybridization for Astyanax embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), (2019).</li>
<li>Abler, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+throughput+in+situ+hybridization+method+to+characterize+mRNA+expression+patterns+in+the+fetal+mouse+lower+urogenital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A high throughput in situ hybridization method to characterize mRNA expression patterns in the fetal mouse lower urogenital tract.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), (2011).</li>
<li>Du, X., Chen, Z., Deng, Y., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+genetic+diversity+and+population+structure+of+Sipunculus+nudus+as+revealed+by+mitochondrial+COI+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of genetic diversity and population structure of Sipunculus nudus as revealed by mitochondrial COI sequences.</a> Biochemical Genetics. 47, 884(2009).</li>
<li>Lemer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluating+the+phylogeny+of+Sipuncula+through+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Phylogenetics+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Re-evaluating the phylogeny of Sipuncula through transcriptomics.</a> Molecular Phylogenetics and Evolution. 83, 174-183 (2015).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioprotective+effects+of+Sipunculus+nudus+L.+polysaccharide+combined+with+WR-2721%2C+rhIL-11+and+rhG-CSF+on+radiation-injured+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Radioprotective effects of Sipunculus nudus L. polysaccharide combined with WR-2721, rhIL-11 and rhG-CSF on radiation-injured mice.</a> Journal of Radiation Research. 56, 515-522 (2015).</li>
<li>Zhang, C. X., Dai, Z. R., Cai, Q. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+anti-nociceptive+activities+of+Sipunculus+nudus+L.+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and anti-nociceptive activities of Sipunculus nudus L. extract.</a> Journal of Ethnopharmacology. 137, 1177-1182 (2011).</li>
<li>Ying, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+coelomocytes+in+the+sipunculid+Phascolosoma+esculenta%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">The fine structure of coelomocytes in the sipunculid Phascolosoma esculenta.</a> Micron. 41, 71-78 (2010).</li>
<li>Raymond, C. S., Murphy, M. W., O'Sullivan, M. G., Bardwell, V. J., Zarkower, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt1%2C+a+gene+related+to+worm+and+fly+sexual+regulators%2C+is+required+for+mammalian+testis+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dmrt1, a gene related to worm and fly sexual regulators, is required for mammalian testis differentiation.</a> Genes & Development. 14, 2587-2595 (2000).</li>
<li>Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dmrt+genes+in+the+development+and+evolution+of+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Dmrt genes in the development and evolution of sexual dimorphism.</a> Trends in Genetics. 28, 175-184 (2012).</li>
<li>Wu, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+dmrt1+is+involved+in+the+sexual+fate+of+the+ovotestis+in+the+protandrous+black+porgy%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Testicular dmrt1 is involved in the sexual fate of the ovotestis in the protandrous black porgy.</a> Biology of Reproduction. 86, 41(2012).</li>
<li>Li, W. H., Wu, Y. Q., Ma, G. X., Yuan, M. R., Xu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+analysis+of+peanut+worms+transcription+factor+dmrt1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Hydrobiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression analysis of peanut worms transcription factor dmrt1.</a> Acta Hydrobiologica Sinica. 43, 1210-1215 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).</li>
<li>Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361(1993).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Frühere Studien zeigten, dass ISH zum Nachweis mehrerer Ziel-RNAs16,17,18geeignet ist. In diesem Protokoll haben wir eine hochauflösende ISH-Methode beschrieben, um die mRNA in coelomischer Flüssigkeit zu detektieren und die optimierten Hybridisierungsbedingungen in Sipunculus nudus hervorzuheben. Die offensichtlichen Signale von dmrt1, die wir beobachteten, zeigten die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls ...

Die ISH ist mit Hilfe einer markierten Nukleinsäuresonde, um die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz von Interesse zu erkennen, eine nützliche Methode, um das räumliche Expressionsmuster von Zielgenen in morphologisch konservierten Geweben1,2,3zu beschreiben. Normalerweise wird die Zielsequenz durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt und dann als Vorlage zur Synthese der antisense/sense RNA-Sonde mit Digoxigenin-Uridin-5'-Triphosphat verwendet. Die Proben werden vor der Inkubation mit Riboprobe fixiert und permeabilisiert. Nach dem Abwaschen der überschüssigen Sonde wird die Hybridisierung durch Immunhistochemie mit einem Anti-Digoxygenin-Antikörper visualisiert, der alkalische Phosphatase-konjugierte3,4,5,6ist.
Sipunculus nudus (Phylum Sipuncula; Ordnung Sipunculida: Sipunculidae) ist ein unsegmentierter, koeloatischer und bilateral symmetrischer Meereswurm7,8. Sipunculus nudus ist eine kosmopolitische Art, die in tropischen und gemäßigten Küstengewässern verbreitet ist. Es ist auch eine wichtige Meeresfischerei Ressource in Südchina wegen seiner hohen Nährwert und medizinische Werte9,10. Sipunculus nudus in der Molekularbiologie steckt jedoch noch in den Kinderschuhen. Um die biologische Rolle von Genen vollständig zu verstehen, ist die Untersuchung von Genexpressionsmustern bei einer zellulären Auflösung von großem Interesse. Im Nichtmodellorganismus Sipunculus nudusist die ISH-Methode, die eine ideale Methode zum Nachweis der Genexpressionsmuster ist, noch nicht etabliert. Seine koelomische Flüssigkeit enthält mehrere Zelltypen, einschließlich Granulozyten, Urnenzellen, vesikuläre Zellen, Keimzellen, Erythrozyten, etc11. Der Doppelsex/mab-3-bezogene Transkriptionsfaktor-1 (dmrt1), der als repräsentatives Gen bei dieser Methode verwendet wird, ist ein hochkonservierter Transkriptionsregulator für die Geschlechtsbestimmung und -differenzierung bei den meisten Arten, die von Wirbellosen bis zu Säugetieren reichen12,13. In einer Reihe von Arten (z. B. schwarze Porgie, etc.) 14, dmrt1 wurde in den Sertoli-Zellen ausgedrückt, die die Keimzellen umgeben, deren Funktion den Trophoblastenzellen von Sipunculus nudusähnelt. Daher vermuteten wir, dass dmrt1 von Sipunculus nudus in Trophoblastenzellen von Spermatozeugmata exprimiert wird, und das Ergebnis der ISH-Methode bestätigte eindeutig die Hypothese.
Dieses Protokoll beschreibt zum ersten Mal die ISH mit digoxigenin-markierten Antisense/Sense mRNA-Sonden, um mRNA-Expressionsmuster in ihrem coelomischen Flüssigkeitsabstrich zu bestimmen. Es werden optimale Reaktionsbedingungen bereitgestellt, die eine sehr empfindliche Visualisierung der mRNA-Expression bei hoher Auflösung ermöglichen. Die entwickelte ISH-Methode könnte möglicherweise bei mehr Sipunculida-Arten außer Sipunculus nudus angewendet werden.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Biowest</td><td>111860</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP Fab-Fragmente</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT alkalische Phosphatase Farbentwicklungskit</td><td>Beyotime</td><td>C3206</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserum Albumin</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co.</td> KG<td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure-Trinatrium-Sinopharm-Chemikalienreagenz Co.</td><td></td><td>03.04.6132</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Beyotime</td><td>FCGF60</td><td></td></tr><tr><td>Deionisiertes Formamid</td><td>Amresco</td><td>07.12.1975</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonat, DEPC</td><td>Sigma</td><td>D5758</td><td>Schädliche Substanz</td></tr><tr><td>Digoxigenin (DIG) RNA-Markierungsmischung</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNase-freies</td><td>Invitrogen</td><td>18047019</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophorese Gel Imaging</td><td>Bio-Rad</td><td>Universal Hood III</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co.</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Extraktionskits</td><td>Omega</td><td>D2500</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Elektrophorese-Gerät</td><td>Beijing Liuyi Instrument Factory</td><td>DYY-6C</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co.</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Sigma</td><td>G5417</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>01.08.9041</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co.</td> KG<td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co.</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma</td><td>203637</td><td></td></tr><tr><td>Maleinsäure</td>, <td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co. KG</td><td>110-16-7</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co.</td> KG<td>67-56-1</td><td>Schädliche Substanz</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co.</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co.</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Biofount</td><td>JT0001</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz Co.</td> KG<td>1310-73-2</td><td>Ätzende</td></tr><tr><td>Paraffinfolie</td><td>Bemis Company, Inc.</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, PFA</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Schadstoffe</td></tr><tr><td>PCR Instrument</td><td>Life Technology</td><td>Proflex</td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td>Deli</td><td>16</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf</td><td>plus G</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin behandelte Objektträger</td><td>Liusheng</td><td>VER_A01</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td></td><td></td>SRE0005</tr><tr><td>RNase freies Wasser</td><td>HyClone</td><td>SH30538. 02</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>S. nudus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schafsserum</td><td>Beyotime</td><td>C0265</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Färbeglas</td><td>Beyotime</td><td>FG010</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger Aufbewahrungsbox</td><td>Beyotime</td><td>FBX011</td><td></td></tr><tr><td>Kleine autoklavierte Schere</td><td>Shuanglu</td><td>sku_8330</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>NanoDrop 2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA-Polymerasen</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA-Polymerase-Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10109517001</tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Zhengzhou Große Mauer Wissenschaftlich Industrie</td><td>HH-S2</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ hybridisierung für sipunculus nudus coelomic fluid

In situ Hybridization for Sipunculus nudus Coelomic Fluid

Die In-situ-Hybridisierung (ISH) ist eine sehr informative Technik, um zelluläre Verteilungsmuster bestimmter Gene (z. B. mRNA und ncRNA) in Geweben darzustellen. Der Sipunculid-Wurm Sipunculus nudus ist eine wichtige Fischereiressource, da er hohe nährwert- und medizinische Werte hat. Derzeit steckt die Erforschung der Molekularbiologie von Sipunculus nudus noch in den Kinderschuhen. Der Zweck dieses Artikels ist es, eine empfindliche Methode zur Lokalisierung spezifischer mRNA in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu entwickeln. Das Protokoll enthält detaillierte Schritte der ISH, einschließlich Digoxigenin-markierter Antisense- und Sense-Riboprobe-Vorbereitung, coelomischer Flüssigkeitssammlung und Abschnittsvorbereitung, spezifischer Riboprobe-Hybridisierung, Antikörperinkubation, Färbung und Nachfärbungsbehandlungen. Die repräsentativen Ergebnisse eines erfolgreichen Experiments mit dieser Methode werden demonstriert. Das Protokoll sollte auch für andere Sipuncula-Arten gelten.

Abbildung 1ist eine Zusammenfassung der Schritte der ISH dargestellt. Antisense und entsprechende Sense-Ribosonden für dmrt1 wurden aus PCR-Produkten synthetisiert, die aus der coelomischen Flüssigkeit cDNAs verstärkt wurden. Die Echtheit der PCR-Produkte wurde durch direkte Sequenzierung überprüft. Riboprobes wurden mit T7-RNA-Polymerasen nach den Protokollen des Herstellers und einem früheren Bericht4 mit einigen geringfügigen Modifikationen synthetisiert. ...

Dieses Protokoll beschreibt einen effektiven In-situ-Hybridisierungsansatz, um die mRNA-Expressionsniveaus und räumlichen Muster von Zielgenen in Sipunculus nudus coelomic Fluid zu erkennen.

In situ Hybridisierung für Sipunculus nudus Coelomic Fluid

In situ hybridization (ISH) is a very informative technique to present cellular distribution patterns of specific genes (e.g., mRNA and ncRNA) in tissues. ...

In-situ-Hybridisierung ist eine sehr informative Technik, um mRNA- und IncRNA-Expressionsmuster bestimmter Gene in Geweben darzustellen. Unser Ziel in diesem Artikel ist es, eine empfindliche Methode zum Nachweis der spezifischen mRNA-Lokalisierung in koelomischer Flüssigkeit von Sipunculus nudus zu entwickeln, die eine wichtige Fischereiressource ist. Mit dieser Methode haben wir die repräsentativen Ergebnisse unserer erfolgreichen Experimente vorgestellt.Es ist zu hoffen, dass unsere Methode auf andere Sipuncula-Arten angewendet wird, um die Expressionsmuster der spezifischen mRNA und IncRNA in koelomischer Flüssigkeit zu identifizieren. Fixieren Sie den Sipunculus nudus auf dem Seziertisch. Öffnen Sie den Körper des Sipunculus nudus mit einer kleinen autoklaven Schere.Dann sammeln und übertragen Sie die coelomische Flüssigkeit mit Pipette auf Poly-D-Lysin behandelt Mikroskop-Dias, leicht verteilt. Die Rutschen werden eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius lufttrocken getrocknet. Waschen Sie die Dias mit DEPC-PBS dreimal, fünf Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung.Die PBS abtropfen lassen, die Proteinase-K-Lösung bei Raumtemperatur fünf Minuten lang auf die Dias geben. Die Proteinase-K-Lösung abtropfen lassen. Fügen Sie die PFA-Lösung 20 Minuten bei Raumtemperatur auf die Dias.Entleeren Sie die PFA-Lösung. Waschen Sie die Dias mit DEPC-PBS dreimal, fünf Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung. Entleeren Sie die PBS.50 Mikroliter Riboprobe hinzufügen. Fügen Sie einen Coverslip hinzu. Die Dias in die Nassbox stecken und mit Paraffinfolie gut versiegeln.Hybridisieren Sie über Nacht bei 60 Grad Celsius. Tauchen Sie die Dias in den Waschpuffer ein und lassen Sie ihn stehen, bis der Deckelrutsch automatisch abrutscht. Waschen Sie die Dias mit dem vorgeheizten Waschpuffer zweimal bei 65 Grad Celsius, 30 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung.Waschen Sie die Dias mit der vorgeheizten SSC-Lösung zweimal bei 65 Grad Celsius, 30 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung. Waschen Sie die Dias mit der MABT-Lösung zweimal bei Raumtemperatur. 30 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung.Entleeren Sie den MABT. Fügen Sie den Blockierungspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Dias bei Raumtemperatur für drei bis vier Stunden.Entleeren Sie den Sperrpuffer. Fügen Sie den Antikörper hinzu, inkubieren Sie die Dias bei vier Grad Celsius über Nacht. Entleeren Sie die Antikörperlösung.Waschen Sie die Dias mit der MABT-Lösung viermal, 25 Minuten pro Wäsche mit sanfter Rührung. Entleeren Sie den MABT. Fügen Sie den alkalischen Phosphatasepuffer dreimal, fünf Minuten pro Inkubation hinzu.Entfernen Sie den alkalischen Phosphatasepuffer. Fügen Sie die BCIP-NBT-Färbelösung hinzu. Halten Sie die Dias im Dunkeln.Die Färbezeit variiert von Minuten bis Stunden, auch über Nacht, was von der Signalintensität abhängt. Der Färbezustand sollte zu Beginn der Färbung häufiger überprüft werden. Zum Beispiel mit einem Intervall von mehreren Minuten und spätestens mit mehreren Stunden der Färbung.Die Prüfzeit sollte so kurz wie möglich sein, um ein hohes Hintergrundsignal aufgrund der Lichteinwirkung zu vermeiden. Die repräsentativen Signale der In-situ-Hybridisierung werden gezeigt. In situ Hybridisierung von Sipunculus nudus coelomic Fluid mit Anti-Sense-Riboprobe, die auf dmrt1 abzielt, zeigt violette Färbung konzentriert in Trophoblast-Zellen der Spermatozeugmata, Abbildung 2A und B.Sense Riboprobe für dmrt1 kein Hybridisierungssignal, Abbildung 2C.Nach dem Anschauen dieses Videos haben Sie ein sehr gutes Verständnis dafür, wie Sie die Expressionsmuster von Ziel-mRNA oder IncRNA in der coelomischen Flüssigkeit von Sipunculus nudus visualisieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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