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Fluoreszierende Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in der Zellwand von Pflanzengeweben

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DOI:

10.3791/61034

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27. Februar 2021

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1Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências da Universidade do Porto, 2Laboratório Associado para a Química Verde, 3Dipartimento di Bioscienze, Universitá degli Studi di Milano

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie das Pflanzenmaterial für die Immunlokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen fixiert, in ein hydrophiles Acrylharz eingebettet, geschnitten und auf Glasrutschen montiert ist. Wir zeigen, dass zellwandbezogene Epitope mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen werden.

Zusammenfassung

Die Pflanzenentwicklung beinhaltet ständige Anpassungen der Zellwandzusammensetzung und -struktur als Reaktion auf innere und äußere Reize. Zellwände bestehen aus Zellulose und nicht-zellulosehaltigen Polysacchariden zusammen mit Proteinen, Phenolverbindungen und Wasser. 90% der Zellwand besteht aus Polysacchariden (z.B. Pektine) und Arabinogalactan-Proteinen (AGPs). Die fluoreszierende Immunlokalisierung spezifischer Glykanepitope in pflanzenhistologischen Abschnitten bleibt ein Schlüsselwerkzeug, um die Umgestaltung von Wandpolysaccharidnetzwerken, -strukturen und -komponenten aufzudecken.

Hier berichten wir über ein optimiertes fluoreszierendes Immunlokalisierungsverfahren zum Nachweis von Glykanepitopen aus AGPs und Pektinen in Pflanzengeweben. Paraformaldehyd/Glutaraldehyd-Fixierung wurde zusammen mit DER LR-White Einbettung der Pflanzenproben verwendet, was eine bessere Erhaltung der Gewebestruktur und -zusammensetzung ermöglicht. Dünne Abschnitte der mit einem Ultramikrotom erhaltenen eingebetteten Proben wurden zur Immunlokalisierung mit spezifischen Antikörpern verwendet. Diese Technik bietet eine großartige Auflösung, hohe Spezifität und die Möglichkeit, mehrere glykanische Epitope in der gleichen Probe zu erkennen. Diese Technik ermöglicht die subzelluläre Lokalisierung von Glykanen und erkennt deren Akkumulation in der Zellwand. Es ermöglicht auch die Bestimmung von räumlich-zeitlichen Mustern der AGP- und Pektinverteilung während entwicklungsischer Prozesse. Die Verwendung dieses Werkzeugs kann letztlich Forschungsrichtungen leiten und Glykane mit bestimmten Funktionen in Pflanzen verknüpfen. Darüber hinaus können die erhaltenen Informationen biochemische und Genexpressionsstudien ergänzen.

Einleitung

Pflanzenzellwände sind komplexe Strukturen, die aus Polysacchariden und Glykoproteinen bestehen. Zellwände sind extrem dynamische Strukturen, deren Architektur, Organisation und Zusammensetzung je nach Zelltyp, Lokalisierung, Entwicklungsstadium, äußeren und inneren Reizen variieren1. Arabinogalactan Proteine (AGPs) und Pektine sind wichtige Bestandteile der Pflanzenzellwand. AGPs sind hochglykosylierte Proteine und Pektine sind homogalacturonanpolysaccharide, deren Zusammensetzung, Menge und Struktur in verschiedenen Pflanzenentwicklungsstadien stark variieren2,3,4. AGPs und Pektinstudien haben ihre Beteiligung an mehreren Pflanzenprozessen wie programmiertem Zelltod, Reaktion auf abiotische Belastungen, sexuelle Pflanzenreproduktion, unter vielen anderen5gezeigt. Die meisten dieser Studien begannen mit Informationen aus Immunlokalisierungsstudien.

Angesichts seiner Komplexität erfordert das Studium von Zellwänden viele verschiedene Werkzeuge. Der Nachweis von Glykinepitopen mit monoklonalen Antikörpern (mAbs) ist ein wertvoller Ansatz, um die Verteilung von Polysaccharid und Glykoprotein entlang dieser Struktur aufzulösen. Es gibt eine große Sammlung von mAbs zur Verfügung, um Glyglyan-Epitope zu erkennen und die Spezifität jedes mAb wird kontinuierlich verbessert sowie6. Die hier beschriebene Technik ist auf alle Pflanzenarten anwendbar und ist ein perfektes Werkzeug, um zukünftige Forschungsrichtungen zu leiten, die teurere und komplexere Techniken beinhalten könnten.

Bei dieser Technik werden spezifische Antikörper chemisch mit fluoreszierenden Farbstoffen wie FITC (Fluorescein isothiocyanat), TRITC (Tetramethylrhodamine-5-(und 6)-isothiocyanat) oder mehreren Alexa-Fluorfarbstoffen konjugiert. Die Immunfluoreszenz bietet mehrere Vorteile, die eine klare und schnelle subzelluläre Lokalisation von Glykanen ermöglichen, die direkt unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden können. Es ist sehr spezifisch und empfindlich, da die Herstellung der Probe effektiv die natürliche Struktur des Antigens schützen kann, auch wenn es in geringeren Mengen vorhanden ist. Es ermöglicht die Detektion von mehreren Antigenen in der gleichen Probe und am wichtigsten, bietet hohe Qualität und visuell schöne Ergebnisse. Trotz der großen Macht, die Fluoreszenz-Immunlokalisierungsstudien bieten, werden sie oft als schwierig durchzuführen und umzusetzen angesehen, höchstwahrscheinlich aufgrund des Fehlens detaillierter Protokolle, die die Visualisierung der verschiedenen Schritte des Verfahrens ermöglichen. Hier bieten wir einige einfache Richtlinien, wie diese Technik durchgeführt werden und wie man qualitativ hochwertige Bilder erhält.

Für das hier vorgestellte Protokoll müssen Die Proben zunächst mit dem am besten geeigneten Fixierungsprotokoll fixiert und eingebettet werden. Obwohl als zeitaufwändige und relativ mühsame Technik betrachtet, ist die richtige Fixierung und Einbettung der Pflanzenprobe der Schlüssel, um einen erfolgreichen Immunlokalisierungstest zu gewährleisten. Zu diesem Zweck ist die üblichste chemische Fixierung mit vernetzungsfixativen, wie Aldehyden. Vernetzungsfixative stellen chemische Bindungen zwischen Gewebemolekülen her, stabilisieren und verhärten die Probe. Formaldehyd und Glutaraldehyd sind vernetzungsfixative, und manchmal wird eine Mischung aus beiden Fixativen verwendet7. Formaldehyd bietet eine große strukturelle Konservierung von Geweben und über einen längeren Zeitraum, produziert kleine Geweberückzüge und ist mit der Immunfärbung kompatibel. Glutaraldehyd ist ein stärkeres und stabiles Fixativ, das in der Regel in Kombination mit Formaldehyd verwendet wird. Die Verwendung von Glutaraldehyd hat einige Nachteile, die berücksichtigt werden müssen, da es einige freie Aldehydgruppen in das feste Gewebe einführt, was zu einer unspezifischen Kennzeichnung führen kann. Auch die Vernetzung zwischen Proteinen und anderen Molekülen kann gelegentlich dazu führen, dass einige Zielepitope für die Antikörper unzugänglich werden. Um dies zu vermeiden, müssen Menge und Dauer der Fixierung sorgfältig definiert werden.

Nach der Fixierung werden die Proben in das richtige Harz eingebettet, um vor dem Erhalt der Abschnitte zu härten. London Resin (LR-White) Acrylharz ist das Harz der Wahl für Immunlokalisierungsstudien. Im Gegensatz zu anderen Harzen ist LR-White hydrophil, so dass die Antikörper ihre Antigene erreichen können, ohne dass eine Behandlung erforderlich ist, um es zu erleichtern. LR-White hat auch den Vorteil, eine geringe Autofluoreszenz zu bieten, was eine Reduzierung von Hintergrundgeräuschen während der Immunfluoreszenz-Bildgebung ermöglicht.

Es gibt viele Färbetechniken zur Verfügung, um verschiedene Komponenten der Zellwand zu erkennen, wie Alcian blaue Färbung, Toluidin blau Färbung oder Periodische Säure-Schiff (PAS) Färbung. Keines davon bietet die Kraft der Immunlokalisierungsanalysen8. Dieser Ansatz gibt eine größere Spezifität bei der Detektion von Glykanen und bietet umfangreichere Informationen über die Zusammensetzung und Struktur der Zellwand.

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Protokoll

1. Probenvorbereitung: Fixierung, Dehydrierung und LR-White-Einbettung

  1. Fixierung und Austrocknung
    HINWEIS: Der Fixierungsprozess ist wichtig, um die Probe zu erhalten. durch Vernetzung von Molekülen wird der Zellstoffwechsel gestoppt, wodurch die zelluläre Integrität gewährleistet und die molekulare Diffusion verhindert wird. Fixiermittel und die verwendete Konzentration müssen auf diesen Zweck angepasst werden, so dass die Antigene ausreichend exponiert sind, um mit den Antikörpern zu interagieren. Das folgende Protokoll kombiniert die milde fixative Fähigkeit von Paraformaldehyd mit der stärkeren Wirkung von Glutaraldehyd. Ihre Proportionen wurden für AGPs und Zellwandkomponenten optimiert, eignen sich aber auch für andere Proteine und Zellstrukturen. Der anschließende Dehydrierungsprozess bereitet die Proben für die LR-White Einbettung vor. In diesem Experiment wurden Pflanzengewebe verschiedener Pflanzenarten verwendet. Quercus suber Proben wurden von Bäumen gesammelt, die auf dem Feld angebaut wurden. Trithuria Tauchproben wurden freundlicherweise von Paula Rudall (Kew Gardens, London, UK) mit uns geteilt.
    1. Säen Sie alle Arabidopsis-Pflanzen direkt auf dem Boden und wachsen Sie in einer Indoor-Wachstumsanlage mit 60% relativer Luftfeuchtigkeit und einem Tag-Nacht-Zyklus von 16 h Licht bei 21 °C und 8 h Dunkelheit bei 18 °C. Wählen Sie die zu analysierenden Pflanzengewebe aus, und trimmen Sie die Proben, die nicht mehr als 16 mm2 groß sind.
    2. Die Probe sofort in eine Glasdurchstechflasche übertragen, die zuvor mit genügend kaltfixativer Lösung (2% Formaldehyd (w/v), 2,5% Glutaraldehyd (w/v), 25 mM PIPES pH 7 und 0,001% Tween-20 (v/v)) gefüllt war, um die Proben vollständig unterWasser zu setzen (Abbildung 1A).
      VORSICHT: Formaldehyd und Glutaraldehyd sind fixative Wirkstoffe, die durch Einatmen und Kontakt schädlich sein können. Führen Sie den Fixierungsschritt auf einer Dunstabzugshaube durch und tragen Sie angemessene Schutzkleidung und Nitrilhandschuhe. Alle Lösungen ab diesem Schritt, einschließlich Alkoholserien bis 70 %, sollten für eine spätere Dekontamination durch fachkundige Mitarbeiter gelagert werden.
    3. Nachdem Sie alle Proben gesammelt haben, aktualisieren Sie das Fixativ.
    4. Übertragen Sie die Durchstechflaschen in eine Vakuumkammer, und wenden Sie langsam Vakuum auf. Bei Erreichen von -60 kPa beginnt das schwimmende Material auf den Boden der Durchstechflasche zu sinken (Abbildung 1B).
    5. Unter einem Vakuum von nicht mehr als -80 kPa für 2 h bei Raumtemperatur aufbewahren.
    6. Lösen Sie das Vakuum langsam los, versiegeln Sie die Glasdurchstechflasche und legen Sie sie über Nacht bei 4 °C ab.
    7. Verwerfen Sie alle Proben, die während der nächtlichen Fixierung nicht versanken. Waschen Sie die restlichen Proben mit 25 mM PBS pH 7 für 10 min, gefolgt von einer 20 min Waschen in 25 mM PIPES Puffer pH 7.2.
    8. Dehydrieren Sie die Proben in einer Ethanolserie (25%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90% und 3x 100% Ethanol) für jeweils 20 min. Übertragen Sie die dehydrierten Proben sofort auf beschriftete Glasfläschchen zum Einbetten (Abbildung 1C).
      HINWEIS: Der Dehydrierungsprozess kann bei 70% Ethanol-Schritt angehalten werden.
  2. LR-White Harzeinbettung
    HINWEIS: LR-white ist ein nicht hydrophobes Acrylharz mit geringer Viskosität, was es ideal für das Eindringen von Geweben mit vielen dicken Zellwandschichten macht. LR-White kommt auch in mehreren Härtegraden, die für das Schneiden der meisten Pflanzenproben kompatibel sind. Bitte stellen Sie sicher, dass das verwendete Harz bereits mit dem richtigen Katalysator geliefert wird, oder befolgen Sie die Anweisungen des Lieferanten, um das Harz vorzubereiten. Der folgende Einbettungsprozess ist langsam, aber die Ergebnisse rechtfertigen die Mittel erheblich.
    1. Durchtrände die Proben durch Inkubation mit dem LR-Weißharz in einer Reihe von Halbmondkonzentrationen von Harz (1:3, 2:3, 1:1, 3:2, 3:1, 1:0) in Ethanol, in jedem Schritt für 24 h bei 4 °C inkubierend.
      VORSICHT: LR-White Harz ist ein Acrylharz mit geringer Toxizität; es kann jedoch durch Kontakt und Einatmen ein Reizmittel für die Haut sein. Arbeiten in einem gut belüfteten Bereich oder unter einer Dunstabzugshaube mit entsprechendem Schutzund und Nitrilhandschuhen ist sehr zu empfehlen.
    2. Das LR-weiße Harz erfrischen und zusätzlich 12 h bei 4 °C brüten.
    3. Bereiten Sie geeignete Einbettungskapseln (Größe 1 (0,5 ml) für Proben bis 3 mm, 2 x 0,37 ml für Proben bis 5 mm oder 3 x 0,3 ml für Proben bis 8 mm und Papieretiketten(Abbildung 1D)vor.
      HINWEIS: Wählen Sie die Kapselgröße aus, die etwas größer als die Probe sein soll, damit die Probe vollständig in das Harz eingeschlossen werden kann. Denken Sie auch daran, die Tags mit einem Bleistift zu beschriften, da Stift oder gedruckte Tinten das Harz verunreinigen und die Probe ruinieren.
    4. Tragen Sie einen Tropfen frisches LR-weißes Harz auf den Boden jeder Kapsel auf.
    5. Legen Sie eine Probe in jede Gelatinekapsel und füllen Sie bis zur maximalen Kapazität mit frischem Harz. Legen Sie die Kapselkappe und drücken Sie vorsichtig, um eine hermetische Dichtung zu bilden (Abbildung 1E).
    6. Polymerisieren Sie das Harz für 24 bis 48 h bei 58 °C oder bis vollständig gehärtet.
    7. Proben bei Raumtemperatur lagern.
      HINWEIS: Nach der Polymerisation LR-weiß Harz ist inert.

2. Folienvorbereitung

HINWEIS: Glasschlitten müssen sauber und frei von Staub, Fett oder anderen Verunreinigungen sein. Auch neue Rutschen müssen gereinigt werden, da einige Lieferanten Öle und Reinigungsmittel verwenden, um zu verhindern, dass die Rutschen zusammenkleben. Jedes Fett oder Reinigungsmittel stört die Sektionshaftung am Schlitten, auch wenn es mit Poly-L-Lysin behandelt wird. Lint und Staub werden die Beobachtungen der Probe beeinflussen und das Experiment sehr wahrscheinlich ruinieren. Teflonbeschichtete Dias mit Reaktionsbrunnen sind perfekt für diese Aufgabe. Sie sind erschwinglich, wiederverwendbar und reduzieren die benötigte Antikörperlösung drastisch. Mit der richtigen Reinigung kann eine fluoreszierende Immunlokalisierung von hervorragender Qualität zu einem sehr erschwinglichen Preis durchgeführt werden.

  1. Rutschenwaschen
    1. Die Dias in ein Färbegestell legen und mit Reinigungslösung (0,1% SDS (w/v), 1% Essigsäure (v/v), 10% Ethanol (v/v)) abdecken.
    2. Halten Sie eine leichte Aufregung für 20 min.
    3. Die Färbestangen 10 min in ein ddH2O Bad mit leichter Rührung geben. Wiederholen Sie dies 4 Mal.
    4. Die Regale vor dem kurz eintauchen den Rack vorsichtig abtropfen lassen und die Dias in einer staubfreien Umgebung trocknen lassen.
    5. Speichern, bis sie verwendet werden.
  2. Poly-L-Lysin-Beschichtung (optional)
    HINWEIS: Kleine Abschnitte kleben in der Regel sehr gut, um Glasschlitten zu reinigen. Dieser Schritt ist nur für größere Abschnitte empfehlenswert (>2 mm2). Größere Abschnitte neigen dazu, falten und Falten, und sind nicht ratsam. Dennoch, bei Bedarf verwenden Reaktionsschlitten mit größeren Löchern. Reinigen Sie sie wie oben und gehen Sie wie folgt vor.
    1. Legen Sie saubere Dias in eine quadratische Petrischale. Pipette 0.001% Poly-L-Lysin Lösung (w/v) um die Löcher der Dias zu decken, ohne zu überlaufen.
    2. Lassen Sie die Rutschen über Nacht bei 40 °C in geschlossenen Petrischalen trocknen.
      HINWEIS: Die beschichteten Schlitten sind sofort einsatzbereit und können mehrere Monate lang in einer staubfreien Umgebung bei Raumtemperatur gelagert werden.

3. Probenverschnitt und -schnitt

  1. Probenverkürzung
    1. Mit einer scharfen Rasierklinge, trimmen Sie die LR-White Blöcke unter einem Stereomikroskop, um eine pyramidenförmige Struktur zu bilden, wo die Spitze senkrecht zum Interessenbereich der Probe ist (Ergänzungsfigur 1A).
      HINWEIS: Der Ultramikrotom-Probenhalter ist ein ausgezeichnetes Werkzeug, um den Block zu sichern. Wenn das Gerät keinen universellen Probenhalter hat, verwenden Sie den für runde Blöcke am besten geeigneten.
    2. Trimmen Sie die pyramidenförmige Struktur, indem Sie feine Scheiben des überschüssigen Harzes senkrecht zur Pyramidenhauptachse entfernen.
    3. Fahren Sie fort, bis die Probe erreicht ist und die Schnittfläche gebildet wird. Innerhalb der Schnittfläche sollte die Zielprobe idealerweise in eine Trapezform eingeschlossen werden.
      HINWEIS: Der Harzblock kann in einem Schlitzwinkel weiter getrimmt werden, um die Schnittoberfläche mit einer scharfen Klinge zu reduzieren (Abbildung 1F).
  2. Halbdünne Schnitte
    HINWEIS: Es wird ein Mikrotom mit Glasmessern verwendet. Die Fähigkeit des Antikörpers, sich an das Epitop zu binden, bedingt den Erfolg der Immunlabeling-Reaktion. Die hydrophile Natur des LR-Whiteharzes ermöglicht einen guten Kontakt der Antikörper mit den Probenabschnitten. Dünnere Abschnitte präsentieren eine schwächere Calcofluor-Färbung, die verwendet wird, um die Abschnitte zu lokalisieren und beim Bildgebungsprozess zu helfen. Dasselbe gilt für andere Flecken, die später aufgetragen werden können. Auch übermäßige Dicke wirkt sich auf die Bildaufnahmequalität aus. Ein guter Kompromiss für die Schnittdicke kann zwischen 200 und 700 nm gefunden werden, abhängig von den Gewebeeigenschaften. Montieren Sie die Blöcke fest am Probenhalter des Ultramikrotomes.
    1. Mit einem Ultramikrotom, machen Schnitte mit einer Dicke zwischen 200 und 700 nm (Abbildung 1G).
    2. Überprüfen Sie den Abschnittsbereich, indem Sie einige Abschnitte auf einen ddH2O-Tropfen auf einer Glasrutsche übertragen. Legen Sie die Rutsche auf eine 50 °C-Kochplatte, bis Wasser verdunstet. Stain, der einen Tropfen von 1% Toluidin Blue O (w/v) in 1% Borsäurelösung (w/v) über die Abschnitte für 30 s legt. Spülen und beobachten Unter dem Mikroskop.
    3. Wenn Sie die gewünschte Struktur finden, übertragen Sie einen oder zwei Abschnitte auf jeden Tropfen ddH2O, der zuvor auf jedem Brunnen eines sauberen Reaktionsschlittens platziert wurde.
    4. Jede Rutsche in eine geschlossene, saubere 10 cm quadratische Petrischale geben und bei 50 °C trocknen lassen.
    5. Speichern Sie Folien in einer sauberen Archivbox, bis sie verwendet werden.

4. Immunlokalisierung

HINWEIS: Das fluoreszierende Immunlokalisierungsverfahren beruht auf der sequenziellen Verwendung von zwei Antikörpern. Der primäre Antikörper wird gegen ein bestimmtes Zielantigen erhoben. Der sekundäre Antikörper wird speziell gegen den primären Antikörper angehoben und für fluoreszierende Techniken zu einem Fluorophor (FITC in diesem spezifischen Protokoll) konjugiert. Der primäre Antikörper wird verwendet, um das Zielantigen in der Probe zu erkennen, und der sekundäre Antikörper wird verwendet, um den Ort zu markieren, an dem der primäre Antikörper, der mit der Probe verbunden ist, nach dem Abwaschen des Überschusses an primärer Antikörper. Kontrollen sind ein wichtiger Teil dieses Testes und müssen immer durchgeführt werden, um die Genauigkeit der Beobachtungen zu gewährleisten. Ein Brunnen auf der Rutsche sollte für die Verwendung als Negativkontrolle reserviert werden, bei der die primäre Antikörperbehandlung übersprungen wird, und daher sollte am Ende des Experiments kein Signal beobachtet werden. Eine positive Kontrolle muss in das Experiment einbezogen werden, indem man gut mit einem Antikörper behandelt wird, dessen Kennzeichnung bereits bekannt und sicher ist. Die Positivkontrolle wird verwendet, um die Wirksamkeit der sekundären Antikörperkennzeichnung und Reaktionsbedingungen zu bestätigen, während die Negativkontrolle die sekundäre Antikörperspezifität testet.

  1. Bereiten Sie eine Inkubationskammer vor, indem Sie einige gedämpfte Papiertücher an der Unterseite einer Pipette-Spitzenbox platzieren und mit Zinnfolie umwickeln (Ergänzungsfigur 1B-1E). Platzieren Sie die Dias in der Inkubationskammer.
  2. Pipette eine 50 l L Tropfen pro 8 mm Gut der Blockierlösung (5% fettfreie Trockenmilch (w/v) in 1 M PBS) und inkubieren für 10 min. Entfernen Sie die Blockierlösung und waschen Sie alle Brunnen zweimal mit PBS für 10 min.
  3. Bereiten Sie die primären Antikörperlösungen vor (siehe Ergänzende Tabelle 1), 1:5 (v/v) Antikörper in der Blockierlösung; eine Schätzung von ca. 40 l pro 8 mm Brunnen vornehmen.
    HINWEIS: Die Konzentration des Antikörpers muss gemäß dem Herstellungsprotokoll angepasst werden.
  4. Führen Sie eine endende Wäsche mit ddH2O für 5 min, lassen Sie die Brunnen nie vollständig trocknen.
  5. Pipette die primäre Antikörperlösung zu den Reaktionsbrunnen. Pipettenblockierlösung für die Steuerbrunnen.
  6. Schließen Sie die Inkubationskammer und lassen Sie 2 h bei Raumtemperatur stehen, gefolgt von einer Übernachtung bei 4 °C. Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung vor, 1% in der Blockierlösung (v/v) ca. 40 l pro Brunnen. Mit Zinnfolie bedeckt halten.
  7. Waschen Sie alle Brunnen zweimal mit PBS für 10 min, gefolgt von 10 zusätzlichen Minuten mit ddH2O. Stellen Sie sicher, dass keine Spur der Blockierlösung oder Ablagerungen auf den Brunnen sichtbar ist.
  8. Pipette die sekundäre Antikörperlösung für alle Brunnen. Schützen Sie die Dias von nun an vor Licht.
  9. Inkubieren Sie für 3-4 h im Dunkeln bei Raumtemperatur.
  10. Waschen Sie alle Brunnen zweimal für 10 min mit PBS gefolgt von einer weiteren Wäsche von 10 min mit ddH2O.
  11. Tragen Sie einen Tropfen Calcofluor (1:10.000 (w/v) fluoreszierender heller 28 in PBS) auf jeden Brunnen auf. Ohne Waschen, einen Tropfen Montagemedium (siehe Materialtabelle) auf jeden Brunnen auftragen und einen Deckzettel platzieren (Abbildung 1H).
  12. Beobachten Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit 10x/0.45, 20x/0.75, 40x/0.95 und 100x/1.40 Linse ausgestattet ist, verwenden Sie UV (für Calcofluor-Färbung) und FITC-Filter, um Zellwand bzw. Immunlokalisierung zu erkennen (Abbildung 1I). Verwenden Sie die folgenden Wellenlängen: Anregung/Emission (nm) 358/461 für UV und 485/530 für FITC.
  13. Für eine bessere Visualisierung der Ergebnisse überlappen sich beide Bilder mit ImageJ oder ähnlichem.

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Ergebnisse

In einem erfolgreichen Experiment wird der sekundäre Antikörper die Position des spezifischen Epitops in hellem Grün in einer konsistenten Weise genau bestimmen, was die Charakterisierung der Zellwandzusammensetzung in einem bestimmten Entwicklungsstadium der Zelle, des Gewebes oder des Organs ermöglicht. Zum Beispiel hat der LM6-Antikörper eine hohe Affinität zu 1,5-Arabinan, einer Verbindung mit Typ-I-Rhamnogalacturonan, die reichlich gefunden werden kann, um die Zellwand des sich entwickelnden Quercus suber A...

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Diskussion

Die hier beschriebene fluoreszierende Immunlokalisierungsmethode in Pflanzen, die zwar nahtlos unkompliziert ist, beruht jedoch auf dem Erfolg mehrerer kleiner Schritte. Die erste davon ist die Probenvorbereitung und -fixierung. In diesem ersten Schritt wird ein Gemisch aus Formaldehyd und Glutaraldehyd verwendet, um die Mehrheit der Zellkomponenten zu vernetzen. Das Formaldehyd in der Lösung sorgt für eine milde und reversible Fixierung, während das Glutaraldehyd eine starke dauerhaftere Verbindung bietet; das Gleichgew...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Unterstützung erhielten die Autoren aus dem EU-Projekt 690946 "SexSeed" (Sexuelle Pflanzenreproduktion – Saatgutbildung), das von H2020-MSCA-RISE-2015 und SeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017 gefördert wird. AMP erhielt ein Stipendium aus dem Projekt MSCA-IF-2016 der Europäischen Union (Nr. 753328). MC erhielt ein Stipendium aus dem FCT PhD-Stipendium SFRH/BD/111781/2015.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
25 % (w/v) Gluteraldehyd-AgarScientificAGR1010aq. Lösung, methanolfrei
8 Vertiefungen Reaktionsobjektträger aus GlasMarinfeldMARI1216750andere Marken können verwendet werden
EssigsäureSigma-AldrichA6283
Anti-Ratten-IgG (Wole-Molekül)-FITC-Antikörper, hergestellt in GOATSigma-AldrichF6258
Deckgläser, 24 mm x 50 mmMarinfeldMARI0100222Das Deckglas sollte alle Vertiefungen abdecken. Andere Marken können verwendet werden 
ddH2Onana Absolutes
Ethanolnana
Fluoreszierender Aufheller 28Sigma-AldrichF-6259
GelatinekapselnAgar wissenschaftlicheAGG29211Die Kapselgröße sollte der Größe der Probe entsprechen.
GlasfläschchennanaEs können alle einfachen, preiswerten Glasfläschchen verwendet werden, die versiegelt werden können. Die Fläschchen können nach Gebrauch mit 96%igem Ethanol gereinigt werden, um LR-White-Rückstände zu entfernen und wiederzuverwenden.
LR-white mittleres, umarmendes HarzAgar Scientific AGR1281LR-White gibt es in verschiedenen Formen; die mittlere Qualität bietet eine angemessene Schnittunterstützung für die meisten Gewebe, während für härtere Gewebe eine härtere Qualität von LR-weiß empfohlen werden kann. Wenn möglich, verwenden Sie ein Harz, das bereits mit dem Polymerisationsaktivator (Benzoylperoxid) vermischt ist, wenn nicht, befolgen Sie bitte die Anweisungen des Lieferanten, um das Harz vorzubereiten.
Fettfreie TrockenmilchNestléJedefettfreie Trockenmilch ist ausreichend
Ofennana generischer Laborofen
Petrischale, 10 cm x 10 cm quadratischnana
PIPESSigma AldrichP1851
Ratte erzeugte monoklonale Antikörper-PflanzensondennaMehrere Antikörper, die Zellwandbestandteile erkennen, sind
sowohl am Complex Carbohydrate Research Center
(CCRC, Georgia University, USA) als auch bei Plant Probes (Paul
Knox Cell Wall Lab an der Leeds University, UK) erhältlich. Eine kurze Liste von
einigen häufig verwendeten MABS und wo sie gekauft werden können
finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1 Rasierklingen
nana normale Rasierklingen
SDSSigma-AldrichL6026
Toluidine Blue-OAgar ScientificAGR1727
Tween 20Sigma-AldrichP9416
UltramikrotomLeica MicrosystemsUC7
Aufstehendes Epifluoreszenzmikroskop mit UV- und FITC-FluoreszenzfilternLeica MycrosistemsDMLb
Vakuumkammerfür
Vakuumpumpefür
VectashieldLabsT-1000Es können auch andere Anti-Fade-Mittel verwendet werden. Bitte überprüfen Sie die Kompatibilität mit FITC und dem Fluorescente Brightner 28. (Hinweis: Für eine nicht-kommerzielle Alternative (siehe Jonhson et al. 198218) Ein Anti-Fading-Medium kann hergestellt werden, indem 25 mg/ml 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octan (DABCO) in 9:1 (v/v) Glycerin mit 1xPBS gemischt werden. Stellen Sie den pH-Wert mit verdünntem HCl auf 8,6 ein.)

Referenzen

  1. Keegstra, K. Plant Cell Walls. Plant Physiology. 154 (2), 483-486 (2010).
  2. Pereira, A. M., Lopes, A. L., Coimbra, S. Arabinogalactan Proteins as Interactors along the Crosstalk between the Pollen Tube and the Female Tissues. Frontiers in Plant Science. 7 (7), (2016).
  3. Showalter, A. Arabinogalactan-proteins: structure, expression and function. Cellular and Molecular Life Sciences. 58 (10), 1399-1417 (2001).
  4. Majewska-Sawka, A., Nothnagel, E. The multiple roles of arabinogalactan proteins in plant development. Plant Physiology. 122, 3-9 (2000).
  5. Seifert, G., Roberts, K. The biology of arabinogalactan proteins. Annual Review of Plant Biology. 58, 137-161 (2007).
  6. Ruprecht, C., et al. A Synthetic Glycan Microarray Enables Epitope Mapping of Plant Cell Wall Glycan-Directed Antibodies. Plant Physiology. 175 (3), 1094-1104 (2017).
  7. Verhertbruggen, Y., Walker, J. L., Guillon, F., Scheller, H. V. A Comparative Study of Sample Preparation for Staining and Immunodetection of Plant Cell Walls by Light Microscopy. Frontiers in Plant Science. 29 (8), 1505(2017).
  8. Osborn, M., Weber, K. Immunofluorescence and immunocytochemical procedures with affinity purified antibodies: tubulin containing structures. Methods in Cell Biology. 24, 97-132 (1982).
  9. Coimbra, S., Almeida, J., Junqueira, V., Costa, M., Pereira, L. G. Arabinogalactan proteins as molecular markers in Arabidopsis thaliana sexual reproduction. Journal of Experimental Botany. 58 (15), 4027-4035 (2007).
  10. Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature Protocols. 7 (9), 1716-1727 (2012).
  11. Gane, A., Clarke, A., Bacic, A. Localization and expression of arabinogalactan-proteins in the ovaries of Nicotiana alata Link and Otto. Sex Plant Reproduction. 8, 278-282 (1995).
  12. Coimbra, S., Salema, R. Immunolocalization of arabinogalactan proteins in Amaranthus hypocondriacus L. ovules. Protoplasma. 199 (1-2), 75-82 (1997).
  13. Coimbra, S., Duarte, C. Arabinogalactan proteins may facilitate the movement of pollen tubes from the stigma to the ovules in Actinidia deliciosa and Amaranthus hypocondriacus. Euphytica. 133 (2), 171-178 (2003).
  14. El-Tantawy, A., et al. Arabinogalactan protein profiles and distribution patterns during microspore embryogenesis and pollen development in Brassica napus. Plant Reproduction. 26 (3), 231-243 (2013).
  15. Costa, M., Pereira, A. M., Rudall, P. J., Coimbra, S. Immunolocalization of arabinogalactan proteins (AGPs) in reproductive structures of an early-divergent angiosperm, Trithuria submersa (Hydatellaceae). Annals of Botany. 111 (2), 183-190 (2013).
  16. Costa, M., Sobral, R., Ribeiro Costa, M. M., Amorim, M. I., Coimbra, S. Evaluation of the presence of arabinogalactan proteins and pectins during Quercus suber male gametogenesis. Annals of Botany. 115 (1), 81-92 (2015).
  17. Hibbs, A. R. Fluorescence Immunolabelling. Confocal Microscopy for Biologists. , Springer. Boston, MA. (2004).
  18. Johnson, G. D., et al. Fading of Immunofluorescence during microscopy: A Study of the Phenomenon and its Remedy. Journal of Immunological Methods. 55 (2), 231-242 (1982).
  19. Baird, T. R., Kaufman, D., Brown, M. C. Mercury Free Microscopy: An Opportunity for Core Facility Directors. Journal of Biomolecular Techniques. 25 (2), 48-53 (2014).
  20. Weber, G. F., Menko, A. S. Color image acquisition using a monochrome camera and standard fluorescence filter cubes. BioTechniques. 38 (1), 52-56 (2005).

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