Verwendung der Durchflusszytometrie zum Erkennen und Quantitieren veränderter Blutbildung in den sich entwickelnden Zebrafischen

Zusammenfassung

Dieser Test ist eine einfache Methode, um hämatopoetische Zellen bei der Entwicklung embryonaler Zebrafische zu quantitieren. Blutzellen von dissoziierten Zebrafischen werden einer Durchflusszytometrie-Analyse unterzogen. Dies ermöglicht den Nachweis von Blutdefekten bei mutierten Tieren und nach genetischer Veränderung.

Zusammenfassung

Die Vielfalt der Zelllinien, die reifes Blut bei Wirbeltieren umfassen, ergibt sich aus der Differenzierung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs). Dies ist ein kritischer Prozess, der während der gesamten Lebensdauer von Organismen auftritt, und Störungen der molekularen Bahnen, die während der Embryogenese beteiligt sind, können katastrophale langfristige Folgen haben. Aus einer Vielzahl von Gründen ist Zebrafisch (Danio rerio) zu einem Modellorganismus geworden, um Hämatopoese zu studieren. Zebrafisch-Embryonen entwickeln sich extern, und durch 7 Tage Nachfertilisation (dpf) haben die meisten subtypen der endgültigen Blutzellen produziert, die für ihre Lebensdauer bestehen bleiben. Es wurden Assays zur Bewertung der Anzahl hämatopoetischer Zellen entwickelt, die hauptsächlich spezifische histologische Flecken, In-situ-Hybridisierungstechniken und Mikroskopie von transgenen Tieren verwenden, die blutzellspezifische Promotoren verwenden, die die Expression fluoreszierender Proteine fördern. Die meisten Färbe-Assays und In-situ-Hybridisierungstechniken quantifizieren jedoch nicht genau die Anzahl der vorhandenen Blutzellen; nur große Unterschiede in der Zellenzahl sind leicht zu visualisieren. Die Verwendung transgener Tiere und die Analyse von Personen mit fluoreszierender oder konfokaler Mikroskopie kann durchgeführt werden, aber die Quantifizierung dieser Assays beruht entweder auf der manuellen Zählung oder der Verwendung teurer Bildgebungssoftware, die beide Fehler machen können. Die Entwicklung zusätzlicher Methoden zur Beurteilung der Blutzellzahlen wäre wirtschaftlich, schneller und könnte sogar automatisiert werden, um die Wirkung der CRISPR-vermittelten genetischen Veränderung, der Morpholino-vermittelten Transkriptreduktion und der Wirkung von Wirkstoffverbindungen, die Hämatopoese in großem Maßstab beeinflussen, schnell zu bewerten. Dieser neuartige Test zur Quantifizierung von Blutzellen wird durchgeführt, indem ganze Zebrafischembryonen getrennt und die Menge der fluoreszierend markierten Blutzellen analysiert wird. Diese Assays sollten eine Aufklärung der molekularen Bahnen ermöglichen, die für die Entstehung, Expansion und Regulation von Blutzellen während der Embryogenese verantwortlich sind, was es den Forschern ermöglichen wird, neue Faktoren, die während Blutkrankheiten verändert wurden, sowie Die Wege, die während der Evolution der Wirbeltierhämatopoese wesentlich sind, weiter zu entdecken.

Einleitung

Die Blutproduktion (Hämatopoese) ist ein wesentlicher Entwicklungsprozess, der zuerst im frühen Embryo beginnt. Dieser Prozess beginnt mit der Erzeugung primitiver roter Blutkörperchen und Makrophagen direkt aus dem Mesoderm und verschiebt sich später in Richtung der Produktion von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs). Diese Stammzellen, die multipotent sind, erzeugen alle Sorten von reifen Blutzellen im Organismus. Das System ist in der Lage, sich selbst zu erneuern, und wird durch diese HSPCs kontinuierlich aufgefüllt. Während dieser Prozess früh in der Entwicklung beginnt, Hämatopoese setzt sich für das Leben des Tieres, bietet die Fähigkeit, Sauerstoff zu entfernten Stellen des Körpers zu transportieren, Blutungen nach Verletzungen zu stoppen, und den Körper vor Infektionen zu schützen. Die Entwicklung dieses komplexen Systems wird zeitlich und räumlich während der Entwicklung gesteuert und jegliche Störungen in der Blutzellproduktion können für den Organismus katastrophal sein, was zu Anämie, Thrombozytopenie, Leukopenie und Leukämie führt.

Ein beliebtes Tiermodell für die hämatopoetische Forschung ist der Zebrafisch (Danio rerio), weil sie eine ähnliche Blutentwicklung im Vergleich zum Menschen haben. Tatsächlich werden viele der Gene und molekularen Bahnen, die während der Hämatopoese verwendet werden, während der Gesamten der Wirbeltierentwicklung konserviert, so dass wir durch das Studium von Zebrafischen mehr über menschliche Gene lernen können. Wichtig ist, dass zebrafischische Embryonen außerhalb des Körpers entstehen und innerhalb von 7 Tagen die meisten reifen Blutzelltypen erzeugt haben, was eine direkte Visualisierung des hämatopoetischen Systems in kurzer Zeit ermöglicht. Zebrafische sind auch extrem fecund, was es Forschern ermöglicht, eine größere Anzahl von Proben in einem kurzen Zeitrahmen zu beobachten, was auch für die Generierung reproduzierbarer Daten wichtig ist. Die kurze Erzeugungszeit und die externe Entwicklung des Zebrafisches ermöglicht eine einfachere Manipulation und Beobachtung während der Mutagenesestudien^1,2,3,4,5 und Drogenscreening^6,7,8,9,10. Dies ermöglicht es, eine Gruppe vielversprechender therapeutischer Verbindungen für menschliche Bluterkrankungen schnell und effizient zu testen.

Wichtig ist, dass Zebrafische auch genetisch freundlich sind, und das Genom wird sequenziert und mit Anmerkungen benotet. Diese Traktionsfähigkeit ermöglicht reverse genetische Techniken wie Morpholino- (MO-) vermittelten Knockdown und CRISPR-vermittelte genetische Ablation durchzuführen. Zebrafische haben auch ihre Nützlichkeit als Modell bewiesen, um vorn genetische Bildschirme durchzuführen; viele wesentliche Gene und Wege, die an der Wirbeltierblutbildung beteiligt sind, wurden auf diese Weise entdeckt. Zahlreiche Methoden zur Beobachtung von Blutzellen wurden auch bei Zebrafischen entwickelt. Während es traditionelle histologische Färbetechniken gibt, ist es auch möglich, in situ-Hybridisierung für blutspezifische Transkripte durchzuführen. Wichtig ist, dass es auch zahlreiche transgene Fischlinien gibt, bei denen fluoreszierende Proteine durch linienspezifische Promotoren exprimiert werden, was die Kennzeichnung bestimmter Blutzellen mit fluoreszierenden Proteinen¹¹ermöglicht. Dies ermöglicht es Forschern, die Entstehung, Expansion und Regulierung von Blutzellen in einem lebenden Organismus im Laufe der Zeit aktuell zu beobachten.

Insgesamt hat die Erhaltung des hämatopoetischen Systems, das Vorhandensein und die einfache Entwicklung von transgenen Linien, einfache Visualisierung und kurze Erzeugungszeit den Zebrafisch zu einem wirtschaftlichen, schnellen und anpassungsfähigen Modell der Hämatopoese gemacht. Um die Toolbox der Techniken zu verbessern, die für Zebrafischforscher zur Verfügung stehen, haben wir diesen Test entwickelt, um die Anzahl der Blutzellen in Embryonen robust zu quantisieren. Die Methode beinhaltet die Verdauung transgener Tiere und die Durchführung von Durchflusszytometrie für fluoreszierende Blutzellen. Auf diese Weise können Blutzellen von mutierten Tieren, die Wirkung der MO- und CRISPR-Modifikation und die Wirkung kleiner Moleküle schnell und reproduzierbar quantitativ analysiert werden. Diese Assays sind benutzerfreundliche und wirtschaftliche Möglichkeiten, Blutzellen aufzuzählen, was die Untersuchung ihrer Erzeugung, Proliferation und Wartung im Laufe der Zeit ermöglicht.

Protokoll

Der Beirat des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der California State University, Chico, genehmigte alle unten beschriebenen Methoden.

HINWEIS: Es wird empfohlen, Embryonen mit 1-Phenyl 2-Thiourea (PTU; Tabelle 1) nach der Nachfruchtung (hpf) nach 24 Stunden, um Pigmentierung zu verhindern, die sich negativ auf die Fluoreszenzdiskriminierung durch Durchflusszytometrie auswirkt. Alle unten aufgeführten Verfahren sind für die Durchflusszytometrie und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) akzeptabel. Wenn man jedoch die hämatopoetischen Zellen nach FACS kulturieren will, dann halten Sie sich bei der Probenverarbeitung an sterile Praktiken. Das Protokoll zum sterilen Bleichen und vorbereiten von Embryoproben wurde zuvor¹²beschrieben.

1. Dechorionation von 48 hpf Zebrafisch-Embryonen

1. Mit Embryonen (mindestens 5, aber nicht mehr als 200 Embryonen) in einer 10 cm Kunststoff Petrischale, kippen Sie die Schale, so dass die Embryonen an den unteren Rand sinken.
   HINWEIS: Es ist einfach, die Schale zu kippen, indem Sie den Deckel entfernen und den Deckel unter eine Kante der Petrischale legen.
2. So viel E3 Medium (Tabelle 1) wie möglich entfernen und entsorgen und 500 l Dechorionationsprotease (10 mg/ml) hinzufügen. Bei Raumtemperatur 5 min inkubieren.
3. Nach 5 min, nehmen Sie die Petrischale (halten alle Embryonen am unteren Rand der Platte), und tippen Sie sanft auf die Seite der Petrischale, so dass Embryonen sanft an der Unterseite der Platte reiben, um Kränzen vollständig zu entfernen.
4. Mit einer Squeeze-Flasche 20 ml E3-Medium hinzufügen, um die Protease zu verdünnen. Lassen Sie Embryonen das E3-Medium durch Dekantieren absetzen und entfernen.
5. Wiederholen Sie Schritt 1.4 3x, um alle Spuren der Dechorionation Protease zu entfernen.
   HINWEIS: Für jede einzelne zu analysierende Probe sind mindestens 5 Embryonen erforderlich. Dieses Dechorionationsverfahren kann bis zu 200 Embryonen pro Petrischale aufnehmen. Proben können in dieser Phase gruppiert und später getrennt werden, falls gewünscht. Alternativ kann die manuelle Dechorionation durchgeführt werden, indem man die Chorionen sanft mit der Zange des Uhrmachers reißt. Dies ist vorteilhaft, wenn es eine geringe Anzahl von Embryonen gibt. Normalerweise schlüpfen Zebrafische von 72 hpf aus ihren Kränzen. Stark missgebildete Embryonen dürfen jedoch nicht mehr und erfordern nach dieser Zeit eine Dechorionation (entweder manuell oder chemisch).

2. Vorbereitung von Embryoproben zur Dissoziation

1. Mit einer P1000 Pipette 5 bis 10 Embryonen in ein einziges 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr geben.
2. E3-Medium mit einer Pipette entfernen und entsorgen.
   VORSICHT: Pipette mit Sorgfalt als Embryonen kann in den folgenden Schritten leicht entsorgt werden.
3. Fügen Sie 1 ml 10 mM Dithiothreitol (DTT) in E3 Medium hinzu, um die Schleimbeschichtung um den embryonalen Zebrafisch^11,12,13,14zu entfernen. Legen Sie das Mikrozentrifugenrohr horizontal und brüten Bei Raumtemperatur für 30 min.

3. Embryo-Dissoziation

1. Waschen Sie die Embryonen 3x mit 1 ml Dulbeccos Phosphatgepufferte Saline (DPBS) mit Ca²⁺ und Mg^2+, um Spuren von DTT zu entfernen. Nach der letzten Wäsche 500 l DPBS mit Ca²⁺ und Mg²⁺ und 5 l von 5 mg/ml (26 U/ml) Dissoziationsprotease hinzufügen.
   HINWEIS: Es können andere isotonische gepufferte Lösungen verwendet werden, aber sie müssen Ca²⁺ und Mg²⁺ enthalten, damit das Dissoziationsenzym ordnungsgemäß funktioniert.
2. Inkubieren Sie Proben bei 37 °C auf einem horizontalen Orbital-Shaker bei 185 Rpm für 60 min. Trituieren Sie Embryonen mit einer P1000 Pipette, bis die Proben vollständig getrennt sind.
   VORSICHT: Achten Sie darauf, die Embryonen nicht zu verdauen; etwas festes Gewebe vorhanden sein sollte, und es sollte nicht vollständig homogen sein. Es ist möglich, zu überdauen, was die Zielblutzellen zerstört, die auf dem Durchflusszytometer beobachtet werden(Ergänzungsfigur 1).
   HINWEIS: Dieses Verfahren funktioniert am besten für 48-72-hpf-Embryonen. Spätere Stadien können eine längere Inkubation mit Dissoziationsprotease erfordern. Der Zeitpunkt für verschiedene Stadien muss empirisch bestimmt werden. Es gibt schnellere alternative Methoden, um embryonales Gewebe zu dissoziieren, aber es wird empirisch festgestellt, dass diese Methode, obwohl sie 60 min dauert, sanft und gründlich genug ist, um eine effiziente Isolierung lebender hämatopoetischer Zellen zu ermöglichen.

4. Herstellung von dissoziierten Embryonen zur Durchflusszytometrie

1. Pipette die 5 dissoziierten Embryonen auf das obere Reservoir eines 5 ml Polystyrol runden Unterrohrmitrohr mit einer 35 mM Zellsiebkappe.
2. Spülen Sie Zellen, indem Sie 4 ml Phosphatgepufferte Saline (PBS) ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺ auf die Siebkappe des 5 ml Polystyrol-Rohrs, das die gefilterten Zellen enthält, hinzufügen.
   HINWEIS: Es können auch andere isotonische gepufferte Lösungen verwendet werden, aber es sollte ihnen an Ca²⁺ oder Mg²⁺ fehlen, um das Dissoziationsenzym zu verdünnen und unwirksam zu machen.
3. Zentrifugenrohre bei 4 °C und 300 x g für 5 min, um die Zellen zu pellet. Mit einer Pipette überstandes Überstand entfernen und entsorgen. Setzen Sie die Zellen in 500 l PBS (ohne Ca²⁺ oder Mg²⁺) aus.

5. Durchflusszytometrie

1. Wirbeln Sie vorsichtig die Zellsuspension und fügen Sie 1:1.000 rote tote Zelle Fleck (Tabelle der Materialien).
   HINWEIS: Der rote Fleck in der totzelligen Zelle ist ein zelldurchlässiger Farbstoff, der den Ausschluss abgestorbener Zellen und Trümmer von Zielzellen ermöglicht und eine ausgezeichnete Wahl für Farbstoffe für die Diskriminierung toter Zellen ist, da er durch den 633 nm-Laser angeregt wird, der sich von dem 488 nm-Laser unterscheidet, der verwendet wird, um gängige Fluorophore wie grünes Fluoreszenzprotein (GFP) und DsRed zu anzuregen. Auf diese Weise gibt es keine spektralen Überlappungen von abgestorbenen Zellen und transgenen Blutzellen. Propidiumiodid (PI) mit 1 mg/ml ist eine kostengünstige Alternative zum roten Totenzellfleck, aber stellen Sie sicher, dass einige Proben, die nur mit PI befleckt sind, sowie Proben nur mit dem Fluorophor von Interesse reservieren, um die Instrumentenkompensation festzulegen. Andernfalls überlappen sich die Signale von PI und Fluorophoren wie GFP, was zu falsch-positiven Ergebnissen führt. Wenn das Durchflusszytometer auch einen 405 nm Laser hat, sind auch andere Farbstoffe wie blauer Papazellfleck eine ausgezeichnete Wahl.
   VORSICHT: Beachten Sie bei der Analyse von Blutzellen, dass nach 30 min bestimmte Zelltypen beginnen, den roten Totenzellfleck zu phagozytoisieren. Halten Sie Zellen bis zur Analyse vor Licht und Eis geschützt und führen Sie die Durchflusszytometrie innerhalb von 30 min nach Zugabe des Farbstoffs durch.
2. Durchflusszytometrie-Analyse
   HINWEIS: Jedes Durchflusszytometer ist ein wenig anders, aber die folgenden Schritte helfen bei der Vorbereitung von Proben für die Analyse auf den meisten Maschinen. Für Benutzer, die neu sind, zytometrie zu fließen, suchen Sie den Rat von jemandem, der ein Experte für das jeweilige Gerät ist. Die folgenden Anweisungen beziehen sich auf das BD FACSAria Fusion Flow Zytometer.
   1. Schalten Sie das Zytometer ein und lassen Sie Laser 20 min aufwärmen. Leeren Sie den Abfallbehälter, füllen Sie den Mantelbehälter mit der entsprechenden Lösung (variiert basierend auf dem Durchflusszytometer) und starten Sie das Fluidiksystem.
      HINWEIS: In der Regel gibt es für jeden Durchflusszytometertyp ein bestimmtes Startverfahren; führen Sie dieses Startvorgangs sorgfältig aus.
   2. Zeichnen Sie in der Analysesoftware fünf Diagramme (Abbildung 1A).
      1. Lassen Sie das erste Punktdiagramm vorwärts streuen (FSC) auf der x-Achse und Die Seitenstreuung (SSC) auf der y-Achse. Legen Sie FSC als linear und SSC als Protokoll fest.
         HINWEIS: FSC ist eine Messung der Zellgröße, und SSC ist eine Messung der Granularität; dies wird die Diskriminierung von Zellen von Schutt ermöglichen. Embryonale Zebrafisch-Blutkörperchen-Populationen trennen sich nicht nach Größe und Granularität in der gleichen Weise wie erwachsene Zebrafisch-Blutkörperchen, die zuvor¹⁵beschrieben wurden. Stattdessen werden sie in der gleichen Population mit allen anderen verdauten embryonalen Zellen erscheinen.
      2. Legen Sie das zweite Diagramm fest, um die FSC-Höhe (H) und die FSC-Breite (W) zu untersuchen. Legen Sie das dritte Diagramm fest, um SSC (H) und SSC (W) zu messen.
         HINWEIS: Dieser Schritt wird verwendet, um Doublets auszuschließen (Zellen, die zusammengeklebt werden, wenn sie durch den Laser gehen).
      3. Legen Sie das vierte Punktdiagramm fest, um den roten Totzellenfleck auf der x-Achse zu messen (abhängig vom Zytometer entspricht dies in der Regel dem Fürsophoycocyanin [APC]) und SSC auf der y-Achse. Dies wird die Diskriminierung lebender Zellen aus abgestorbenen Zellen ermöglichen.
         HINWEIS: Filtersätze jedes Zytometers können unterschiedlich sein. Achten Sie darauf, den richtigen Erkennungsfilter für den Farbfarbstoff für die Diskriminierung toter Zellen zu verwenden.
      4. Die fünfte Parzelle misst das Fluorophor der Wahl. Visualisieren Sie dies als Histogramm des Fluorophors (Abbildung 1) oder verwenden Sie ein Punktdiagramm (Ergänzungsfigur 2).
         HINWEIS: Wenn Sie mehr als ein Fluorophor in demselben Tier untersuchen, wird empfohlen, ein Punktdiagramm zu verwenden, um beide Parameter gleichzeitig anzuzeigen. Wenn es eine Chance gibt, dass die Fluorophore spektrale Überlappung haben(Ergänzungsabbildung 2), wird auch ein Punktdiagramm empfohlen. Verwenden Sie die Area (A)-Einstellungen, um die Fläche unter der vom Laserpuls des Zytometers erzeugten Kurve für alle Parameter zu berechnen, da sie genauer sind.
   3. Laden Sie die Probe, und reduzieren Sie den Durchfluss, damit die Probe nicht schnell abläuft. Passen Sie die FSC- und SSC-Einstellungen so an, dass der Großteil der Zellpopulation deutlich sichtbar ist (Abbildung 1A).
   4. Zeichnen Sie ein Tor um die Zellpopulation und beschriften Sie es zellen. Stellen Sie sicher, dass das zweite Punktdiagramm auf Zellen abgegrenzt ist, schließen Sie Doublets aus, indem Sie zuerst auf FSC und dann auf SSC-Singlets gezwickt werden.
   5. Passen Sie auf der vierten Fläche die Roten Totzellen-Färbungseinstellungen so an, dass es eindeutig eine negative Population gibt. Zeichnen Sie ein Tor um diese Zellen und beschriften Sie sie als lebende Zellen. Auf der fünften Handlung, Tor auf lebenden Zellen und untersuchen Fluorophor negative und positive Zellen. Zeichnen Sie ein Tor um die positiven Zellen.
      HINWEIS: Diese hierarchische Gating-Strategie untersucht einzelne Fluorophor₊ Zellen, die sich im Tor der lebenden Zellen befinden, die sich ebenfalls im Zelltor befinden. Achten Sie darauf, Tore richtig einzustellen. Diese Tore können je nach Experiment angepasst werden.
   6. Führen Sie jedes Beispiel aus und sammeln Sie mindestens 25.000 Livezellenereignisse.
   7. Befolgen Sie das Herunterfahren, um die Fluidik auszuschalten. Füllen Sie den Manteltank und leeren Sie den Abfallbehälter.
      HINWEIS: Es ist oft schwierig, Fluorophor⁺ Zellen zu visualisieren, wenn die Proteinexpression niedrig ist oder die Zellpopulation selten ist. Um sicherzustellen, dass die Parameter richtig eingestellt sind, sollten Fluorophor^- GeschwisterEmbryonen neben dem ordnungsgemäßen Ziehen von Toren und der Anpassung der Laserspannungen vorbereitet werden (Ergänzende Abbildung 2). Wenn die Zielzellenpopulation selten ist, sammeln Sie mehr als 25.000 Ereignisse. Mit 5-10 verdauten Tieren sollte man in der Lage sein, Millionen von Ereignissen zu sammeln. Die Gesamtzahl der Fluorophor⁺ Zellen kann auch mit diesen Daten erhalten werden. Zählen Sie einfach die Gesamtzahl der Zellen in der Probe mit einem Hämozytometer und multiplizieren Sie den Prozentsatz der Fluorophor⁺ Zellen, um die absolute Anzahl der Fluorophor⁺ Zellen pro Fisch zu erhalten.

Ergebnisse

Um rote Blutkörperchen in embryonalen Zebrafischen aufzuzählen, wurden lcr:GFP¹⁶ Embryonen im Einzellstadium mit PBS, 7,0 ng/nL ism1 MO oder 7,0 ng/nL ism1 MO mit 7,0 ng ism1 mRNA¹²injiziert. Bei 48 hpf wurden sie verdaut und einer Strömungszytometrie-Analyse unterzogen. Nach der Analyse des Prozentsatzes der GFP⁺ rote Blutkörperchen aus jeder Probe (jede Probe ist 5 zufällig ausgewählte Embryon...

Diskussion

Zebrafische sind ein ausgezeichnetes Modellsystem für das Studium der primitiven und definitiven Wirbeltierhämatopoese. In den letzten Jahrzehnten wurden mehrere Assays entwickelt und verfeinert, die es Zebrafischen ermöglichten, ein schnelles und wirtschaftliches Modell für das Testen von Medikamenten, die Erzeugung und Erprobung genetischer Mutanten zu werden und insgesamt es Forschern zu ermöglichen, molekulare Pfade zu analysieren, die für hämatopoese unerlässlich sind. Dieses Protokoll verwendet embryonale Zebrafisc...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1,5 ml MCF-Röhrchen	FisherBrand	05-408-129
10 mm Polystyrol easygrip Petrischale	Corning Falcon	351008
5 ml Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappe	Corning Falcon	352235
BD FACSAria Fusion Durchflusszytometer	BD Biosciences
Dithiolthreitol (DTT)	Sigma-Aldrich
DPBS (10x) mit Ca2+ und Mg2+	Life Technologies	14080-055
FBS 500 mL	Gemini Bio-Products	100-108
HyClone PBS (1x)	GE Healthcare Life Sciences	sh30256.01
Librease	Roche Sigma-Aldrich	5401119001	Dissoziationsprotease
Pronase	Roche Sigma-Aldrich	11459643001	Dechorionierungsprotease
SYTOX Red Dead Cell Stain	Invitrogen	Nr. S34859