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Methodenartikel

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

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DOI:

10.3791/61046

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14. Juni 2020

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1Estructura de Recerca Interdisciplinar en Biotecnología y Biomedicina (ERI BIOTECMED), Departamento de Biología Celular, Biología Funcional y Antropología Física, Universidad de Valencia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Zusammenfassung

In der Utero-Elektroporation ist eine In-vivo-DNA-Transfertechnik, die ausgiebig zur Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen verwendet wird, die der Kortikogenese von Säugetieren zugrunde liegen. Dieses Verfahren nutzt die Hirnventrikel, um die Einführung von DNA von Interesse zu ermöglichen und verwendet ein Paar Von Elektroden, um den Eingang des genetischen Materials in die Zellen zu lenken, die die Herzkammer, die neuronalen Stammzellen auskundschaften. Diese Methode ermöglicht es Forschern, die gewünschten Zellen zu kennzeichnen und/oder die Expression von Genen zu manipulieren, die für diese Zellen von Interesse sind. Es hat mehrere Anwendungen, einschließlich Assays, die auf neuronale Migration, Linienverfolgung und axonale Pfadfindung abzielen. Ein wichtiges Merkmal dieser Methode ist ihre zeitliche und regionale Kontrolle, die die Umgehung potenzieller Probleme im Zusammenhang mit embryonaler Letalität oder dem Fehlen spezifischer CRE-Treibermäuse ermöglicht. Ein weiterer relevanter Aspekt dieser Technik ist, dass sie dazu beiträgt, die wirtschaftlichen und zeitlichen Einschränkungen, die die Erzeugung neuer Mauslinien beinhalten, erheblich zu reduzieren, die besonders wichtig für die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Zelltypen werden, die in entfernten Bereichen des Gehirns in unterschiedlichen Entwicklungszeiten entstehen. Hier beschreiben wir eine Doppelelektroporationsstrategie, die die Ausrichtung von Zellpopulationen ermöglicht, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Mit diesem Ansatz können wir verschiedene Subtypen von Zellen an verschiedenen Orten mit ausgewählten fluoreszierenden Proteinen kennzeichnen, um sie zu visualisieren, und/oder wir können Gene von Interesse manipulieren, die von diesen verschiedenen Zellen zu den entsprechenden Zeiten ausgedrückt werden. Diese Strategie erhöht das Potenzial der in utero Elektroporation und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Verhalten von zeitlich und räumlich getrennten Zellpopulationen zu untersuchen, die migrieren, um enge Kontakte zu knüpfen, sowie langfristige Interaktionen durch axonale Projektionen, wodurch zeitliche und wirtschaftliche Kosten reduziert werden.

Einleitung

Die Großhirnrinde ist eine sehr komplexe und kompliziert organisierte Struktur. Um einen solchen Organisationsgrad zu erreichen, durchlaufen kortikale Projektionsneuronen komplexe Entwicklungsprozesse, die ihre zeitliche Generierung erfordern, die Migration zum endgültigen Bestimmungsort in der kortikalen Platte und die Etablierung von Kurz- und Langstreckenverbindungen1,2. Lange Zeit basierte die klassische Art, Die Kortikogenese zu studieren, auf der Verwendung von Knockout- oder Knock-in-Murine-Modellen von Genen von Interesse. Diese Strategie, insbesondere die Verwendung von bedingten Knockout-Mäusen, ist jedoch zeitaufwändig und teuer und wirft manchmal zusätzliche Probleme hinsichtlich der Existenz genetischer Redundanz oder des Fehlens spezifischer CRE-Treiber auf, unter anderem. Einer der Ansätze, die entstanden, um zu versuchen, diese Probleme anzugehen, und das wird heutzutage ausgiebig verwendet, um die kortikale Entwicklung zu studieren, ist in der Utero-Elektroporation3,4. In der Utero-Elektroporation ist eine Technik für die somatische Transgenese verwendet, die in vivo Targeting von neuronalen Stammzellen und ihre Nachkommen ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellen durch die Expression von fluoreszierenden Proteinen5,6, für Genmanipulation in vivo (d.h. Gewinn oder Verlust von Funktionsassays)7,8,9, zur Isolierung elektropoierter Kortiken in vitro und Kultivierungszellen8,10. Darüber hinaus ermöglicht die In-Utero-Elektroporation eine zeitliche und regionale Kontrolle des Zielgebiets. Diese Technik hat zahlreiche Anwendungen und wurde weit verbreitet, um neuronale Migration zu studieren, Stammzellteilung, neuronale Konnektivität, und andere Themen8,9,11,12.

Das aktuelle Manuskript beschreibt die Verwendung einer in utero Elektroporation Variante, die als Doppelin der Utero-Elektroporation bezeichnet wird, um die Wechselwirkungen von Zellen in der Großhirnrinde mit unterschiedlichen zeitlichen und räumlichen Ursprüngen zu analysieren. Diese Studien sind äußerst komplex, wenn sie murine Modelle verwenden, da sie die kombinierte Verwendung mehrerer transgener Linien erfordern. Einige der Anwendungen des protokolls, das in diesem Papier beschrieben wird, umfassen die Untersuchung enger Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen sowie Wechselwirkungen zwischen entfernten Zellen durch weiträumige Projektionen. Die Methode erfordert die Durchführung von zwei unabhängigen in utero Elektroporation Operationen, zeitlich und räumlich getrennt, auf den gleichen Embryonen, um verschiedene Zellpopulationen von Interesse zu zielen. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit, die Genfunktion in einer oder beiden Arten von Neuronen mit Wildtieren zu manipulieren. Darüber hinaus können diese funktionellen Experimente mit der Expression von zytoplasmatischen oder membrangetaggten fluoreszierenden Proteinen kombiniert werden, um die feine Morphologie von Zielzellen, einschließlich Dendriten und Axonen, zu visualisieren und mögliche Unterschiede in zellulären Wechselwirkungen im Vergleich zu einer Kontrolle zu analysieren (d. h. Zellen, die nur mit dem fluoreszierenden Protein gekennzeichnet sind).

Das hier abgegrenzte Protokoll konzentriert sich auf die Untersuchung zellulärer Wechselwirkungen innerhalb des Neocortex, aber diese Strategie könnte auch verwendet werden, um Wechselwirkungen mit extrakortikalen Bereichen zu untersuchen, die mit Hilfe der Uteroelektroporation, wie dem Subpallium oder dem Thalamus13,,14, oder Zell-Zell-Wechselwirkungen in anderen Strukturen, wie dem Kleinhirn15, gezielt betrachtet werden können. Die Ausrichtung auf verschiedene Bereiche basiert auf der Ausrichtung der Elektroden und auf dem Ventrikel, in dem die DNA injiziert wird (lateral, dritte oder vierte). Mit der hier beschriebenen Strategie können wir eine beträchtliche Anzahl von Zellen kennzeichnen, was nützlich ist, um allgemeine Veränderungen der Konnektivität/Innervation in funktionellen Experimenten zu bewerten. Dennoch, um feine Veränderungen in der Konnektivität zu untersuchen, kann man modifizierte Versionen der Utero-Elektroporation verwenden, um eine spärlichere Beschriftung zu erhalten und einzelne Zellen zu identifizieren16. Zusammenfassend ist die Doppel-Elektroporation eine vielseitige Methode, die es ermöglicht, zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzusprechen und ihre Wechselwirkungen im Detail zu untersuchen, entweder unter Kontrollbedingungen oder in Kombination mit funktionellen Experimenten, wodurch die zeitlichen und wirtschaftlichen Kosten erheblich reduziert werden.

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Protokoll

Das hier beschriebene Verfahren wurde von der für Experimente zuständigen Ethikkommission, den Tierschutz der Universidad de Valencia und der Conselleria de Agricultura genehmigt. Desarrollo Rural, Emergencia Climética y Transicién Ecoléngica der Comunidad Valenciana und hält sich an die Leitlinien des Internationalen Rates für Labortierkunde (ICLAS), die im Real Decreto 53/2013 der spanischen Gesetzgebung sowie in der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments und des Rates überprüft wurden.

HINWEIS: Dieses Protokoll umfasst zwei verschiedene Zwecke: 1) die erste Studie, die als "Strategie A" bezeichnet wird, ermöglicht die Analyse der Wechselwirkungen zwischen Cajal-Retzius-Zellen (CR-Zellen) und frühgeborenen kortikalen Projektionsneuronen innerhalb derselben Gehirnhälfte; 2) Die zweite Studie, "Strategie B", wird durchgeführt, um die Innervation der oberen Schicht der kalosalen Projektionsneuronen auf die kontralaterale Seite des Neokortex zu untersuchen.

1. Prächirurgie Präparation

  1. DNA-Vorbereitung
    1. Chemisch oder elektrokompetente E. coli DH5-Zellen mit den von Interesse interessierten Plasmiden transformieren, mit dem entsprechenden Antibiotikum auf LB-Agarplatten plattieren und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Alle hier verwendeten Plasmide enthalten den allgemeinen Promotor für Huhn-Actin (CAG), der die Expression eines Fluoreszenz-Reporter-Proteins (CAG-mCherry und CAG-EGFP für Strategie A und CAG-BFP und CAG-nEGFP-2A-mtdTomato für Strategie B) vorantreibt. Alle von ihnen enthalten Resistenz gegen Ampicillin (AMP).
    2. Wählen Sie einzelne Kolonien aus jeder Plasmidtransformation und initiieren Sie eine Starterflüssigkeitskultur in 2 ml Luria-Brühe + Ampicillin (LB+AMP) in Bakterienkulturröhren während 3x4 h bei 37 °C mit kräftigem Schütteln (200 U/min). Danach eine größere Bakterienkultur in einem 500 ml ErlenmeyerKolben setzen, der 200 ml LB+AMP und 1 ml der Starterkultur hinzufügt. Über Nacht bei 37 °C im Orbital-Shaker bei 200 Umdrehungen/min inkubieren.
    3. Verwenden Sie ein endotoxinfreies Maxi-Prep-Kit (Materialtabelle), das den Anweisungen des Herstellers folgt, um reine und konzentrierte Plasmid-DNA aus den flüssigen Kulturen zu erhalten. Setzen Sie die DNA in einem endotoxinfreien Tris-EDTA-Puffer (TE) um 50 bis 100 L, um Konzentrationen von mindestens 5 g/l zu erhalten.
    4. Für jede Operation eine Lösung mit einem Endvolumen von 10 l, die 1 l schnellen grünen Farbstoff, Plasmid-DNA-Lösung von Interesse für eine Endkonzentration von 1 g / l für jedes Plasmid, und Endotoxin-freie TE-Puffer enthalten. Mischen Sie z. B. 1 l schnellen grünen Farbstoff, 2 l einer 5-g/l-Plasmid-DNA-Lösung und 7 l TE-Puffer.
  2. Pipette ziehen
    1. Ziehen Sie Borosilikatglaskapillaren (1/0,58 mm Außen-/Innendurchmesser) in einen vertikalen Mikropipettenzieher, bis die Spitze eine Länge von 1 x 1,5 cm erreicht, und trimmen Sie sie mit Sezieren von Zangen in einem Winkel von ca. 30° unter einem Trennbereich.
  3. Einrichtung des Operationssaals
    1. Legen Sie alle Geräte auf den Operationstisch (d. h. Pinzette, Schere, Zange, Mikropipetten, Nadel und Nadelhalter). Schalten Sie das Heizkissen ein und bedecken Sie es mit einem sterilen chirurgischen Absorptionspad. Stellen Sie sicher, dass das Reservoir in der Maschine zur Inhalationsanästhesie mit Isofluran gefüllt ist, der Sauerstofftank genügend Sauerstoff enthält und das System ordnungsgemäß funktioniert.
      HINWEIS: Der Operationssaal und das widerstandsfähige Material müssen so steril wie möglich gehalten werden (d. h. das gesamte Material muss vor der Operation autoklaviert und die Oberflächen müssen mit 70% Ethanol desinfiziert werden). Platinelektroden müssen zuerst sorgfältig mit keimtötender Seife und zweitens mit 70% Ethanol vor der Operation desinfiziert werden.
    2. 100 ml 0,9% (w/v) sterile, mit Penicillin-Streptomycin 1:100 enthaltende sterile Salinelösung zubereiten und eine 10 cm Petrischale füllen. Legen Sie die Platte auf das beheizte Pad, um die Lösung aufzuwärmen.
    3. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 150 l einer schmerzstillenden Lösung (z. B. 0,1 mg/kg Buprenorphin).
    4. Beladen Sie die gezogene Pipette mit 5 l der endgültigen Plasmid-DNA-Lösung, die in Schritt 1.1.4 hergestellt wurde. Schließen Sie die Kapillare an ein mundgesteuertes Aspiratorrohr an.

2. Zuerst in der Utero-Elektroporation-Chirurgie

  1. Legen Sie eine E11.5 (Strategie A) oder E13.5 (Strategie B) C57BL/6 schwangere Maus in eine geschlossene Induktionskammer mit 2,5% (v/v) Isofluran bei 0,8 L/min und warten Sie, bis sie anästhesiert ist. Übertragen Sie die Maus auf das Heizkissen und legen Sie seine Nase in eine Maske für die konstante Lieferung von Isofluran. Prüfen Sie, ob kein Pedalreflex als Indikator für eine richtige Anästhesie angezeigt wird.
    HINWEIS: Dase-mbryonic-Alter wird basierend auf dem Tag bestimmt, an dem der Vaginalstecker beobachtet wird (E0.5).
  2. Injizieren Sie das schwangere Weibchen mit der analgetischen Lösung (0,1 mg/kg Buprenorphin) subkutan. Um zu verhindern, dass die Augen während des Eingriffs trocknen, tragen Sie einen Tropfen Augensalbe in jedem Auge mit einem Wattestäbchen auf.
  3. Rasieren Sie den Bauchbereich der Maus mit einem elektrischen Rasiermesser und waschen Sie ihn 2x mit 70% (v/v) Ethanoltüchern, einmal mit Jodtüchern und ein letztes Mal mit einem Ethanol-Wischtuch.
  4. Verwenden Sie eine Schere, um einen 30 mm langen Schnitt durch die Haut in der rechten Seite des Tieres zu machen und trennen Sie vorsichtig die angrenzende Haut vom Muskel mit einem stumpfen Spachtel. Danach einen zweiten Schnitt in der Bauchwand machen.
  5. Bedecken Sie den Bauch mit einem Stück gefaltetem Tissuepapier, das zuvor mit 70 % Ethanol desinfiziert wurde und einen 40 mm langen Schlitz in der Mitte enthält. Ziehen Sie die Gebärmutter vorsichtig mit Ringzangen aus der Bauchhöhle.
    HINWEIS: Die Gebärmutter muss mit der warmen Herz-Saline-Lösung, die in Schritt 1.3.2 während des gesamten Verfahrens zubereitet wird, nass gehalten werden.
  6. Vorbeladung der gezogenen Pipetten mit der in Schritt 1.1.4 hergestellten DNA-Lösung. Injizieren Sie mit dem mundgesteuerten Aspiratorrohr 0,5 L der DNA-Lösung pro Embryo in den seitlichen Ventrikel der ausgewählten Hemisphäre, bis der schnelle grüne Farbstoff im Ventrikel spürbar ist.
  7. Platzieren Sie Zangen-Typ Platinelektroden seitlich um den Kopf des injizierten Embryos (siehe Abbildung 1A und Abbildung 2A). Richten Sie die Elektroden so aus, dass sie auf die gewünschte Hirnregion abzielen. Richten Sie den positiven Pol zur medialen Wand, um den kortikalen Saum (Strategie A) zu elektroporatieren, oder auf den seitlichen Kortex (Strategie B), um die in diesem Bereich erzeugten Zellen zu kennzeichnen.
    HINWEIS: In allen Fällen müssen Herz und Plazenta vermieden werden, um das überleben zu gewährleisten.
  8. Wenden Sie die spezifische Abfolge elektrischer Impulse mit einem quadratischen Wellenelektroporator nach den in Tabelle 1 dargestellten Indikationen an (Strategie A E11.5 Embryonen: vier Impulse von 25 V und 40 ms, getrennt durch 950 ms Intervalle; Strategie B E13.5 Embryonen: fünf Impulse von 35 V und 60 ms, mit 950 ms Intervallen).
  9. Legen Sie die Gebärmutter vorsichtig mit Zangen wieder in die Bauchhöhle, füllen Sie sie mit warmer Herzlösung und schließen Sie die Bauchwand mit einer Nadel 6-0 Naht. Verbinden Sie die beiden Seiten des anfänglichen Schnitts in der Haut entweder mit einer Nadel 6-0 Naht oder Naht-Clips.
  10. Halten Sie das Tier auf dem Heizkissen und überwachen Sie es bis zu seiner Genesung von der Anästhesie. Geben Sie eine zusätzliche Dosis Analgesie (150 l)   in einer Hydrogellösung in ihrem Hauskäfig an.
  11. 24 Stunden nach der Operation eine zusätzliche Dosis Analgesie (150 l) verabreichen. Setzen Sie die tägliche Überwachung durch visuelle Inspektion auf mögliche Schmerzen und Beschwerden fort. Beobachten Sie das Verhalten des Tieres, testen Sie seine normalen Hinterbeinenreflexe und inspizieren Sie die Naht auf mögliche Anzeichen von Schäden durch Lecken oder Kratzen der Wunde.

3. Zweite in der Utero-Elektroporation

  1. Wiederholen Sie zwei Tage nach der ersten Operation die Schritte 2.1-2.3. Obwohl die Genesung von schwangeren Frauen nach der Operation sehr gut ist, überprüfen Sie, ob sie normales Verhalten zeigen und keine Anzeichen von Schmerzen oder Not zeigen, bevor Sie die zweite Operation durchführen (E13.5 Embryonen für Strategie A und E15.5 für Strategie B).
  2. Machen Sie einen 30 mm langen Schnitt durch die Haut wie in Schritt 2.4 und einen zweiten Schnitt an der Bauchwand, diesmal in der linken Seite des Tieres. Bedecken Sie die Gebärmutter vorsichtig auf einem desinfizierten Gewebe, wie in Schritt 2.5 beschrieben.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, den zuvor auf der anderen Seite gemachten Schnitt nicht zu stören.
  3. Injizieren Sie etwa 0,5 l pro Embryo der DNA-Lösung in den seitlichen Hirnventrikel der Hemisphäre, die zuvor im Falle von Strategie A und in den lateralen Hirnventrikel der kontralateralen Hemisphäre für Strategie B elektropoiert wurde.
    HINWEIS: Verwenden Sie nur Embryonen, die eine normale Entwicklung zeigen und keine Anzeichen einer Reabsorption zeigen.
  4. Legen Sie die Elektroden um den Kopf des Embryos um, wie in Schritt 2.7 beschrieben, richten Sie die positive Elektrode auf den lateralen Kortex und wenden Sie die entsprechenden Impulse nach den in Tabelle 1 gezeigten Indikationen an (Strategie A E13.5 Embryonen: fünf Impulse von 35 V und 60 ms getrennt durch 950 ms Intervalle; Strategie B E15.5 Embryonen: fünf Impulse von 50 V und 80 ms getrennt durch 950 ms Intervalle).
  5. Fahren Sie fort und beenden Sie die Operation, wie in den Schritten 2.8-2.10 beschrieben.

4. Gewebeernte und -schnitt

  1. Strategie A
    1. Vier Tage nach der zweiten Elektroporation (E17.5) führen Sie eine zervikale Dislokation des schwangeren Weibchens durch und legen Sie sie in eine Supine-Position.
    2. Mit einer Schere, machen Sie einen ventralen Schnitt, um die Gebärmutterhörner zu extrahieren und mit Zangen legen Sie sie in einer Petrischale gefüllt mit 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS) auf Eis gelegt.
      HINWEIS: Die niedrige Temperatur macht die Anästhesisierung der Embryonen möglich.
    3. Mit einer Pinzette die Embryonen aus dem Fruchtwassersack extrahieren und mit Zangen in eine neue PBS-gefüllte Petrischale unter einem sezierenden Bereich übertragen. Halten Sie vorsichtig den Kopf der Embryonen mit Zangen und führen Sie Hirnsektion mit Pinzette, um zuerst die Haut über den Kopf und dann den Schädel zu entfernen. Verwenden Sie einen Spachtel, um die exponierten Gehirne herauszuziehen.
    4. Sammeln Sie die Gehirne mit einem Löffel und legen Sie sie in einer 48-Well-Platte mit der fixativen Lösung gefüllt (4% [w/v] Paraformaldehyd [PFA] in 1x PBS). Testen Sie sofort auf das erfolgreiche Ergebnis beider Elektroporationen, indem Sie beispielsweise die Gehirne mit einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop untersuchen.
    5. Fixieren Sie die embryonalen Gehirne über Nacht bei 4 °C in einem Orbital-Shaker. Waschen Sie mit 1x PBS, um Spuren von PFA zu beseitigen. Dann auf PBS mit Antimykotika (1x PBS-0.05% (w/v) Natriumazid) übertragen.
      VORSICHT: PFA und Natriumazid sind zytotoxische Verbindungen, die während ihrer Verwendung besondere Vorsichtsmaßnahmen erfordern.
    6. Die fixierten Gehirne in 4% (w/v) niedriger Schmelzpunkt Agarose in 1x PBS einbetten und 10 min warten, bis es sich erstarrt. Kleben Sie sie auf den Vibram-Gewebehalter mit Cyanoacrylatkleber mit den olfaktorischen Glühbirnen nach oben zeigen, um koronale Abschnitte zu erhalten.
    7. Initiieren Sie das Vibratome und wählen Sie die gewünschten Parameter aus: 100 m Breite, 0,60 m/s Geschwindigkeit und 0,60 mm Amplitude.
    8. Sichern Sie das Gehirn im Vibram-Behälter, füllen Sie es mit 1x PBS-Lösung, und beginnen Sie, koronare serielle Abschnitte mit Hilfe einer Bürste in einer 48-Well-Platte zu sammeln, die mit 1x PBS-0,05% (w/v) Natriumazid gefüllt ist, um eine vollständige Darstellung des Gehirns zu erhalten (z. B. etwa sieben Abschnitte pro Brunnen und sechs Brunnen pro Embryo).
    9. Montieren Sie die gewünschten Abschnitte in Mikroskopglasschlitten mit einer feinen Bürste. Bedecken Sie sie mit Glasabdeckungen. Für die langfristige Lagerung hinzufügen Montagemedium, das Photobleichungen und Photooxidation verhindert. Beobachten Sie die Dias unter einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop, um die Wirksamkeit der Elektroporation zu bewerten.
  2. Strategie B
    1. Lassen Sie die Welpen, die zuvor mit E13.5 und E15.5 elektropoiert wurden, geboren werden und warten Sie bis P15, um die transkardiale Perfusion mit der gleichen fixativen Lösung durchzuführen, die in Schritt 4.1.4 verwendet wird.
    2. Kurz vor der Perfusion eine Dosis von 75/1 mg/kg Ketamin/Medetomidin intraperitoneal zu verabreichen. Wenn der Pedalreflex verloren geht, sichern Sie die Maus in einer Supine-Position und machen Sie einen ventralen Schnitt nach der Mittellinie mit einer Schere, um sowohl den Rippenkäfig als auch die Membran freizulegen.
    3. Schneiden Sie die Membran und öffnen Sie den Rippenkäfig, um Zugang zum Herzen zu erhalten. Halten Sie den Rippenkäfig mit einem Hämostat und machen Sie einen Schnitt in den rechten Vorhof mit feiner Schere.
    4. Durchdringen Sie den linken Ventrikel mit einer Nadel, die mit einem flexiblen Rohr mit einer peristaltischen Perfusionspumpe verbunden ist. Beginnen Sie die transkardiale Perfusion und liefern Sie mindestens 25 ml 4% PFA bei einem konstanten Fluss von 5,5 ml/min (Gesamtzeit von 5 min).
    5. Sezieren Sie das Gehirn von durchfundierten Tieren. Zuerst entfernen Sie die Haut über dem Kopf mit Schere und Zange. Beginnen Sie, den Schädel mit einer Schere zu schneiden und ziehen Sie sorgfältig Teile der Schädelknochen ab, bis sie vollständig entfernt sind. Schließlich extrahieren Sie das Gehirn mit Hilfe eines Spachtels.
    6. Übertragen Sie die Gehirne auf eine 24-Well-Platte und fixieren Sie sie mit 4% PFA über Nacht bei 4 °C auf einem Orbital-Shaker. Beenden Sie die Fixierung, indem Sie PFA durch 0,05% (w/v) Natriumazid in PBS ersetzen.
      HINWEIS: Wie in Schritt 4.1.5 angegeben, ist es ratsam, eine Zwischenwäsche mit 1x PBS durchzuführen.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.6-4.1.9, indem Sie die Vibramme-Parameter für postnatale Gehirne ändern (40 m Breite, 1,20 m/s Geschwindigkeit und 0,5 mm Amplitude).
      HINWEIS: Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz kann durchgeführt werden, um bestimmte Zellmarker zu erkennen oder das Signal von fluoreszierenden Proteinen, die in der Elektroporation verwendet werden, zu verbessern.

5. Konfokale Fluoreszenz-Bildgebung und -analyse

  1. Schalten Sie das konfokale Mikroskop ein, legen Sie die Mikroskopschlitten mit den montierten Hirnabschnitten auf den Mikroskop-Diahalter und wählen Sie die Kanäle aus, an denen Fluoreszenzbilder aufgenommen werden sollen (d. h. 420 x 460 nm für BFP, 490-540 nm für GFP und 570-620 nm für mCherry und tdTomato).
  2. Führen Sie Beispielscans durch, um Kartenbilder jedes Gehirnabschnitts mit zwei verschiedenen Wellenlängen für eine allgemeine Ansicht des doppelten Elektroporationsausgangs zu erhalten. Nach der Fertigstellung wählen Sie das 10-fache Objektiv und den Multi-Area-Z-Stack-Zeitraffer-Beobachtungsmodus aus. Dies ermöglicht die programmierung der automatischen Erfassung von Fluoreszenzbildern bei verschiedenen XYZ-Lokalisierungen innerhalb von Gehirnabschnitten.
  3. Legen Sie in jedem der ausgewählten Regionen (XY) die richtigen Bildparameter (d. h. Laserintensität, Photomultiplierempfindlichkeit und eine Mindestauflösung von 1.024 x 1.024) sowie die Tiefe des Scannens (Z) entsprechend den Ebenen der Probe fest, in denen die Fluoreszenz sichtbar ist.
  4. Erhalten Sie Bilder mit geringer Vergrößerung (10x) aller ausgewählten Regionen und exportieren Sie sie mit der Mikroskop-Viewer-Software vom OIF in das TIFF-Format.
  5. Wechseln Sie zur 60-fachen Linse, wiederholen Sie Schritt 5.3 und erfassen Sie Bilder mit hoher Vergrößerung, um die Zell-Zell-Wechselwirkungen detaillierter zu beobachten. Exportieren Sie sie wie in Schritt 5.4 angegeben.
  6. Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder mit jeder Bildverarbeitungssoftware (z. B. Fidschi) zur weiteren Analyse.

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Ergebnisse

Wechselwirkungen zwischen benachbarten Zellen entstanden an distalen Orten und zu verschiedenen Zeiten: Cajal-Retzius-Zellen (CR-Zellen) und früh wandernde kortikale Projektionsneuronen (Strategie A)

Die Wechselwirkung von CR-Zellen und frühen kortikalen Projektionsneuronen wurde zuvor als notwendig beschrieben, um die somale Translokation über Nectin- und Cadherinadhäsionsmoleküle mit einer Doppelelektroporationsstrategie zu regulieren8. CR-Zellen stam...

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Diskussion

Die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen in vivo in Regionen mit hoher Zelldichte wie der Großhirnrinde ist eine komplexe Aufgabe. Herkömmliche Ansätze, einschließlich der Verwendung von Antikörpern zur Kennzeichnung von Neuriten, sind nicht geeignet, da es an spezifischen Markern für verschiedene Zellpopulationen fehlt. Die Verwendung von transgenen murinen Modellen, bei denen ein bestimmter Zelltyp ein fluoreszierendes Protein ausdrückt, ist nützlich, um die neuronalen Prozesse zu visualisieren, aber dies hängt ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren danken Cristina Andrés Carbonell und Mitgliedern der Tierpflegeeinrichtung der Universidad de Valencia für die technische Unterstützung. Wir möchten uns auch bei Isabel Fari'as und Sacramento R. Ferron für die Reagenzien und die gemeinsame Nutzung ihrer Ausrüstung mit uns bedanken. I.M.W wird durch einen Vertrag von der Conselleria de Educacion de Valencia (GJIDI/2018/A/221) finanziert, D.dA.D wird vom Ministerio de Ciencia, Innovacién y Universidades (MICINN) (FPI-PRE2018-086150) finanziert. C.Gil-Sanz hält einen Ramen y Cajal Grant (RYC-2015-19058) vom spanischen Ministerio de Ciencia, Innovacién y Universidades (MICINN). Diese Arbeit wurde RYC-2015-19058 und SAF2017-82880-R (MICINN) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ampicillin-NatriumsalzSigma-AldrichA9518-25G
AspiratorröhrchenSigma-AldrichA5177-5EA
Baby-Mixter-Hämostatik (Perfusion)Fine Science Tools (FST)13013-14
Borosilikatglas KapillareWPI1B100-6
Buprenorphin (BUPREX 0,3 mg/ml)Rb Pharmaceuticals Limited
CAG-BFP-PlasmidMit freundlicher Verfügung von U.Mü ller Lab
CAG-EGFP PlasmidMit freundlicher Verfügung von U.Mü ller Lab
CAG-mCherry PlasmidMit freundlicher Verfügung von U.Mü ller Lab
CAG-mtdTomato-2A-nGFP PlasmidMit freundlicher Verfügung von U.Mü ller Lab
Konfokales MikroskopOlympusFV10i
WattestäbchenBFHCVDF
CyanacrylatkleberB. Braun Chirurgisches1050044
PräparierfernrohrZeissstemi 305
Dumont Pinzette #5 Feine PinzetteFine Science Tools (FST)11254-20
ECM830 Quadrat Wave ElectroporatorBTX45-0052
ElektrorasiererOster76998
Endotoxinfreier TE-PufferQIAGEN1018499
Ethanol TücherBFHCVDF
Extra Fine Graefe PinzetteFine Science Tools (FST)11150-10
AugensalbeAlcon682542.6
Schneller grüner FarbstoffSigma-AldrichF7252-5G
Feine SchereFine Science Tools (FST)14069-09
Fluoreszenz-LEDsCoolLEDpE-300-W
Genopure Plasmid Maxi KitRoche3143422001
Halsted-Mosquito Hämostaten (Naht)Fine Science Tools (FST)91308-12
HeizkissenUFESAAL5514
Inverses EpifluoreszenzmikroskopNikonEclipse TE2000-S
JodtücherLorsoul
Isofluoran-VerdampferDurchflussmesserA15B5001
IsofluranKarizoo586259
Ketamin (Anastemin)Fatro Ibé rica SL583889-2
Kimtech PräzisionstücherKimberly-Clark7252
LB (Lennox) Agar GENLabkemAGLB-00P-500
LB (Lennox) Brühe GENLabkemLBBR-00P-500
Agarose mit niedrigem SchmelzpunktFisher ScientificBP165-25
Medetomidin (Sedator)Dechra573749.2
Mikroskop-DeckgläserMenel-Glä ser15747592
ObjektträgerLabboxSLIB-F10-050
EindeckmediumElektronenmikroskopie Sciences17984-25
Mutiwell-Platten (24)SPL Life Sciences32024
Mutiwell-Platten (48)SPL Life Sciences32048
NaCl (für Kochsalzlösung)Fisher Scientific10112640
Nadel 25 G (BD Microlance 3)Becton, Dickinson and Company300600
Orbital-Inkubator S150Stuart Scientific5133
P Selecta InkubatorJ. P. Selecta, s.a.
ParaformaldehydPanReac AppliedChemA3813
Penicillin-StreptomycinSigma -AldrichP4333
Peristaltische PerfusionspumpeCole-ParmerEW-07522-30
Platin-Pinzette, 5 mm DurchmesserBtx45-0489
Reflex Skin Closure System - 7mm Clips, Schachtel mit 100AgnThos203-1000
Reflex Skin Closure System - Clip Applyer, 7mmAgnThos204-1000
RingzangeFine Science Tools (FST)11103-09
NatriumazidPanReac AppliedChem122712-1608
Chirurgisches saugfähiges Pad (Steryl)HK ChirurgischesPD-M
Nahtmaterial (Surgicryl PGA 6-0)SMI Nahtmaterialien
Spritze 1ml (BD Plastipak)Becton, Dickinson and Company303172
Gewebekulturschale 100 x 20 mmFalcon353003
Vertikal Mikropipette AbzieherSutter Instrument CoP-30
VertikalmikroskopNikonEclipse Ni
VibratomeLeicaVT1200S
9214250485472BYD11071512

Referenzen

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