Methodenartikel

Quantifizierung der menschlichen Norovirus-Virus-ähnlichen Partikelbindung an commensale Bakterien mittels Durchflusszytometrie

DOI:

10.3791/61048

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29. April 2020

 , 
1Microbiology and Cell Science Department, University of Florida

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ziel dieses Protokolls ist es, die Bindung des eukaryotischen Erregers humanes Norovirus an Bakterien zu quantifizieren. Nach der Durchführung eines ersten Virus-Bakterium-Anhang-Assays wird die Durchflusszytometrie verwendet, um viral gebundene Bakterien in der Population zu erkennen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Commensal Bakterien sind gut etabliert, um Infektion von eukaryotischen Viren zu beeinflussen. Die direkte Bindung zwischen dem Erreger und dem Wirtsmikrobiom ist für die Veränderung der Infektion für viele dieser Viren verantwortlich. Daher ist die Charakterisierung der Natur der Virus-Bakterien-Bindung ein grundlegender Schritt, der notwendig ist, um den Mechanismus(n) aufzuklären, durch den Bakterien eine Virusinfektion verändern. Für menschliche norovirus, kommensale Bakterien verbessern B-Zell-Infektion. Das Virus bindet direkt an diese Bakterien, was darauf hindeutet, dass diese direkte Interaktion in den Mechanismus der Infektion Verbesserung beteiligt ist. Eine Vielzahl von Techniken kann verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen Bakterien und Viren zu quantifizieren, einschließlich Szintillationszählung von radioaktiv markierten Viren und Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Beide Methoden erfordern die Verwendung von live-Virus, die möglicherweise im Labor erzeugt werden müssen. Derzeit ist keines der etablierten In-vitro-Kultursysteme, die für humane Noroviren verfügbar sind, robust genug, um die Erzeugung hochkonzentrierter Virusbestände zu ermöglichen. Anstelle von lebenden Viren wurden virusähnliche Partikel (VLPs) verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen Norovirus und Bakterien zu charakterisieren. Hierbei wird eine Durchflusszytometriemethode mit virusspezifischen Antikörpern beschrieben, um die VLP-Bindung an gramnegative und grampositive Bakterien zu quantifizieren. Die Einbeziehung sowohl von Bakterien als auch isotypischer Kontrollen ermöglichte die Optimierung des Assays, um die Hintergrundantikörperbindung und die genaue Quantifizierung der VLP-Bindung an die getesteten Bakterien zu reduzieren. Hohe VLP:Bakterien-Verhältnisse führen dazu, dass VLPs an große Prozentsätze der Bakterienpopulation binden. Wenn jedoch die VLP-Mengen verringert werden, nimmt auch der Anteil der gebundenen Bakterien ab. Letztlich kann diese Methode in zukünftigen Experimenten verwendet werden, um die spezifischen Bedingungen und strukturellen Komponenten zu klären, die norovirus regulieren: bakterielle Wechselwirkungen.

Einleitung

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Humane Noroviren (HuNoVs) sind die Hauptursache für Magen-Darm-Erkrankungen weltweit, verantwortlich für 685 Millionen Infektionen und über 200.000 Todesfälle pro Jahr1. Wie bei anderen enterischen Viren, das Vorhandensein von kommensalen Bakterien hat gezeigt, dass die Infektion dieses Erregers sowie sein Ersatzvirus, murines Norovirus2,3zu verbessern. Es gibt auch widersprüchliche Berichte, dass Bakterien infektiondurch menschliche sonrovirushemmenkönnen 4,5,6. Bei mehreren Viren scheint die direkte Interaktion zwischen dem Virus und Bakterien den Mechanismen zugrunde zu liegen, die dieVirusinfektion2,7,8,9,10, und es wurde durch Elektronenmikroskopie gezeigt, dass menschliche Noroviren direkt an die Oberflächen von Bakterien binden11,12. Daher ist die Charakterisierung dieser Wechselwirkungen entscheidend für die Bestimmung der Mechanismen geworden, durch die Bakterien die Virusinfektion beeinflussen. Diese Charakterisierung hat klassisch mit der Quantifizierung der viralen Bindung an eine Reihe von Bakterienarten begonnen, die Bestandteile des Wirtsmikrobioms7,12,13sind. Diese Anhang Assays offenbaren nicht nur die Menge an Virus an Bakterien gebunden, sondern auch helfen bei der Bestimmung der Auswirkungen dieser Interaktion auf virale Fitness und Überleben.

Zur Quantifizierung der viralen Anhaftung umfassen traditionell verwendete Methoden PCR-basierte Assays, die virale Genome12 oder die Erzeugung von radioaktiv markierten Viren quantifizieren, und die Verwendung von Szintillationszählungen zur Quantifizierung viraler Teilchen7,8,9,13. Die Anwendung dieser Methoden erfordert in der Regel den Zugang zu Beständen mit hohem Titervirus und In-vitro-Anbautechniken, mit denen sie erzeugt werden können. Während mehrere Kultursysteme für menschliches Norovirus jetzt2,14,15, keines unterstützt die robuste Replikation erforderlich, um diese hochkonzentrierten Bestände zu generieren, die die Verwendung von PCR und Szintillationszählung begrenzt oder eliminiert, um menschliche Norovirus/Bakterien-Wechselwirkungen zu quantifizieren.

Um dieses Problem zu umgehen, können virusähnliche Partikel (VLPs) als Ersatz für lebende Viren verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen menschlichen Noroviren und Bakterien zu untersuchen16,17. VLPs sind nicht-infektiöse Partikel, die dem Virus, von dem sie abgeleitet werden, sehr ähnlich sind. Beim menschlichen Norovirus werden diese Teilchen aus der Expression des VP1-Proteins (und irgendwann des VP2-Proteins) erzeugt, das sich selbst zusammensetzt, um intakte virale Kapsiden ohne genetisches Material (d.h. RNA für Noroviren) zu erzeugen. Diese VLPs sind gut charakterisiert, sind strukturell und antigen ähnlich wie die Wildtypviren, von denen sie abgeleitet sind18,19,20,21,22,23. Daher dienen VLPs als ideales Ersatzfürst, um die Oberflächenwechselwirkungen zwischen humanen Noroviren und Kommensalen zu untersuchen. Da VLPs an genetischem Material fehlen, können PCR-basierte Assays nicht zur Quantifizierung der viralen Bindung verwendet werden. Eine Antikörper-basierte Durchflusszytometrie-Methode wurde zuvor beschrieben und konnte niedrige KONZENTRATIONen von VLP-Bindung an Bakterien semiquantitativ erkennen16. Diese Methode wurde optimiert, um eine genaue Quantifizierung der menschlichen Norovirus-VLP-Bindung an gramnegative und grampositive Commensalbakterien zu ermöglichen16.

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Protokoll

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HINWEIS: Die im Protokoll beschriebenen bakteriellen Wachstumsbedingungen sind Standardkulturbedingungen für Enterobacter cloacae und Lactobacillus gasseri. Um das Virus durchzuführen: Bakterien-Anhang assay mit anderen Bakterienarten, sollten die ausgewählten Bakterien unter Standardbedingungen für das Bakterium geeignet kultiviert werden.

1. Vorbereitung bakterielles Wachstumsmedium

  1. Enterobacter cloacae Wachstumsmedien
    1. Bereiten Sie flüssiges Medium durch Auflösen von 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 10 g Natriumchlorid (NaCl) in 1 L entionisiertem (DI) Wasser (siehe Materialtabelle). Mischen Sie alle Medien gründlich und sterilisieren durch Autoklavieren für 30 min.
    2. Bereiten Sie festes Medium durch Auflösen von 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl und 15 g Agar in 1 L DI-Wasser vor. Mischen Sie alle Medien gründlich und sterilisieren durch Autoklavieren für 30 min.
  2. Lactobacillus gasseri Wachstumsmedien
    1. Bereiten Sie flüssiges Medium durch Auflösen von 55 g De Man, Rogosa und Sharpe (MRS; siehe Tabelle der Materialien) Pulver in 1 L DI-Wasser. Verwenden Sie Medium innerhalb eines Monats nach der Vorbereitung. Zum Sterilisieren, Erhitzen Medium für 15 min bis zum Kochen gefolgt von Autoklavierung für 15 min.
    2. Bereiten Sie festes Medium durch Auflösen von 55 g MRS-Pulver und 15 g Agar in 1 L DI-Wasser vor. Zum Sterilisieren, Erhitzen Medium für 15 min bis zum Kochen gefolgt von Autoklavierung für 15 min.

2. Ermittlung einer Standardkurve, die optische Dichte (OD) und Bakterienkonzentration korreliert

  1. 5 ml des geeigneten flüssigen Mediums mit einer einzigen, isolierten Kolonie aus einer Agarplatte (E. cloacae) oder direkt aus gefrorenem Glycerinbestand (L. gasseri) impfen
  2. Das Bakterium über Nacht unter den richtigen atmosphärischen Bedingungen anbauen (Enterobacter cloacae: 37 °C mit aerobem Schütteln bei 200 U/min; L. gasseri: 37 °C Wasserbad ohne Schütteln in einem luftdichten Behälter).
  3. 2 x 1,3 ml Aliquots der Nachtkultur in zwei separate 1,5 ml Zentrifugenröhrchen und Zentrifugenbakterien bei 10.000 x g für 5 min übertragen.
  4. Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie Proben mit 1 ml steriler 1x Phosphatgepufferter Saline (PBS). Wiederholen Sie diesen Waschschritt für insgesamt 2 Wäschen.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben für 5 min wieder bei 10.000 x g, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie sie in 1,3 ml sterilem 1x PBS wieder auf.
  6. Beginnend mit 0,5 ml gewaschener Kultur, verdünnen Sie die Bakterien in 1x PBS von 10-1 bis 10-4.
  7. Messen Sie mit einem Spektralphotometer die optische Dichte der gewaschenen, unverdünnten Kultur und jede der vier Verdünnungen bei 600 nm (OD600).
  8. Führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen in 1x PBS für jede Verdünnung ab Schritt 2.6 durch. Verteilen Sie die Platte 100 l der letzten 3 Verdünnungen für jede Serie auf geeignetes Festmedium, um die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) jeder Probe zu bestimmen. Platte jede Verdünnung in Dreifache.
  9. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur für 5 min trocknen. Invertieren Sie die Platten und inkubieren Sie unter den entsprechenden atmosphärischen Bedingungen (E. cloacae: aerobic bei 37 °C, Brutplatten über Nacht; L. gasseri: anaerobe bei 37 °C, Inkubationsplatten für 48 h in einem luftdichten Behälter mit anerobischen Luftbeuteln (siehe Materialtabelle)).
    HINWEIS: Verwenden Sie 1 anaerobe Luftbeutel pro 2,5 L Glas oder 3 Beutel pro 7,0 l Glas (siehe Tabelle der Materialien).
  10. Verwenden Sie Plattenzahlen, um CFU/ml für jede der 5 Proben zu bestimmen (d. h. unverdünnt, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4). Generieren Sie eine Standardkurve, die OD600 vs CFU/mL vergleicht. Die Gleichung für diese Linie wird in VLP-Bakterien-Anhangassays verwendet, um CFU/mL basierend auf OD600zu bestimmen.

3. VLP-Bakterien Attachment Assay

VORSICHT: Humane Norovirus-VLPs sind eine Biosicherheitsstufe (BSL)-2-Gefahr, und alle Arbeiten mit VLPs sollten in einem Biosicherheitsschrank durchgeführt werden. Die Vorbereitung der Bakterienkulturen sollte vor dem Anhaftungstest unter den für den Organismus geeigneten Sicherheitsbedingungen durchgeführt werden.

  1. Reagenz-Präparation
    1. 1x Phosphat gepufferte Saline (PBS)
      1. Bereiten Sie 1 L 10x PBS vor, indem Sie ein ganzes Paket in 1 L DI-Wasser auflösen.
      2. Autoklavlösung für 30 min.
      3. Bereiten Sie eine 1x Lösung vor, indem Sie die oben genannte Lösung 1:10 in DI-Wasser verdünnen.
      4. Filter sterilisieren die Lösung, indem sie durch einen 0,22 m Filter geleitet und bei Raumtemperatur gelagert werden.
    2. 5% BSA
      1. Fügen Sie 5 g Rinderserumalbumin (BSA) Pulver zu 100 ml PBS hinzu, um eine 5% (w/v) Lösung zu erzeugen.
      2. Mischen Sie die Lösung durch Wirbeln oder auf einer Rührplatte mit einem Metallrührstab, bis sich die Klumpen aufgelöst haben.
      3. Filter sterilisieren mit einem 0,22 m Filter.
      4. Bewahren Sie die Lösung bei 4 °C auf.
    3. Durchflusszytometrie-Fleckenpuffer (FCSB)
      1. Filter kaufte FCSB (siehe Tabelle der Materialien) durch einen 0,22 m Filter.
      2. Restlösung bei 4 °C lagern.
    4. 5% Blockierpuffer (BB)
      HINWEIS: Bereiten Sie jedes Mal frisch vor.
      1. Fügen Sie 0,5 g BSA auf 10 ml sterilen FCSB hinzu.
      2. Wirbel, um Probe vollständig zu mischen und auf Eis lassen, bis zum Gebrauch.
  2. Antikörperkonjugation
    1. Konjugieren Sie den humanen Norovirus-GII-Antikörper (siehe Materialtabelle) mit R-Phycoerythrin (PE) unter Verwendung eines R-PE-Antikörper-Etikettierungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Bewahren Sie den konjugierten Antikörper im Dunkeln bei 4 °C für die zukünftige Verwendung in der VLP-Bakterium-Anhangs-Assay-Analyse auf.
      HINWEIS: Der primäre Antikörper sollte vor der Verwendung im VLP-Bakterien-Anhangstest titriert werden, um die richtige Konzentration zu bestimmen, die für die Durchflusszytometrieanalyse erforderlich ist. Die Antikörpertitration sollte jedes Mal durchgeführt werden, wenn die Konjugationsreaktion durchgeführt wird, und für jedes Bakterium, das in der Anhaftungs-Assay verwendet wird.
  3. Antikörpertitration
    1. Verdünnen Sie den konjugierten antihumanen Norovirus-GII-Antikörper 100-fach, mit einer Beginnenverdünnung von 1:100 und einer Endverdünnung von 1:600 (insgesamt sechs Verdünnungen).
    2. Führen Sie einen Virusanhangstest durch, wie unten beschrieben, mit der folgenden Ausnahme: In Schritt 3.5.7 setzen Sie das bakterielle Pellet in 350 l von 5% BB wieder auf.
    3. Teilen Sie die Probe in sieben 50-L-Aliquots auf.
    4. Fügen Sie 50 l jeder Antikörperverdünnung zu einem Röhrchen hinzu.
    5. Fügen Sie dem siebten Rohr 50 l von 5 % BB als unbefleckte Steuerung hinzu.
    6. Führen Sie die Durchflusszytometrie für alle Proben wie unten beschrieben durch.
    7. Vergleichen Sie verdünnte Antikörperproben mit ungefärbten Kontrollen und miteinander. Die niedrigste Antikörperkonzentration, die nicht zu einer Abnahme oder einem Verlust des positiven Signals führt, sollte für die Verwendung in nachfolgenden Assays gewählt werden.
  4. Herstellung von Bakterien
    1. Wachsen Sie die Bakterien in 40 ml des geeigneten flüssigen Mediums unter geeigneten atmosphärischen Bedingungen, bis die Bakterien in der stationären Phase sind.
      1. Wachsen Sie E. Cloacae Kulturen aerob über Nacht in Luria Broth bei 37 °C, schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute, um stationäre Phase zu erreichen.
      2. L. Gasseri-Kulturen in MRS-Brühe in schwarzen Schraubverschlussrohren ohne Schütteln in einem Auf 37 °C eingestellten Wasserbad für 18 h wachsen, um die stationäre Phase zu erreichen.
    2. Übertragen Sie stationäre Phasenkulturen, um 50 ml konische Rohre und Zentrifugenproben bei 2.288 x g für 10 min zu reinigen, um die Bakterien zu pellet.
    3. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie ihn in 13 ml steriler 1x PBS wieder auf. Wiederholen Sie diesen Waschschritt für insgesamt zwei Wäschen.
    4. Zentrifugieren Sie die Proben erneut, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Proben in 20 ml 1x PBS wieder auf.
      HINWEIS: Wenn das Zellpellet klein ist, kann das Resuspensionsvolumen verringert werden.
    5. Messen Sie die OD600 der Kultur.
    6. Bestimmen Sie anhand der zuvor vorbereiteten Standardkurve die CFU pro ml der gewaschenen Kultur.
    7. Verdünnen Sie die Bakterien nach Bedarf mit 1x PBS, um die Kulturkonzentration auf 1 x 108 KBE/ml anzupassen.
    8. Übertragen Sie 1 ml der 1 x 108 KBE/ml-Bakterienkultur auf die erforderliche Anzahl von 1,5 ml Zentrifugenrohren.
    9. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 10.000 x g für 5 min.
    10. Setzen Sie das bakterielle Pellet in 1 ml steriler 5% BSA aus.
    11. Inkubieren Sie die Rohre für 1 h bei 37 °C mit konstanter Drehung.
  5. Virus-Anhang
    1. Wenn Sie in einem BSL-2-Biosicherheitsschrank arbeiten, fügen Sie jedem Rohr, das In PBS resuspendierte Bakterien enthält, 10 g HuNoV VLPs (siehe Materialtabelle)hinzufügen und gründlich durch Pipettieren mischen.
      HINWEIS: Die VLP-Konzentration unterscheidet sich mit jedem VLP-Präparat. Daher variiert das Denkobakterien zugesetzte Volumen zwischen den Zubereitungschargen und sollte entsprechend angepasst werden, so dass jeder Röhre im Experiment 10 g zugesetzt werden. Nur für Bakterienkontrollen (z. B. Proben ohne VLP) fügen Sie ein PBS-Volumen hinzu, das dem Volumen von VLP entspricht, das experimentellen Proben hinzugefügt wird.
    2. Röhren für 1 h bei 37 °C bei konstanter Drehung inkubieren.
      HINWEIS: Ein Rohrrevolver (siehe Materialtabelle)mit 40 U/min wird während der Inkubation verwendet.
    3. Zentrifugieren Sie die Proben nach der Inkubation 5 min bei 10.000 x g.
    4. Überstand entsorgen und bakterielles Pellet in 1 ml PBS wieder aufsetzen.
    5. Wiederholen Sie die Waschschritte 3.5.3 und 3.5.4.
    6. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 x g für 5 min.
    7. Verwerfen Sie Überstand und setzen Sie bakteriellepellet in 150 l von 5% BB aus.
  6. Antikörperfärbung
    1. Bereiten Sie frische 5% BB.
      HINWEIS: Alle Arbeiten mit dem fluoreszierend markierten Antikörper sollten im Dunkeln durchgeführt werden und der Antikörper, BB und FCSB sollten auf Eis gehalten werden.
    2. Verdünnung des humanen Norovirus-GII-Antikörpers 1:125 für E. Cloacae-Proben und 1:150 für L. Gasseri-Proben in 5% BB, wodurch 50 l verdünnter Antikörper pro Probe hergestellt werden.
    3. Verdünnen Sie den Isotyp-Antikörper auf die gleiche Weise, wie der humane Norovirus GII Antikörper für jedes Bakterium in 5% BB verdünnt wurde, wodurch 50 l verdünnte Isotypkontrolle pro Probe hergestellt wurden.
    4. Teilen Sie jede Befestigungsprobe aus Schritt 3.3.7 in drei 50 L-Aliquots auf, indem Sie sie in saubere 1,5 ml Zentrifugenrohre übertragen.
    5. Fügen Sie dem ersten Satz von Proben 50 L BB hinzu. Dieser Satz wird die unbefleckte (Uns) Steuerung sein.
    6. Zum zweiten Satz 50 l der GII-Antikörperverdünnung hinzufügen. Dies führt zu einer endgültigen Antikörperkonzentration von 1:250 für E. cloacae und 1:300 für L. gasseri. Bei diesem Mustersatz handelt es sich um die gebeizten (AB) Proben.
    7. Zum dritten Satz 50 l des verdünnten Isotyp-Antikörpers hinzufügen. Dieser Satz ist die Isotype-Steuerung (IC). Durch Pipettieren gut mischen. Inkubieren Sie die Proben auf Eis und im Dunkeln für 30 min.
    8. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 x g für 5 min.
    9. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Proben in 100 l DES FCSB wieder aus.
    10. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 x g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Proben in 100 l FCSB wieder aus.
    11. Zentrifugieren Sie alle Proben bei 10.000 x g für 5 min.
    12. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Proben in 150 l DES FCSB wieder aus.
    13. Übertragen Sie jede Probe in ein FCSB-Rohr, das 400 l FCSB-Puffer für ein Gesamtvolumen von 550 l enthält.
    14. Halten Sie die Proben bei 4 °C, bis sie durch Durchflusszytometrie analysiert werden.
      HINWEIS: Die Durchflusszytometrie wird innerhalb von 4 h der Antikörperfärbung durchgeführt.

4. Durchflusszytometrie

HINWEIS: Die unten beschriebenen Spannungseinstellungen basieren auf dem Durchflusszytometer und der Software, die in der Materialtabelle aufgeführt sind, und variieren wahrscheinlich mit verschiedenen Durchflusszytometern. Die Einstellungen sollten für jedes Bakterium optimiert werden. Stellen Sie sicher, dass sich die Achsen für alle Diagramme in der biexponentiellen Phase befinden.

  1. Einrichten des Arbeitsbereichs
    HINWEIS: Die Einrichtung für Diagramme, die zum Einrichten des Arbeitsbereichs verwendet werden, unterscheidet sich von denen, die bei der Gating- und Datenanalyse verwendet werden. Der Zweck der Einrichtung des Arbeitsbereichs besteht darin, die Zellpopulation zu visualisieren, sicherzustellen, dass es keine übermäßige Verklumpung der Bakterienzellen gibt, die die nachgelagerte Analyse beeinflussen könnte, und zwischen gefärbten und ungefärbten Zellen zu unterscheiden, während Daten gesammelt werden.
    1. Um sicherzustellen, dass Bakterien nicht zusammenklumpen, richten Sie eine Reihe von Dichtediagrammen ein.
      1. Generieren Sie einen Vorwärtsstreubereich (FSC-A) im Vergleich zu einem Side Scatter Area (SSC-A), um die Gesamtpopulation zu visualisieren.
      2. Richten Sie Diagramme ein, um einzelne Zellen im Vergleich zu Zellklumpen auszuwerten, indem Sie zwei Diagramme erstellen, die sowohl vorwärts (FSC-W) als auch eine Seitenstreubreite (SSC-W) nach vorne (FSC-H) bzw. Seitenstreuhöhe (SSC-H) vergleichen.
      3. Erstellen Sie ein Diagramm, das nur die PE-positive Population (PE-A vs. SSC-A) anzeigt.
    2. Legen Sie die Ausgangsspannung auf 500 für E. cloacae und 340 für L. gasserifest. Diese werden später weiter angepasst.
    3. Legen Sie die Gesamtzahl der gezählten Ereignisse auf 10.000 Ereignisse fest.
  2. Laufproben
    1. Erstellen Sie drei separate Histogrammdiagramme, die die Anzahl der Gegentore zu SSC-A, FSC-A oder PE-A anzeigen.
    2. Legen Sie eine unbefleckte Probe auf das Durchflusszytometer und erfassen Sie die Probenereignisse, um sicherzustellen, dass die maximale Spitze auf dem Histogramm für SSC-A innerhalb von 102 bis 103 liegt und die maximale Spitze auf dem Histogramm für FSC-A zwischen 104 und 105 auf der x-Achse liegt. Ist dies nicht der Fall, liegen die Spitzen nicht innerhalb der angegebenen Bereiche, passen Sie die FSC- und SSC-Spannungen entsprechend an.
    3. Legen Sie eine gebeizte Probe (AB) auf das Durchflusszytometer und passen Sie die Spannung PE an, um die maximale Spitze über 103 auf der x-Achse zu machen.
    4. Basierend auf diesen Messungen, stellen Sie das positive PE-Gate und das Tor auf dem PE-A versus SSC-A Dichtegraph.
    5. Führen Sie alle Samples unter den festgelegten Einstellungen mit niedriger oder mittlerer Geschwindigkeit aus.

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Ergebnisse

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Die Gating-Strategien zur Quantifizierung der menschlichen Norovirus-VLP-Bindung an commensale Bakterien sind in Abbildung 1dargestellt. Repräsentativer Dichtepunkt bietet einen Überblick darüber, wie Proben abgezäutt wurden, um Zellablagerungen und Zellklumpen zu beseitigen, so dass die VLP-Befestigung auf Singlet-Populationen bestimmt wurde (Abbildung 1A). Repräsentative Histogramme zeigen niedrige Konzentratio...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Fähigkeit, die Bindung von enterischen Viren an Bakterien zu quantifizieren, ist ein entscheidender erster Schritt, um die Mechanismen aufzuklären, mit denen diese Bakterien eine Virusinfektion verändern. Die hier beschriebenen Methoden wurden optimiert, um menschliche Norovirus-VLP-Wechselwirkungen mit E. cloacae (gramnegatives Bakterium) und L. gasseri (ein grampositives Bakterium) zu messen, können aber für die Verwendung mit jedem Säugetiervirus und Bakterium von...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir danken Sutonuka Bhar und Chanel Mosby-Haundrup für ihre kritische Überprüfung des schriftlichen Manuskripts sowie Alfonso Carrillo für die Unterstützung bei der Erzeugung bakterieller Standardkurven. Diese Arbeit wird zum Teil durch ein Stipendium des National Institute of Health (R21AI140012) und durch ein Saatgutstipendium der University of Florida, Institute of Food and Agricultural Sciences, finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5 ml Polystrene-Röhrchen mit rundem Boden und ZellsiebkappeCorning 352235Nach der Antikörperfärbung wird die Probe zur Durchflusszytometrie-Analyse in Röhrchen überführt.
AgarSigmaA7002Wird für die Medienvorbereitung
verwendet AnaeroPackThermo ScientificR681001Anaerobe Gaspackung zur Kultivierung von Lactobacillus gasseri
BD FacsDiva Software
BD LSR Fortessa Durchflusszytometer
Rinderserum AlbuminFisher BioreagenzienBP1605Wird für die Durchflusszytometrie
Durchflusszytometrie Fleckenpuffer (FCSB)BD Biosciences554657Wird für die Durchflusszytometrie
Maus, IgG2b, Kappa, Isotypkontrolle (eBMG2b), PE, eBioscience,Thermo FisherScientific 12473281Isotypkontrolle verwendet. Dieser Antikörper wird in der konjugierten Form vom Hersteller gekauft.
MRS PulverBD Biosciences288130Wird zur Medienvorbereitung und zur Kultivierung von Lactobacillus gasseri verwendet.
Monoklonaler Antikörper gegen Norovirus-Kapsid G2 (L34D)Thermo Fisher ScientificMA5-18241Norovirus GII-Antikörper. Dieser Antikörper ist nur in der unkonjugierten Form erhältlich und muss daher vor der Verwendung in den skizzierten Durchflusszytometrie-Assays fluoreszenzkonjugiert werden. In diesem Protokoll wurde PE als Fluor gewählt, jedoch können auch andere fluoreszierende Moleküle ausgewählt werden, die am besten zu dem vom Forscher verwendeten Durchflusszytometer passen.
Norovirus GII.4 VLPCreative BiostructureCBS-V700 humaneNorovirus-Virus-ähnliche Partikel, VLPs wurden mit dem Baculovirus-System erzeugt und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 10% Glycerin resuspendiert. Die Autoren führten unabhängige Nanosight-Tracking-Analysen durch, um die Partikelkonzentration der VLPs zu bestimmen. Die Konzentration beträgt ca. 1011 VLPs pro Milliliter. Basierend auf der Proteinkonzentration der VLPs werden in VLP-Attachment-Assays etwa 200 Partikel pro Bakterium zugegeben.
PBS 10XFisher BioreagentsBP665Vor Gebrauch auf 1X verdünnen.
SiteClick R-PE Antikörper-MarkierungskitThermo Fisher ScientificS10467Konjugationskit zum Etikettieren von unkonjugierten Antikörpern.
NatriumchloridFisher ScientificS271Wird für die Medienvorbereitung
verwendet TryptonoxoidLP0042Wird für die Medienvorbereitung
Tube RevolverThermoFisher Scientific88881001Wird im Virus:Bakterium-Attachment-Assay verwendet. Auf maximale Drehzahl (40 U/min) einstellen.
HefeextraktBD Biosciences212750Wird zur Medienvorbereitung verwendet
verwendet, verwendet

Referenzen

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