Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

Summary

Dies ist eine Methode, um "scarinant" rekombinante Vaknie-Viren mit Host-Range-Auswahl und visuelle Identifizierung von rekombinanten Viren zu generieren.

Abstract

Das Vaccinia-Virus (VACV) war maßgeblich an der Ausrottung des Variolavirus (VARV), des Erregers der Pocken, aus der Natur beteiligt. Seit seiner ersten Verwendung als Impfstoff wurde VACV als Vektor für therapeutische Impfstoffe und als onkolytisches Virus entwickelt. Diese Anwendungen nutzen das leicht zu manipulierende Genom und das breite Host-Sortiment von VACV als hervorragende Plattform, um rekombinante Viren mit einer Vielzahl von therapeutischen Anwendungen zu erzeugen. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um rekombinante VACV zu erzeugen, einschließlich Markerauswahlmethoden und transient dominante Selektion. Hier stellen wir eine Verfeinerung einer Hostrange-Auswahlmethode in Verbindung mit der visuellen Identifizierung rekombinanter Viren vor. Unsere Methode nutzt den selektiven Druck, der von der antiviralen Proteinkinase R (PKR) des Wirts erzeugt wird, gekoppelt mit einem fluoreszierenden Fusionsgen, das mCherry-tagged E3L, einen von zwei VACV PKR-Antagonisten, exzessiiert. Die Kassette, einschließlich des Gens von Interesse und der mCherry-E3L Fusion, wird von Sequenzen flankiert, die aus dem VACV-Genom abgeleitet sind. Zwischen dem Gen von Interesse und mCherry-E3L ist eine kleinere Region, die identisch mit den ersten 150 Nukleotiden des 3' Arms ist, um homologe Rekombination und Verlust des mCherry-E3L-Gens nach der Selektion zu fördern. Wir zeigen, dass diese Methode eine effiziente, nahtlose Erzeugung von rVACV in einer Vielzahl von Zelltypen ermöglicht, ohne dass eine Arzneimittelauswahl oder ein umfangreiches Screening auf mutierte Viren erforderlich ist.

Introduction

Das Vaccinia-Virus (VACV) war entscheidend für die erste erfolgreiche Tilgung eines menschlichen Erregers, des Variolavirus (VARV), aus der Natur. Seit der Ausrottung des Variola-Virus sind Poxviren einschließlich VACV weiterhin nützliche therapeutische Viren für die Human- und Tiermedizin. Beispielsweise hat ein VACV-basierter Tollwutvirus-Impfstoff die Übertragung von sylvatischer Tollwut in Europa¹ und den Vereinigten Staaten sehr wirksam verhindert². In jüngerer Zeit haben rekombinante Poxviren, die eine Vielzahl von Anti-Tumor-Molekülen (z. B. einkettige Antikörper oder menschliches Erythropoietin) exzieren, ermutig....

Protocol

1. Generieren des Rekombinationsvektors

1. Design-Primer, um die Auswahlkassette zu generieren. Entwerfen Sie jedes einzelne Amplikon mit überlappenden Sequenzen mit benachbarten Amplikonen und dem Vektor, um die isotherme enzymatische Montage von DNA-Molekülen, auch Gibson-Montage genannt, mit einem von mehreren Online-Primer-Design-Tools zu erleichtern.
   HINWEIS: Dieses Protokoll kann auch mit herkömmlichen, auf Einschränkungen endonukleasebasierten Klonierungsmethoden abgeschlossen werden. In diesem Fall können Sie Primer mit den entsprechenden Einschränkungssites anstelle von überlappenden Sequenzen entwerfen.
2. Mit den in Schritt 1.1 entworfenen ....

Results

Wir verwendeten das in Abbildung 1 dargestellte Verfahren, um einen VACV zu erzeugen, der sowohl die PKR-Antagonisten E3L als auch K3L fehlte, indem wir E3L durch EGFP in einem Virus ersetzten, das bereits für K3L (vP872) gelöscht wurde. Abbildung 2 zeigt rote fluoreszierende Plaques in PKR-kompetenten RK13-Zellen, die auf eine virale Expression von mCherry-E3L hinweisen, sowie EGFP, ausgedrückt in RK13+E3L+K3L-Zellen, die den Verlust von E3L und den Zusammenbru.......

Discussion

Hier stellen wir eine Variation einer transienten Markerauswahlstrategie ³² vor, um rekombinante Impfstoffviren zu erzeugen, ohne fremde DNA im endgültigen rekombinanten Virus zu speichern. Unsere Strategie verwendet selektiven Druck, der vom antiviralen Protein PKR des Wirts vermittelt wird, anstatt andere Formen des selektiven Drucks wie Antibiotika. Die Verwendung von antiviralen Wirtsgenen eliminiert die Möglichkeit chemisch induzierter phäkotypischer Veränderungen in den Zellen oder ein erhöh.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2X-Q5 Master Mix	NEB	M0492L	High-Fidelity-Polymerase für PCR
Ampicillin	ThermoFisher Scientific	11593027	Bakterielles Selektivmittel
Einweg-Zellschaber	ThermoFisher Scientific	08-100-242	Zellschaber zur Ernte infizierter Zellen
EVOS FL Auto 2 Zell-Bildgebungssystem	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Fluoreszenzmikroskop
EVOS Light Cube, GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP Cube
EVOS Light Cube, RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP Cube
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	Transfektionsreagenz
Luria Bertani (LB) Bouillon	Gibco	10855021	Bakterienwachstumsmedium
Monarch DNA Gel-Extraktionskit	NEB	T1020L	Gel-Aufreinigungskit zur Aufreinigung von Amplikons und linearisierten Vektoren
Monarch Plasmid Miniprep Kit	NEB	T1010L	Miniprep-Kit zur Aufreinigung von Plasmiden
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	Spektralphotometer zur Messung der RNA- und DNA-Konzentration
NEBuilder Master Mix	NEB	E2621L	Isothermer enzymatischer Bausatz zur Erzeugung des Rekombinationsvektors
Q500 Sonicator	Qsonica	Q500-110	Sonicator für Viruslysate
RK13-Zellen	ATCC	CCL-37	Kaninchen-Nierenzellen
VWR Multiwell-Zellkulturplatten VWR		10062-892	Zellkulturplatten