Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

Sameera Vipat; Greg Brennan; Chorong Park; Sherry  L. Haller; Stefan Rothenburg

doi:10.3791/61049

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Methodenartikel

Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl

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DOI:

10.3791/61049

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24. Mai 2020

Sameera Vipat^*¹ , Greg Brennan^*¹ , Chorong Park¹ , Sherry L. Haller² , Stefan Rothenburg¹

¹Department of Medial Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of California Davis, ²Department of Microbiology and Immunology, University of Texas Medical Branch at Galveston

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dies ist eine Methode, um "scarinant" rekombinante Vaknie-Viren mit Host-Range-Auswahl und visuelle Identifizierung von rekombinanten Viren zu generieren.

Zusammenfassung

Das Vaccinia-Virus (VACV) war maßgeblich an der Ausrottung des Variolavirus (VARV), des Erregers der Pocken, aus der Natur beteiligt. Seit seiner ersten Verwendung als Impfstoff wurde VACV als Vektor für therapeutische Impfstoffe und als onkolytisches Virus entwickelt. Diese Anwendungen nutzen das leicht zu manipulierende Genom und das breite Host-Sortiment von VACV als hervorragende Plattform, um rekombinante Viren mit einer Vielzahl von therapeutischen Anwendungen zu erzeugen. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um rekombinante VACV zu erzeugen, einschließlich Markerauswahlmethoden und transient dominante Selektion. Hier stellen wir eine Verfeinerung einer Hostrange-Auswahlmethode in Verbindung mit der visuellen Identifizierung rekombinanter Viren vor. Unsere Methode nutzt den selektiven Druck, der von der antiviralen Proteinkinase R (PKR) des Wirts erzeugt wird, gekoppelt mit einem fluoreszierenden Fusionsgen, das mCherry-tagged E3L, einen von zwei VACV PKR-Antagonisten, exzessiiert. Die Kassette, einschließlich des Gens von Interesse und der mCherry-E3L Fusion, wird von Sequenzen flankiert, die aus dem VACV-Genom abgeleitet sind. Zwischen dem Gen von Interesse und mCherry-E3L ist eine kleinere Region, die identisch mit den ersten 150 Nukleotiden des 3' Arms ist, um homologe Rekombination und Verlust des mCherry-E3L-Gens nach der Selektion zu fördern. Wir zeigen, dass diese Methode eine effiziente, nahtlose Erzeugung von rVACV in einer Vielzahl von Zelltypen ermöglicht, ohne dass eine Arzneimittelauswahl oder ein umfangreiches Screening auf mutierte Viren erforderlich ist.

Einleitung

Das Vaccinia-Virus (VACV) war entscheidend für die erste erfolgreiche Tilgung eines menschlichen Erregers, des Variolavirus (VARV), aus der Natur. Seit der Ausrottung des Variola-Virus sind Poxviren einschließlich VACV weiterhin nützliche therapeutische Viren für die Human- und Tiermedizin. Beispielsweise hat ein VACV-basierter Tollwutvirus-Impfstoff die Übertragung von sylvatischer Tollwut in Europa¹ und den Vereinigten Staaten sehr wirksam verhindert². In jüngerer Zeit haben rekombinante Poxviren, die eine Vielzahl von Anti-Tumor-Molekülen (z. B. einkettige Antikörper oder menschliches Erythropoietin) exzieren, ermutig....